측정 시

대한임상병리사회지

제 19 권 제

호

혈청 단백 과

측정 시

agarose

gel법 과

acetate법 과의 비 교

연세의료원 임상병리과 박 영숙， 김 태숙

The Comparison of Beckman Paragon

Agarose Gel Technique to Cellulose Acetate Technique in Serum Protein and LD H Isoenzyme Fractiona tion

Y oung Sook Pàrk, Tae Sook Kirn

Yonsei University, College 01 Medicine, Severance Hosþital

= Abstract=

Electrophoresis for protein fractionation has been a valuable seperation and quantitation technique in a clinical laboratory. A newly automated agarose electrophoresis system (Paragon@) supplied by Beckman Co. has been introduced to our hospital. We analyzed serum protein electrophoresis and LDH isoenzyme fractionation by using a conventional cellulose acetate electrophoresis system paralleling with this new agarose electrophoresis system.

And the results were as follows ;

1 . The correlations of serum electrophoresis between a conventional cellulose acetate system and a agarose gel electrophoresis system are good in the major fractionation (y = 0.72, 0.73). But, the relations of LDH a'1, a'2, and

β

2 . The correlations of LDH isoenzyme fractionations are good in LDH1 and LDH2 fractions

(y = 0.98, 0.98) but not so good in fractions of LDH3, 4,5 (y = 0.43, 0.44, 0.33).

3. The results of precisions which expressed as CV (%) are better in agarose system than cellulose acetate system.

From the above results, we confirmed that agarose system is better in the view point of resolution and sensitivity. And the Paragon system is suitable for a clinical laboratory especially in its simple procedure and reproducibility.

I .

서 론 검사실에서 널리 쓰이고 있다.

EP는 지지체로

cellulose accetate, acrylamide,

agarose를 사용한 1937년 Tiselius가 액체 지지체를 이용한

다. 전기영동의 원리는 전기장에서 하전된 입자들이

ing-boundary electrophoresis

(EP) 를 개발한 후 점 각기 다론 이동성을 갖는다는 사실에 기초하여 차 지지체， 완충액 등이 개선된

EP 법이 임상 protein을 분리한다 1)

-122-

이때 protein의 이동속도는

분자의

분자의

지 지 체 의 특성

등에 의 해 달라 진 다. 본 검 사실에 서 는

protein과

isoenzyme을 측 정 하는데 지 지 체 로서

acetate를 사용하고 있었으나

gel을 사용하 는 Beckman의

system 이 새 로 도 입 되 었 다

EP는

등을 분석 하는데 널 리 이 용되 고 있 다

gel은 protein에 대 한 affinity 가 적 고 자체의 수명도가 있어 gel을

후

sitometer로 scanning하여 좋은 결과를 얻을 수 있 다

특히

system에 서 는 최 근 개 발된

template application

방법 을 사용하므로

artifact를 피 할 수 있 다

지 지 체 로

gel을 사용할 경우 resolution과 sensitivity 가 좋다는 것은 이미 보고되고 있다 3) 본 검사실에서는

system을 사용하여

LDH

isoenzyme을 측정하는데 기존의

acetate 법과의 상관성， 정밀도를 비교 실험하였다.

11.

실험재료 및 실험방법

1 .

실험재료

Beckman 1. D . Zone normal protein serum

control로 정밀도 실험하였다. 검사를 의뢰한 10 명 의 환자검체로 상관성 실험을 하였다. 그 중 정상검 체와 비정상 검체를 각기 택하여 정밀도 실험을 하 였으며 이 때

electrophoresis의 경 우 검체는 buffer로

희석하여 사용하였다(단

agarose

gel 을 사용한 경 우)

2.

시약 및 기구

1 ) Cellulose

acetate법

Gelman sepraphore III, Helena trisbarbital- sodium barbital buffer (pH 8.6 - 9.0) , super z applicator (twin wire applicator), sepra clear II

(40% aqueous N-methyl, pyrrolidone), 5 % acetic acid. Helena ponceau S, LD vis isoenzyme reagent (Helena)

2) Agarose

gel법

Paragon SPE Kit (SPE gel, barbital buffer pH 8.6, Blue stain, template, template blotter, gel

blotter), glacial acetic acid, methanol, paragon LDH isoenzyme Kit (LD gel, barbital buffer pH 8.2, LD substrate containing Lithium L- Lactate, NAD, NBT, PMS), template, tem- plate blotter, gel blotter, press dryer assem- bly, drying blotter)

3.

실험방법

1 ) Cellulose

acetate법

Cellulose acetate

strip을

에 서 prewetting시 켜

분 후 과도한 수분을 제 거 하 고

applicator로 검 체 를 apply 한다

18분간 전기영동 후

염색시약에서 5 분 간 염색 후

용액으로 탈색한다.

sepra clear II

용액 에

분간 담꾀

위 에 부착 시킨 후

oven에서 말려서 densitometer로

scanning

한다.

LD H isoenzyme

경우에는 위와 같은 방법으로

350V

20분간 전 기 영 동 후

strip을

slide

위 에 부 착시 킨 뒤

를 까하여 다시 strip을 덮고 slide를 덮어 빛을 차단 시 킨 뒤

chamber에 넣 어

에서 말색시켜 densitometer로 600mm에서

한다.

2) Agarose

gel법

Agarose

gel을

blotter로 blotting한 후

template application

한다

Template의 slot에 apply한 sample 이

분 동안

되 게 한 후

template

blotter로 과도한 혈 청 을 blot한 후

volt에서 25분간 전기 영동한다. Gel을

용액에 3 분 담군 뒤 dryer에서 완전히 말린 뒤

stain"하여

용액 으로 탈색 하고 다시

하여

한다 LDH

경우엔

sample apply

후

volt에 서 20분간 전 기 영 동 후

incubation

box에

substrate로 포화시 킨

blotter를

위 에 덮 어

30분간

한 다. Gel을

용액에

분간 담근 뒤

press

dry하고 dryer에서 말린 뒤 scan한다.

111.

실험결과 및 고찰

Serum protein electrophoresis (SPE)

경 우 두 방

법의 상관성 실험결과는

1 과 같았다.

electrophoresis경 우 두 방법 의 상관성

실험결과는

2 와 같았다.

경우 주요 분

Table 1. Correlation between Beckman paragon(agarose gel) and cellulose acetate for SPE.

Gamma (Mg/dL) Beckman n

짜 -빼

맨

-B a -

앙

- pu

Alpha 2 (mg/dL) -

Cellulose Beckman Alpha 1 (mg/dL)

Cellulose Beckman Albumin (mg/dL)

Cellulose Beckman

Cellulose I

2 3 4 5 6 7 8 9

0.77 1.52 1.63 1.85 1.87 1.49 0.99 1.19 0.82 l.51

l.96 l.37 l.89 1.81 l.69 l.23 l.42 0.89 0.56

0.69 0.66 0.83 0.83 0.62 0.63 0.68 0.61 Cellulose

0.57 0.66 l.51 0.73 0.66 0.82 0.97 0.79 0.73 0.69

0.98 l.11 l.08 1.26 1.07 0.86 0.88 0.93 0.31

0.34 0.67 0.74 0.71 0.52 0.70 0.59 0.51 0.34

0.36 0.36 0.35 0.38 0.24 0.25 0.23 0.24 0.15

0.17 0.21 0.23 0.35 0.21 0.37 0.24 0.16 2.62

2.70 3.37 3.70 2.74 4.20 3.45 4.29 3.62 3.56

3.28 3.34 4.20 3.36 4.35 2.93 4.26 3.91 No.

r = 0.72 r= -0.48 r=0.59 r= -0.11 r=0.73 Albumin y=0.88x+0.16

Alpha 1 y= -0.13x+0.36 Alpha 2 y = 0.62x + 0.63 Beta y= -0.04x-0.71 Gamma y = 0.99x + 0.02

acetate for LDH No. LDH 1 (IU/L) LDH 2 (IU/L) LDH 3 (IU/L) LDH 4 (IUfL) LDH 5 (IU/L)

Cellulose Beckman Cellulose Beckman Cellulose Beckman Cellulose Beckman Cellulose Beckman

34 27 50 58 27 20 10 11 7 11

2 126 146 94 95 40 24 13 15 25 16

3 255 294 195 181 72 28 14 18 18 34

4 123 86 92 72 26 33 7 19 10 47

5 79 112 61 67 41 15 15 8 18 12

6 49 43 49 43 30 28 7 12 8 14

7 63 41 73 69 42 39 13 23 16 34

8 39 35 40 39 22 20 7 8 4 10

9 144 145 76 89 29 14 8 8 12 8

10 115 115 108 99 56 43 18 20 16 37

11 49 45 66 40 25 5 9 5 9

12 40 35 70 68 33 27 6 13 6 13

13 263 300 263 300 72 32 14 13 11 13

14 41 30 41 30 37 24 11 19 11 19

Correlation between Beckman paragon(agarose gel) and cellulose Table 2

LDH 1 Y = 1.18x - 16.26 r = 0.98 LDH 2 y=1.08x-5.49 r=0.98 LDH 3 y=0.23x+ 17.44 r=0.43 LDH 4 y=0.55x+8.14 r=0.44 LDH 5 y=0.70+ 11.41 r=0.33

이 정확하고 resolution 이 좋기 때문에 minor fraction 인

의 분리가 훨씬 예 민하게 나타남을 알 수 있다. 또한 agarose gel plate상의 성상에서도 각 band간의 분리가 명확하였 다 (Fig.

N ormal protein EP

control을 사용하여 두 방법 에 대한 정밀도 실험을 한 결과는

4 와 같다. Agarose gel을 사용한 경우 전 분획에서

acetate법에서 보다 좋은

_{cv값을 얻}

획 인

y-globulin의 상관성은 높으나

β-globulin의 상관성이 적은 것으로 미루어

gel 법의 경우 분획의 sensitivity가 증가하

여 minor fraction에 보다 많은 영 향을 미 친 다고 생

각할 수 있 다.

경 우도

fraction인 LDH

은 좋으나

fraction의 상관성 이 적 게 나타났다

특히

경우 Fig.

에서 보는 바와 같이

Densitogram에 서

_acetate법 보 다

‘

- .J..

Pa "t ~ent. d

T 흔.s: t:

Pa': l.:-t',1:. d

T t?드':

‘」「l?」ξ) -잉

/ ’

--4

4--b 4-

”니

T{

F!''''

글 =τ

’그 n

I r\ 서

LL‘

￡

LD’ 3

L[:i 츄

LD 5

딩 .8 。

LD1 ^’LD2

:1.딩딩

Total IU/L

0. 쉰 i

L[;'1/LD‘.-.

:L 띤딩

T ct.:: 1

工꾀 /L

B : Cellulose acetate method

Fig. 1 .Comparison of LDH isoenzyme densitogram between cellulose acetate and agarose gel method

A : Agarose gel method

리

띠

l

n

빼

• p

히

띠

m ,

때

a

p.

----.--...._- ...

-

--- --

-‘ ---

. ‘ -

10

@ Fig. 2. LDH isoenzyme electrophoretic patterns obtained by agarose gel electrophoresis

m 냉

9 8

4 5 6 7

BECKM'AN 3

2

@

9

4 5 6 7 8

BECKMAN

3 2

agarose gel

방법 의 정 밀도가 높았다. 이 상의 실험 결과로 미루어

gel을 지지체로 사용할 경우 resolution 이 좋고 재현성이 좋은 결과를 얻을 수 있 다고 할 수 있다 4) 특히

system은 각 각 의 chemistry 마 다

의 구 성 성 분 과

Table 5. Within-run precision (cellulose acetate, SPE, normal patient serum)

였다. 한편 정상과 비정상인 경우의 환자검체를 각 기

명씩 택하여 정밀도를 실험하여

의 결 과를 얻 었 다

gel을 사용한 결 과는

과 같다

경 우 두 방 법 중

방법의 정밀도가 높았으며，

isoenzyme에 대해서도 두 방법간의 정밀도 실험한 결 과

N o. AlbuminAlpha 1 Alpha 2 Beta 2 Gamma 1.58 1.50 1.62 1.61 1.67 1.69 1. 75 1.82 1.68 1.71 1.90 1.93 0.61 0.64 0.69 0.77 0.62 0.72 0.69 0.57 0.70 0.66 0.86 0.88 0.42

0.56 0.48 0.46 0.45 0.48 0.43 0.35 0.43 0.41 0.50 0.50 0.20 0.27 0.23 0.22 0.18 0.31 0.18 0.19 0.21 0.19 0.19 0.21 4.08

3.92 3.88 3.83 3.98 3.70 3.85 3.97 3.88 3.94 3.44 3.38 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m n u

Table 3. Within-run precision (cellulose acetate, SPE, normal control serum)

N o. AlbuminAlpha 1 Alpha 2 Beta 2 Gamma 0.95 0.95 0.76 1.01 1.12 1.09 0.84 0.87 1.01 1.06 0.58

0.58 0.53 0.60 0.65 0.57 0.49 0.51 0.48 0.53 0.47 0.47 0.51 0.54 0.46 0.41 0.49 0.48 0.48 0.45 0.18 0.18 0.16 0.21 0.16 0.15 0.16 0.15 0.12 0.14 3.92

3.92 4.14 3.73 3.71 3.87 4.11 4.09 4.01 3.93

1i

nι

qu

A시1 ζ니 ζU

7l n6

9

10 1.71

0.13 7.50 0.70 0.10 13.61 0.45

0.06 12.81 0.21

0.04 18.23 3.82

0.21 5.58

-x m α

‘‘

0.97 % 0.12 11.95 0.55

0.05 9.65 0.48 0.03 7.13 0.16 0.02 15.34 3.94

0.15 3.77

-x m

쨌

Table 6. Within-run precision (cellulose acetate, SPE, abnormal patient serum) Table 4. Within-run precision (agarose gel,

SPE, normal control serum)

N o. AlbuminAlpha 1 Alpha 2 Beta 2 Gamma 5.22 4.86 5.08 5.35 4.82 5.34 5.00 4.98 5.23 5.15 4.94 0.58 0.58 0.55 0.50 0.49 0.57 0.62 0.53 0.51 0.54 0.73 0.60

0.72 0.63 0.70 0.63 0.53 0.61 0.56 0.62 0.58 0.72 0.19 0.21 0.15 0.20 0.29 0.21 0.19 0.21 0.25 0.36 0.29 3.22

3.44 3.40 3.07 3.57 3.16 3.39 3.52 3.20 3.17 3.12 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m n

No. AlbuminAlpha 1Alpha 2 Beta 2 Gamma 1.00 1.07 0.89 1.02 0.93 1.13 1.00 1.00 0.98 0.85 0.49

0.53 0.45 0.45 0.48 0.52 0.48 0.48 0.50 0.47 0.82

0.84 0.78 0.85 0.85 0.81 0.84 0.84 0.84 0.81 0.18 0.15 0.15 0.20 0.20 0.19 0.21 0.21 0.20 0.16 3.61

3.50 3.83 3.58 3.64 3.46 3.54 3.57 3.59 3.81 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m

5.09 0.18 3.62 0.56 0.07 11.99 0.63

0.06 9.54 0.23 0.06 25.94 3.30

0.17 5.23

-x m

U f

% 0.99

0.08 8.43 0.49

0.03 5.42 0.83

0.02 2.71 0.18 0.02 10.86 3.61

0.12 3.35

-x m

w

‘‘

%

-126-

3)

appraise 의 특 성 은 수 있도록 되 어 있으며

table

13과 같다

Table 9. Within-run precision (cellulose acetate^, LDH isoenzyme, normal patient serum)

system 이 독특-하으로 분 2] 능이 좋다.

또 한

은

측 정 에 서 Linearity 가 광범위하여 낮은 농도의 겸체에 대해서 도 예민하게 측정된다. 각 실험에 사용한

densitometer는

standard 가 있 어 서 densitometer의

^{상태 를}

할

LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5

5 9 U

긴

8

m

3 7 6 4

”b

QU

q나 껴i

”i QU

A4i

”b

”I

꺼t

No.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

m

Table 7. Within-run precision (agarose gel^, SPE, normal normal serum) No. AlbuminAlpha 1Alpha 2 Beta 2 Gamma

8.70 5.29 60.80 6.30

1.64 25.97 19.30

4.06 2^1.01 35.70

3.71 10.40 30.20

2.86 9.46

-x m α

‘‘

% 2.01

1.95 2.01

1.96

1.96

1.97

1.97

1.89

1.96 2.01 2.01

Table 10. Within-run precision (cellulose acetate, LDH isoenzyme, abnormal patient serum)

1.97 0.04

1.95 0.63

0.01

1. 79 0.71

0.02 2.12 0.27

0.02 7.80 3.33 0.05

1.40

-x m

U 5

%

LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5 301 312 281 312 361 381 304 306 264 271 103

80 88 107 75 86 78 107 113 116

%

nm

띠갱 따냈 대ω Xω 딘 닮 띠ω 때

끼J

AA1

A41

qJ

1i j4 1i

po

”o pn

ζU

CU

”I FD

A*

9J

?l A*

껴l

CU

얘 앙

%

”%

낌 m삶

mJ

%

%

n

No.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

m

Table 8. Within-run precision (agarose gel, SPE, abnormal patient serum)

4.54 4.81 4.70 4.47 4.54 4.75 4.63 4.63 4.53 4.56 4.65 0.60

0.50 0.62 0.56 0.60 0.51 0.56 0.45 0.54 0.56 0.59 0.39

0.35 0.36 0.37 0.39 0.30 0.27 0.32 0.28 0.32 0.32 3.11

3.01 3.03 3.26 3.11 3.37 3.23 3.42 3.37 3.27 3.14

No. AlbuminAlpha 1 Alpha 2 Beta 2 Gamma

1.17

1.12

1.10

1.15

1.17 0.96

1.11

1i

?ι

qJ

j4 Fhu

pU

”i

n

mm

πω mω 껑 이 μ 낌 야ω 껑

mu 14

Gu

nU

1i i4

1i nxu

oι

Ru

ng j4

qJ

j4

qu

qJ

qu

nJ

qtu

qJ

qJ

이 M m깅 m애 Mω mω %ω

”_M

m애 와 ”이

0.64 0.64 0.62 0.62 0.62 0.64 0.62 0.65 0.63 0.64 0.64 0.73

0.70 0.71 0.69 0.71 0.68 ^‘ 0.69 0.72 0.71 0.72 0.73 0.28

0.23 0.23 0.28 0.27 0.27 0.28 0.28 0.28 0.29 0.28 3.25

3.36 3.33 3.35 3.34 3.34 3.38 3.37 3.32 3.24 3.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

m n

309.3 36.90 11.93 95.3

15.49 16.25 53.5

7.47 13.97 58.8

14.5 24.66 53

11.93 22.51

-x m

0.98 %

1.08

1.09

1.11

8 9

m n

4.62 0.10 2.22 0.55

0.05 9.18

1.09 0.07 6.26 0.33 0.04 12.47 3.21

0.14 4.39

-x m α

‘‘

%

Table 12. Within-run precision(agarose gel, LDH isoenzyme, abnormal patient serum) Table 11. Within-run precision(agarose gel, LDH

isoenzyme, normal oatient serum)

LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5 410 400 412 407 409 422 429 401 412 438

mω mι

%

η

mω

%

없

%m

w

던

m깅 앓 이 U 이 U

E

M 깅 %ω mω

E

Mm

πω ”이 싫 %냉 야에 Mω m깅 야ω 싫 %ω

%ω m 깅 %ω %ω Mμ

%“

%ω %ω %ω mω

No.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

m

1 2 3 4 5 6 7 8 9

m

LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5

n m m m

9 9 9 9

m

8

7·7·GU

CU

다u

7l Ru

”o

PO

7·

πω πω πω πω

M

πω mω πω

”m

n

염 껑

쩌 μ%

섭 mω μ 입

%섭 깨 낀 %ω %ω 낀 %ω %ω m정 잃

No.

414 12.1

2.92 67.9

5.20 7.65 29.6

2.46 8.30 33.1

3.00 9.06 25.3

2.79 11.03

-x m

U 5

% 9.5

0.85 8.94 6.3

0.67 10.71 15.3

0.82 5.36 42.7

1.42 3.31 26.5

1.65 6.22

-x m

U

‘‘

%

굉 -13

APPRAISE

DensitoMεter

Cheζk

F.:e

l'~

6:3.3

ε‘ ε.1

7.S 1.6 13.5 Fraction

i 3 4 s

F.:e 1. ÀbSOt-bance

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Fig. 3. Calibration check of Appraise Densitometer

Chem., 27: 1944-1945(1981).

4 . Hicks, E.J. and Hughes, B.J., Chem., 21, 1072(1975).

5 .

김진규외

명，

자동화학 분석기의 평가， 대한임상병리와 정도관리학회，

Clin.

-128- Chemistry

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