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서 론
다양한 면역억제제의 개발에도 불구하고, 이식 장기에 대한 면역반응 및 거부반응은 이식 성공의 가장 큰 저해요 인이며, 항체매개성 거부반응은 세포성 거부반응에 비해 매우 치명적이고 예후가 불량하다. 공여자 특이 HLA IgG (donor-specific, anti-HLA IgG, DS-HLA) 항체는 검출되는 항 체량에 관계없이 항체매개성 거부반응의 위험인자로 알려 져 있으며, 신 이식 환자에서 검출되는 HLA 항체는 공여자 특이항체일 경우 거부반응의 위험이 증가한다고 보고되어 있다.(1,2) 따라서 DS-HLA 항체의 검출은 이식의 성공을 위 한 이식 사전 검사뿐 아니라 이식 후 거부반응 예측 지표로 서의 매우 중요하다.(3-6)
공여자의 HLA 항원에 대한 감작 여부를 검사하는 방법 으로는 수여자 혈청에서 특정 공여자의 림프구에 대한 항 체를 검출하는 교차시험과, HLA 항원을 이용하여 HLA 동 종항체를 검사하는 panel reactive antibody (PRA) 검사가 있 다. 따라서 DS-HLA 항체 검출을 위해서는 다양한 항원패 널을 이용하여 특정 HLA 항체를 동정하거나,(3,4) 공여자 항원에 대한 교차시험 결과와 HLA 항원을 이용한 PRA 검 사 결과를 종합하여 판정하여야 한다.
본 연구에서 비교하고자 하는 antibody monitoring system (AMS)은 공여자의 림프구에서 추출한 HLA 당단백 항원을 수여자의 혈청과 반응시켜 DS-HLA 항체를 검출하는 방법 으로서, microplate에 class I과 class II 항체에 대한 단클론 항체가 부착되어 있으므로 혈청 내의 DS-HLA 항체만 특이 적으로 검출하는 새로운 교차시험 방법이다(Fig. 1). 이에 책임저자：양철우, 서울시 서초구 반포동 505
가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원 내과, 137-040 Tel: 02-590-2527, Fax: 02-535-0323
E-mail: yangch@catholic.ac.kr
본 연구는 2005년 대한이식학회 학술연구비의 지원으로 이루어 졌음.
Detection of Donor Specific Anti-HLA Anti- bodies Using Antibody Monitoring System
Eun-Jee Oh, M.D., Yeon-Joon Park, M.D., Jin Young Kim, M.D.1, Chul Woo Yang, M.D.1, Dong-Goo Kim, M.D.2 and In Sung Moon, M.D.2
Departments of Laboratory Medicine, 1Internal Medicine and
2Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea
Purpose: The antibody monitoring system (AMS, GTI Inc.) is a solid phase ELISA crossmatch test for the detection of IgG antibody to the donor-specific solubilized HLA class I and class II antigens. The objective of this study was to compare the results of AMS assay with donor specific anti- HLA IgG antibodies (DS-HLA Abs), as determined by ELISA- PRA and flowcytometric crossmatch test (FCXM). Methods:
A total of 132 sera were tested for the presence of DS-HLA Abs by ELISA-EIA, FCXM and AMS assay. Results: DS- HLA Abs were determined in 41 serum samples by an ELISA-PRA panel and FCXM. There was a significant degree of concordance (84.8%) between the results from the FCXM and AMS (P＜0.001). The sensitivity, specificity, the positive predictive value and the negative predictive value of AMS assay to detect DS-HLA Abs was 90.2%, 93.4%, 86.0%, 95.5%, respectively. The AMS is a simple, objective test and it has several advantages over the cell-based crossmatch test such as elimination of non-HLA antibody reactivity, elimination of the non-donor specific antibody reactivity, no need for viable cells, and the donor’s HLA an- tigens can be prepared in advance. Conclusion: This study suggests that AMS may be useful as a supportive cross- match test or as a monitoring test after transplantation
for detecting class I and/or class II DS-HLA Abs. (J Korean Soc Transplant 2006;20:63-68)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Transplantation, Donor-specific HLA antibody,
Panel reactive antibody (PRA), Flowcytometric crossmatch, Antibody monitoring system (AMS) 중심 단어: 이식, 공여자 특이 HLA 항체, Panel reactive
antibody (PRA), 유세포분석 교차시험, Anti- body monitoring system (AMS)
Antibody Monitoring System을 이용한 공여자 특이 HLA 항체 검출
가톨릭대학교 의과대학 진단검사의학교실, 1내과학교실, 2외과학교실
오은지․박연준․김진영1․양철우1․김동구2․문인성2
저자들은 장기 이식을 위한 사전 검사로서 유세포분석기를 이용한 교차시험(FCXM)과 HLA 항원이 부착된 ELISA 방 법의 PRA (ELISA-PRA) 동정검사를 모두 시행하여 DS-HLA 항체의 유무 판정이 가능하였던 132예를 대상으로, AMS을 이용하여 class I과 class II DS-HLA 항체를 검출하고, AMS 방법의 임상적 유용성을 평가하였다.
방 법
1) 유세포분석기를 이용한 교차시험(flowcytometric crossmatch, FCXM)
2×106/mL로 조정한 공여자 림프구액 100μL에 수여자의 혈청 50μL를 실온에서 30분간 반응시키고, 2회 세척 후 항 글로불린 1：10 희석액(FITC-F(ab')2 anti-human IgG, DAKO Japan Co.) 20μL와 PE-labeled anti-CD3 or anti-CD19 (DAKO) 10μL를 각각 T 세포와 B 세포 교차시험을 위해 넣고 30분 간 암실에서 반응시켰다. 3회 세척 후 PBS 1 mL를 넣어 세 포 부유액을 만들고 유세포분석기(Coulter Epics XL Co., Miami, FL, USA)를 이용하여 형광반응 양상을 비교하였다.
음성대조군에 비해 mean channel displacement가 T 세포의 경우 5, B 세포의 경우 10 이상일 때 또는 양성세포가 10%
이상인 경우를 양성으로 판독하였다.
2) ELISA-PRA
선별검사로서 LATM 10×5 (Lambda Antigen Tray Class I and II Mixed)(LAT, One Lambda Inc., CA, USA)를 이용하 였으며, 제조회사의 지침에 따라 ELISA 검사를 시행하였 다. 실온화시킨 ELISA tray에 1：2 희석된 혈청 10μL를 분 주하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척액으로 2회 세척하 였다. 희석된 enzyme- conjugated 용액 10μL를 넣고 실온 40
분, 효소 기질액 10μL를 넣고 37oC, 10∼15분간 반응 후 반 응 정지액을 넣고 1시간 이내에 Microplate Reader EL ×800 (Biotek Instruments Inc., Highland Park, Winooski, Vermont, USA)에 넣고 판독하였다. 음성 blank 흡광도를 보정한 평균 양성대조 혈청 흡광도에 0.2를 곱한 값을 cutoff로 하여 grade 4 이상으로 정하고, 환자 혈청의 평균 흡광도가 cutoff 이상인 경우 PRA 양성으로 판정하였다. PRA 양성인 검체 는 LAT1240 (Lambda Antigen Tray Class I and II)을 이용하 여 HLA 항체를 동정하였다.
3) FCXM와 ELISA-PRA 검사결과를 이용한 DS-HLA 항체 판정
ELISA-PRA를 이용한 항체 동정검사에서 DS-HLA 항체 가 동정된 경우에는 FCXM 결과와 무관하게 DS-HLA 항체 로 판정하였다. FCXM 양성이고 ELISA-PRA 동정검사에서 HLA 항체 특이성이 동정되지 않은 경우에는, 공여자와 동 일한 HLA 항원이 포함된 ELISA-PRA well이 모두 양성 반 응을 보이는 경우 DS-HLA 항체로 판정하였다. FCXM 양 성, ELISA-PRA 음성인 예는 DS-HLA 항체 음성으로 판정 하였다.(3-5)
4) Antibody Monitoring System (AMS)을 이용한 DS- HLA 항체 검출
AMS kit (GTI, WI, USA)를 이용하였으며 모든 검사는 제 조사의 지침대로 시행하였다. Non-ionic detergent를 포함한 lysate buffer를 이용하여 공여자의 림프구로부터 polymor- phic membrane glycoprotein인 HLA 항원이 포함된 수용성 당단백을 추출하고, 추출된 당단백을 HLA class I과 class II 항체에 대한 단클론 항체가 부착되어 있는 microplate에서 반응시켰다. HLA 단클론 항체와 결합하지 않은 non-HLA 당단백을 세척하여 제거하고, 여기에 수여자의 혈청을 가 한 후 효소면역법으로 DS-HLA 항체를 검출하였다(Fig. 1).
수여자 혈청은 FCXM와 PRA 동정검사를 시행하고 남은 잔 여 혈청 검체를 AMS 검사 전까지 -80oC에 보관하였고, 검 사 직전에 해동하여 사용하였다.
(1) HLA 항원 추출: 공여자의 헤파린 처리된 전혈 20 mL 로부터 림프구를 분리하여 원심분리 후 림프구 pellet 20μL (약 3×107 lymphocyte) 정도를 얻었다. 림프구 pellet에 1：10 희석된 lymphocyte lysis buffer 200μL를 넣고 잘 섞은 후 원 심분리하여 HLA 항원이 포함된 상층액을 얻고, 50μL씩 분 주하여 검사시행 전까지 -80oC에 보관하였다.
(2) AMS를 이용한 DS-HLA 항체의 검출: 냉동 분주 보관 되었던 HLA 항원을 kit 내 포함된 buffer를 이용하여 1：8 (class I) 또는 1：4 (class II) 희석 후 50μL를 HLA class I 또는 class II 특이 단클론 항체가 부착된 microplate에 반응 시켰다. 세척 후 1：4로 희석된 수여자 혈청 50μL를 넣고 37oC에서 40분간 반응시키고, 세척 후 alkaline phosphatase Fig. 1. Detection of donor-specific HLA IgG antibodies by Anti-
body Monitoring System kit. HLA antigens are prepared from donor lymphocytes by solubilizing the cells. The lymphocyte lysates are added to microwells to which monoclonal antibodies specific for HLA class I or class II have been immobilized. The microwells containing the bound HLA antigens are tested with recipient serum. Any donor-specific HLA IgG antibodies in recipient serum are detected with a alkaline phosphatase (ALP) conjugated antihuman IgG and substrate solution.
conjugated goat affinity purified anti-human IgG 항체와 발색 액을 차례로 넣고 반응시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 음성 대조 혈청 흡광도의 2배를 cutoff로 하여 양성 을 판정하였고, 양성 대조군으로는 추출한 HLA 항원의 확 인을 위하여 수여자의 혈청 대신에 항 HLA class I or class II 당단백 항체를 넣은 lysate control과 양성대조혈청을 반응 시킨 reaction control을 포함시켰다.
5) 통계분석
SPSS (version 10.0) 통계 프로그램과 Chi-square 방법을 사 용하였고, P＜0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하 였다.
결 과
1) FCXM와 ELISA-PRA 검사를 이용한 DS-HLA 항 체 검출 결과(Table 1)
총 132예 중 DS-HLA 양성은 41예(31.1%)였으며, 이 중 31예(23.5%)는 ELISA-PRA/FCXM (+/+)였고, 10예(7.6%)는 ELISA- PRA 동정검사에서만 공여자 특이항체로 동정되어 DS-HLA 항체로 판정하였다. ELISA-PRA/FCXM (+/-) 14 예(10.6%)와 ELISA-PRA/FCXM (-/+) 4예(3.0%)는 각각 공여자 특이성과 HLA특이성이 확인되지 않아 DS-HLA 항 체 음성으로 판정하였다. FCXM의 DS-HLA 항체 검출을 위 한 예민도, 특이도, 양성예측률, 음성예측률은 각각 75.6%
(31/41), 95.6% (87/91), 88.6% (31/35), 89.7% (87/97)였다.
2) AMS 결과와 DS-HLA 항체 비교분석(Table 2) HLA class I과 class II로 분리하지 않고 양성률을 분석할 경우, AMS 양성 43예 중 DS-HLA 항체 양성은 37예, AMS 음성 89예 중 DS-HLA 항체 양성은 4예로서, DS-HLA 항체 검출을 위한 AMS의 예민도, 특이도, 양성예측률, 음성예측 률은 각각 90.2% (37/41), 93.4% (85/91), 86.0% (37/43), 95.5% (85/89)였다.
HLA class I의 경우, AMS 양성 41예 중 DS-HLA 항체 양 성은 35예로서 DS-HLA class I 항체 검출을 위한 AMS의 예민도, 특이도, 양성예측률, 음성예측률은 각각 97.2%
(35/36), 93.8% (90/96), 85.4% (35/41), 98.9% (90/91)였다.
DS-HLA class II 항체 검출을 위한 AMS의 예민도, 특이도, 양성예측률, 음성예측률은 각각 57.1% (12/21), 100% (111/
111), 100% (12/12), 92.5% (111/120)였다.
3) FCXM와 AMS 결과의 비교분석
총 132예 중 FCXM/AMS (+/+) 29예(22.0%), FCXM/
AMS (-/-) 83예(62.9%)로서, 두 검사 결과의 일치율은 84.8% (112/132)였다(χ2=51.8, P＜0.001). 두 검사 결과의 불 일치를 보인 20예의 DS-HLA 항체 분석결과, FCXM/AMS (+/-) 14예 중 7예에서, FCXM/AMS (-/+) 6예 중 2예에 서 DS-HLA 항체 양성으로 판정되었으므로, 11예는 AMS결 과와 9예는 FCXM 결과와 일치하였다(Table 3). DS-HLA 항 체 검출을 위한 예민도는 AMS가 FCXM에 비해 높았으나 Table 1. Results of DS-HLA antibodies by ELISA-PRA and
FCXM for 132 sera
ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
DS-HLA Ab ELISA-PRA FCXM N (%)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
+ + + 31 (23.5)
+ + - 0 (7.6)
- - + (3.0)
- + - 4 (10.6)
- - - 3 (55.3)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ FCXM = flowcytometric crossmatch; DS-HLA Abs = donor- specific HLA antibodies.
Table 2. Results of the AMS assay for 132 serum specimens relative to the DS-HLA Abs, DS-HLA class I Abs and DS-HLA class II Abs
ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ DS-HLA DS-HLA DS-HLA class I DS-HLA class I DS-HLA class II DS-HLA class II
Abs (-) Abs (+) Abs (-) Abs (+) Abs (-) Abs (+)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
AMS (-) 85 (64.4)* 4 (3.0) 90 (68.2) 1 (0.8) 111 (84.1) 9 (6.8)
AMS (+) 6 (4.5) 37 (28.0) 6 (4.5) 35 (26.5) 0 (0) 12 (9.1)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ AMS = antibody monitoring system; DS-HLA Abs = donor-specific HLA antibodies. *No. of cases (%).
Table 3. Comparison of FCXM and AMS assay results for 132 serum specimens
ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
AMS (-) AMS (+)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
FCXM (-) 83 (62.9)* 6 (4.5)†
FCXM (+) 14 (10.6)‡ 29 (22.0)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ FCXM = flowcytometric crossmatch; AMS = antibody monitoring system. *No. of cases (%), †Two sera were DS-HLA Abs positive and four sera were negative, ‡Seven sera were DS-HLA Abs positive and seven sera were negative.
통계적 차이는 없었다(FCXM 75.6% (31/41) vs. AMS 90.2%
(37/41), P=0.08). FCXM T cell/B cell (-/+)인 11예 중 5예에 서는 AMS class I/class II (-/-)이었다.
고 찰
이식환자에서의 DS-HLA IgG 항체 검출은 항체매개성 거부반응의 방지와 치료를 위해 매우 중요하다.(3) 1960년 대 초기부터 특정 공여자의 림프구 항원에 대한 감작 여부 를 검출하는 방법으로서 교차시험이 이용되고 있으나, 교 차시험은 CDC-cytotoxicity, CDC-AHG, FCXM 등의 검사 방 법에 따라 예민도가 다양하고, 림프구를 이용하므로 림프 구 항원에 대한 non-HLA 항체가 위양성으로 검출될 가능성 이 있다. 또한 class I, II 항체의 구별을 위해 T, B 세포로 구분하여 교차시험을 시행하고 있으나, T 세포는 class I 항 원을 B세포는 class I, II항원을 모두 표현하므로, 정확한 class I, II 항체의 구별이 어렵고, 검사실 간 검사방법의 표 준화가 어려운 단점이 있다.(3) 이에 공여자의 림프구 항원 대신 HLA 특이항원을 이용하여 유세포분석기 또는 ELISA 방법으로 HLA 항체를 검출하는 PRA 방법이 소개되어, 이 식장기 생존의 중요한 예후인자 및 이식 후 추적검사로 관 심을 받고 있다.(7-13) 그러나 PRA 검사로 항체특이성을 동 정하여 특정 공여자에 대한 항체임을 판정하기 위해서는 다양한 HLA 항원 구성과 함께 패널의 크기를 크게 구성하 여 한다. 더욱이 대부분의 PRA 검사는 단일 HLA 항원을 이용하지 않으므로 HLA 항체의 교차반응이 일어날 수 있 고,(9) 특히 PRA 양성률이 높은 환자의 경우에는 HLA 항체 의 특이성 동정이 어려우므로, 특정 공여자에 대한 항체 유 무를 알기 위해서는 교차검사결과와 종합하여 판정하여야 한다. 따라서 현재까지 임상검사실에서 이용되는 항체검출 방법 가운데 DS-HLA 항체 검출을 위한 단일 검사는 없는 실정이며, 림프구를 이용한 교차시험이 외에 HLA 항원을 이용한 solid-phase 방법의 추가적인 검사가 권장되고 있 다.(3) 또한 Gebel 등(3)은 최종 교차시험은 solid-phase assay 정도의 높은 예민도를 가진 검사를 포함할 것을 제시하였 다.
최근에는 단일항원을 이용한 PRA 동정 kit가 개발되어 소개되었는데,(14,15) panel의 크기가 크고 시약이 비싸므로 일반검사로 적용하기 어려운 단점이 있으나, 교차시험 없 이 정확한 항체동정을 위해서는 매우 유용한 방법이므로 추후 기존 검사방법과의 비교 연구가 필요할 것으로 생각 한다. 국내에서는 이식검사를 시행하는 대부분의 병원에서 CDC-cytotoxicity 검사를 시행하고 있고, FCXM와 HLA 항 원을 이용한 PRA 검사는 일부 대형병원에서만 시행하고 있으며, DS-HLA 항체의 검출에 대한 연구 보고는 없는 실 정이다.
본 연구에서는 교차시험 중 예민한 방법인 FCXM (3)와
ELISA-PRA결과를 분석하여 이식 대기환자 혈청 132예에서 DS-HLA 항체 유무를 판정하고, 새로운 교차시험 방법인 AMS로 시행한 결과와 비교하였다. 본 연구에서 사용한 ELISA-PRA 동정검사는 개별 항원 특이성(private specifici- ty)을 가진 HLA 항원을 class I과 II로 구분하여 부착시킨 40개의 well로 구성되어 있으며(class I 28 well, class II 12 well), 노 등(16)이 보고한 한국인의 HLA형별 분포결과에서 1% 이상으로 검출된 HLA 항원을 모두 포함하고 있다.
AMS kit는 공여자의 림프구에서 추출한 당단백을 class I과 class II 항체에 대한 단클론 항체가 부착된 microplate에 반응시키고 세척하여, 공여자의 HLA 항원을 microplate에 도포하고, 여기에 수여자의 혈청을 반응시켜 ELISA 방법으 로 공여자 특이 HLA IgG항체를 검출하는 교차방법이다. 상 품화된 kit를 사용하여 ELISA 방법으로 검사하므로, 세포를 이용한 기존의 교차시험에 비해 객관적이며, 검사의 표준 화 및 자동화가 가능하고 보관된 공여자 검체를 이용할 수 있는 장점이 있다.
총 132예 중 41예에서 FCXM와 ELISA-PRA 방법을 종합 판정한 DS-HLA 항체가 검출되었고, AMS 검사에서는 43예 가 양성으로 검출되어, AMS의 DS-HLA 항체 검출을 위한 예 민도, 특이도, 양성예측률, 음성예측률은 각각 90.2%, 93.4%, 86.0%, 95.5%로 우수하였다. AMS 결과를 HLA class I과 class II로 구분하여 분석한 경우, class I DS-HLA 항체 검출 을 위한 AMS의 예민도와 특이도는 97.2%와 93.8%로 우수 하였으나, class II DS-HLA 항체 검출의 경우, 특이도는 100%로 우수한 반면에 예민도는 57.1%로 낮게 측정되었다.
이는 공여자 림프구로부터 분리한 class II 항원양의 차이 등에 의한 AMS 검사의 위음성 가능성이 있으나, FCXM 양 성이면서 높은 ELISA-PRA%를 보이는 예에서 DS-HLA 항 체 양성으로 잘못 판정하였을 가능성도 배제할 수 없다.
AMS는 공여자로부터 추출한 HLA 항원과 수여자의 혈청 을 이용한 solid-phase 교차시험이므로, 양성결과를 보인 검 체의 항체 특이성 동정은 불가능하다. 따라서 불일치를 보 이는 검체는 추후 임상적인 경과 관찰과 함께 단일항원을 이용한 항체동정검사와 추적검사가 필요할 것으로 생각한 다.
AMS 결과와 FCXM 결과의 비교 분석에서는 두 검사 결 과 간에 84.8%의 일치를 보였고, 두 검사의 DS-HLA 항체 검출을 위한 검출률은 통계적 차이가 없었다. 이식 전 시행 하는 교차시험 중 예민한 방법인 FCXM의 임상적용 및 예 후인자로서의 분석은 보고자에 따라 다양한데, 본 연구에 서 132예를 대상으로 FCXM와 ELISA-PRA 방법을 통하여 DS-HLA 항체를 분석한 결과, FCXM 양성은 35예였으며 위 양성이 4예, 위음성이 10예로 검출되었고, 예민도는 75.6%
로 다소 낮았다(Table 1).
FCXM 위양성 4예는 모두 AMS 음성이었고, 위음성 10예 중 8예에서 AMS 양성으로 검출되었는데, 이러한 차이는
검출방법에 따른 민감도 차이와 FCXM에서 검출될 수 있는 non-HLA 항체에 기인하는 것으로 생각된다. ELISA-PRA 음성, FCXM 양성인 경우, ELISA-PRA 검사에 포함되지 않 은 낮은 빈도의 HLA 항원에 대한 항체일 경우 ELISA-PRA 검사의 위음성 가능성도 있으므로, 교차시험 결과의 해석 및 공여자의 HLA 항원에 대한 감작 여부 판단 시 AMS 등 의 추가검사를 시행한다면, 공여자 특이 HLA 항체 유무에 대한 종합적인 판정에 많은 도움이 될 것으로 생각한다. 또 한 FCXM T cell/B cell (-/+)인 경우 45% (5/11)에서 AMS class I/II (-/-)였는데, B cell 교차시험 양성은 HLA 항체에 기인하지 않고 이식 생존율이나 이식실패와 관련이 없다는 보고가 있으므로,(13,17) 향후 표본의 수를 늘려 임상양상과 함께 재분석해 볼 필요가 있다.
이식의 사전 검사와 더불어 이식 후 거부반응의 조기진 단은 임상적인 치료방향을 결정하고 이식의 성공률 증가를 위해 매우 중요하나,(18-20) 국내에서 이식 환자의 면역반 응 추적검사는 보편화되어 있지 않다. 더욱이 공여자 특이 항체 검출을 위한 교차시험의 경우, 공여자 혈액의 반복채 취가 필요하므로 이식 후 장기간의 추적검사로서는 이용되 기 어려운 단점이 있다. 본 연구에서 사용한 AMS 방법은 DS-HLA 항체를 측정한다는 장점 외에, 공여자의 림프구에 서 당단백 항원을 추출 후 냉동보관이 가능한 장점이 있다.
따라서 공여자 혈액의 반복채취 없이 재검 및 추가 검사가 가능하므로, 이식 후 항체매개성 거부반응의 조기 검출을 위한 추적검사로 매우 유용하리라 생각한다. 냉동보관하는 당단백은 HLA 당단백 항원 이외에 림프구에서 추출된 당 단백을 포함하며, microplate에 부착된 항 HLA class I or class II 단클론항체는 HLA class I or class II public 항원에 대한 항체이므로, HLA 항원이 제대로 추출되었는지를 ly- sate control로 반드시 확인하여야 한다. 본 연구에서 132예 의 AMS 검사를 시행한 결과 lysate control이 모두 적절한 결과를 보였으므로, 일반 검사실에서도 항원추출 및 이용 에 어려움이 없을 것으로 생각한다.
결론적으로 AMS를 이용한 교차시험은 class I과 class II 를 구분하여 DS-HLA 항체를 검출할 수 있으므로, 이식 전 교차시험의 보조적 진단과 이식 후 거부반응 조기 검출을 위한 추적검사로 유용할 것이다. 또한 추후 이식 후의 임상 적 경과와 비교 연구를 통한 AMS검사의 효율적 적용은 이 식의 성공률 증대에 많은 도움이 될 것으로 생각한다.
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