The Blood-Brain Barrier Permeability and Pharmacokinetics of Nitrone Based Spin Trapping Agent, α-Phenyl-n-tert-Butyl Nitrone (PBN) in Rats

약학회지제

46

권제

2

호

124~128 (2002) **■"■*

Yakhak Hoeji Vol. 46, No. 2

-粮學 • 출 확

횐쥐에서 nitrone ^{계 항산화제인} a-phenyl-/?_te/t-butyl nitrone(PBN) ^의

뇌 투고성 및 체내동태 ~

이나영

•

^강영숙

#

숙명여자대학교 약학대학

(Received January 21, 2002; Revised February 20, 2002)

The Blood-Brain Barrier Permeability and Pharmacokinetics of Nitrone Based Spin Trapping Agent, a-Phenyl-w-fe^-Butyl Nitrone (PBN) in Rats

Na-Young Lee and Young-Sook Kang#

College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, Seoul 140-742’ Korea

Abstract — The nitxone-based free radical trapping reagent, a-phenyl-w-fe

作

-butyl nitrone (PBN) has been proposed as therapeutic agent for stroke. We used this for model drug of development of new drug for neuroprotection. The purpose of this study was to evaluate the blood-brain barrier (BBB) permeability of PBN in Sprague-Dawly (SD) rats. The BBB transport of PBN was investigated in SD rats using internal carotid artery perfusion (ICAP) method at a rate of 4 m //min for 15 second. We also obtained pharmacokinetic parameters of PBN using single intravenous injection technique. When we estimated BBB permeability of PBN with ICAP method, the brain volume of distribution of PBN was 60.0

土

12.0 (ig//.

The brain uptake of PBN after IV injection at 120 min was 0.15

土

0.01%ID/g. The PBN was transported to the brain through the BBB well in rats, because PBN is small molecule (MW 177) and lipid-soluble (log P 1.23) compound.

Keywords □ a-phenyl-w-tert-butyl nitrone (PBN), blood-brain barrier (BBB) permeability

In

야

Vo

에서허혈에 의해유도된

free radical

이세포손상을일 으킨다는사실은이미여러논문에서밝혀져 있다^{. 15}그러므로이 러한산화적스트레스를 억제하는물질은허혈에의해유도된뇌 졸중의 치료에효과를나타낼 것으로기대되어진다

. cx-phenyl-

«-tert-butyl nitrone(PBN)

은

nitrone-based spin trapping agent

의하나로써

free radical

과결합하여상대적으로안정한부산물 을 형성하는

radical scavenger

로 작용한다

.2)

실제로

PBN

이

global ischemia

동물모델에서 뇌손상을 억제시키는 결과를나 타낸다는것이보고되어 있고3〉흰쥐의

focal ischemia

모델에서 도 역시뇌신경 손상을보호하는 작용을나타낸다는것이보고 되었다

.4'5)

또한

free radical

에의해유발되는 질환인 간질，노화

등을 억제하는효과가있다는것이보고되어 있다

.6’7)

그러나약물이뇌혈관이나뇌세포내에작용하기 위해서는 혈 액•뇌관문을통과하여야하는데실제로

PBN

의혈액뇌관문의 투 과성을정확히 평가한 연구보고는 거의 찾아보기 어렵다

•

그래

#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-710-9562 (팩스) 02-715-9498 (E-mail) yskang@sdic.sookmyung.ac.kr

서본 연구에서는뇌신경 손상을보호하는물질의 개발을위하 여우선

PBN

을모델물질로사용하여

PBN

의뇌투과성을내 경동맥 관류법

(internal carotid artery perfusion method, ICAP

법)과정맥투여법

(/w vivo intravenous injection technique)

을이 용하여실험하고혈액중의약물량과뇌투과량을

' high performance liquid chromatography(HPLC

)법으로 정량하여 검토하였다

.

실 험 방 법

시약및기기

a-Phenyl-w-tert-b\ity\ nitrone (Fig. 1)

은

Aldrich Chemical Co.에서 구입하여 시용하였다. 생리식염수와 헤파린은 중외제약 제품을，마취제로 사용한 염산 ketamine은 유한양행 제품을，근 이완제인 xylazine은 Sigma에서 각각 구입하여 사용하였다.

O- C H ,

I

C H = N --- C H 3

c h

³

Fig. 1 - Chemical structure of PBN used in the present study.

124

흰쥐에서 nitrone 계 힘신:화제인 a-phenyl-w-te?f-butyl nitrone(PBN) 의 뇌 투과성 및 체내동태 125

Acetonitrile

은

HPLC

용으로덕산이화학

(

주

)

에서구입하였다

.

기 타시약은일급이상의 제품을덕산이화학

(

주)에서 구입하여사 용하였다

.

실험에시용한기기는원심분리기 (한일과학산업

(

주)，

Union 55R, Micro 17TR), Infusion/withdrawl pump(KD Scientific, model 210), thermal blanket (temperature control unit, Letica, HB10 1/2), bipolar coagulator (Union Medical Co., Surgitor UM 880-A),

단두기

(

대종기기

), pH meter (Mettler, delta 340)，balance (Sartorius, AC2115), freeze dryer system (LABCONCO 7522900

)，수술 기구 등이다

.

한편

Sprague-

Dawley (SD

)계웅성 흰쥐는셈타코에서 구입하여 일주일간동

물실에서사육하여사용하였다

.

Standard dose curve

작제

헤파린이 첨가된 혈액을

(heparin

1 0 0

unit/m/)

1 , 0 0 0 용에서

1 0분간원심분리하여혈장을얻었다

.

흰쥐를희생하고뇌를꺼내 어실험에 사용하였다

.

혈장

100

야에

PBN

이각각

1

，

2, 5, 10

매이 되도록넣고

chloroform 0.5 m

/로

5

분간추출하였다

.

추출 액을

4

0

C

에서

800 g, 10

분간 원심분리하여 유기층만을 취하고

freeze dryer

에적용하여용매를완전히날린후

acetonitrile

1 0 0 10/에녹여그중

50 (

0/를

HPLC

에적용하였다

.

뇌를약

1 g

이되 도륙취하고생리완충액

(PB, 10 mM HEPES, 141 mM NaCl, 4 mM KC1, 2.8 mM CaCl2, 1 mM MgS04, 1 mM NaH

2

P04, 10 mM D-glucose, pH 7.4) 500

를넣고균질화한후

PBN

이 각각

1, 2

，

5

，

10, 20，50 (ig

이 되도록

homogenate

에 넣고

chloroform 3 m

/로

5

분간 추출하였다

. 4

0

C

에서

800 g, 10

분간 원심분리하여 유기증 만을취하고

freeze dryer

에적용하여 용 매를완전히날린후

acetonitrile

^{2 0 0}

(i

/에녹여

pore size

가^{0 . 2}

jim

인

syringe filter (National Scientific Co

.)를시용하여여과하 고그중

100 (

0/를

HPLC

에적용하였다

.

내경동맥 관류법

(Inte rn al carotid artery perfusion technique, ICAP

법

)

250—300

용의웅성 흰쥐에

ketamine (100 mg^kg)

과

xylazine

( 2

mg/kg)

을근육주사하여 마취시키고이미 보고된논문의 방 법대로목부위를절개하여 혈관들을전기결찰하였다

.8)

오른쪽외 경동맥에

PE-10

관

(Natsume Co.)

을삽입하여

infusion pump

에 연결하였다

.

수술하는동안에는

thermal blanket

을이용하여 흰 쥐의 체온을

37°C

로유지하였다

. PBN 100 |ig

을

1% DMSO

에 녹이고

Kreb’s-Henseleit buffer (KHB, pH 7.4:119 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgS04, 1.2 mM KH

2

P04, 25 mM NaHC03, 10 mM D-glucose, 10 g/dl BSA)

를잘혼합하여

4 ml/min

으로주입함과동시에총경동맥을결찰 하였다

.

주입후정확히

15

초가되었을때즉시단두하여뇌를적

출하고 무게를 측정한 후

PB 500

야를 넣고 균질화한 후

chloroform

으로

5

분간추출하였다

.

추출액을

4

0

C

에서

800 g, 10

분간원심분리하여 유기증만을취하고

freeze dryer

에 적용하여 용매를 완전히 날린후

acetonitrile

2 0 0

jo

/에녹여

pore size

가

0.2 !jjn

인

syringe filter(National Scientific Co.)

를사용하여 여

과한후그중

100 |i

/를

HPLC

에적용하였다

.

ICAP

법을이용한후에뇌의분포용적

(volume of distribution, V

D)과뇌투과고유상수

(permeability-surface area product, PS)

를구하는식은다음과같다

.

[brain

중

PBN(g)/brain(g)]

VD (| ^그 //g) = --- ---

[Perfusate-

5

" PBN(g)/perfusate(ji/) PS (j

그

//min/g) = VD perfusion time

정맥투여법 (S in g le in tr a v e n o u s in je c tio n m e th o d )

PBN

의

pharmacokinetic profile

을즉정하기 위하여，이미 보 고된 논문의 방법9〉과 마찬가지로

ketamineb

( 1 0 0

mg/kg

)과

xylazine (2 mg/kg

)을근육주사하여 마취시킨

250—300 g

흰쥐 의대퇴동맥과 대퇴정맥에

PE-50

관

(Natsume Co

.)을 삽입하였 다

. PBN 0.5 mg

을

' 2% DMSO

로용해시키고

20% Polyethylene glycol 200

과

Ringes Herpes buffer (RHB, 10 mM HEPES, 141 mM NaCl, 4 mM KC1, pH 7.4

)로 잘혼합하여

1 m

/가 되 도록만들고대퇴정맥을통해정확히

500

가되도록 투여하였 다

.

약액을 투여한후 대퇴동맥에서

0.25

，

1, 2, 5, 15

，

30

，

60,

1 2 0분에 혈액을취하고 1 2 0분에단두하였다

.

채취한 혈액을 원

심분리하여 얻은혈장을

chloroform

으로

5

분간추출하고

4

0

C

에 서

800 g,

^{1 0}분간원심분리하여 유기층만을취하고

freeze dryer

에적용하여 용매를완전히 날린후

acetonitrile

1 0 0

(j

/에녹여 그중

5 0

^/를

HPLC

에적용하였다

.

적출한뇌는

PB 500 (

0/를 넣고균질화한후

chloroform

으로

5

분간추출하여 유기층만을 취하고

freeze dryer

에서용매를완전히날린후

acetonitrile

2 0 0

(j

/에녹여

pore size

가^{0 . 2}

(im

인

syringe filter

를사용하여 여과 하고그중

100 |i

/를

HPLC

에적용하였다

.

HPLC

분석

HPLC

분석은

Shimadzu LC-10AS gradient liquid chromato­

graphic system

을사용하여

UV detector

로

280 nm

에서즉정하 였다

. Column

은

C18 reverse phase column (CLC-ODS 5 jim, 4 mm 250 mm

)을사용하였다

. HPLC

이동상은

A

액과

B

액을 각각 ⁰

.

1

% phosphoric acid in water,

0

.

1

% phosphoric acid in acetonitrile

로 구성하여

A

액과

B

액을각각

4 :

6의비율 로하고

flow rate

는 ¹

m//min

로적용하였다

.

P h a r m a c o k in e tic p a r a m e te r 분석

Pharmacokinetic parameter

는각

peak

넓이를농도로환산하 여

UCLA Health Science Computing Facilities

에서 개발한

126 이나영 • 강영숙

4 J I I

(A) (B) (C)

Fig. 2 - Typical chrom atogram s from H P L C injection o f injectate (A), brain extract obtained at 0.25 m in after internal carotid artery perfusion (B), brain extract obtained at 120 m in after intravenous injection (C) of P B N

d e riv a tiv e - fre e n o n lin e a r r e g re s s io n a n a ly s is ( P A R B M D R

Biomedical Compute P Series)

를 이용하여

biexponential equation

에적용하여계산하였다

.

A(t) = +A

²

e 'k

²

t

여기에서

A(t)

는혈장중약물농도의

%ID/m

/이며

ID

는투여량 이다

.

Data

는

weight=V(concentration

) 2를이용하였다

.

정맥 부여

120

분후

PBN

의뇌의분포용적

(VD, m//g)

은투여후

120

분•에서 의뇌의약물농도를뇌의무게로나눈값을같은시간의종말혈 장중의 약물농도를 혈장용적으로나누어서 얻어진 값이다

.

전 신혈장중클리어런스

(CLt), steady-state

분포용적

(Vdss),

혈 징중농도•시간곡선하면적

(area under the plasma concentration­

time curve, AUC)

과평균체류시간

(mean residence time, MRT)

은

Gibaldi

와

Perrier

의정의에 따라

Ah A2, k

^l7

k

²로부터 구하 였다

.10)

PBN

의뇌투과고유상수

(permeability-surface area product, PS)

는다음과같이 계산되었다

.

p[

：

_[V „- V

0

]Cp(T) J^C p (t)d t

Cp(T) = 종말기의 혈징중 농노

Vo =

혈관내용적표시체의장기분포용적

VD =

뇌에서의물질의분포•용격

정맥투여 일정 시간후에 뇌내로송달된 약물량은

%ID/g

로

나타내어지며 다음과같이

ps

와

AUC

로나타내어진다

.

% ID /g (t) = P S > A U C (t) A U C (t) = [ ^ C p ( t ) d t

실험결고卜 및 고 찰

N itro n e 계 항산화제인 P B N 의 뇌 투과성을 내경동맥 관류법

(IC A P ) 과 정맥투여법으로 검토하기 위하여 언어진 대표적인

c h ro m a to g ra m 을 Fig. 2 에 나타내었다. A , B , C ᅵ 각 각 실험에 사용한 in je ctate 의 peak, IC A P 법으로 P B N 을 내경동맥으로 주 입한 후 15 초에서 적출한 뇌에서 얻은 pe ak, P B N 을 정맥투여한 후 120 분에서 적출한 뇌에서 얻은 peak 이다. H P L C 에 적용한

후

약 4 3 분에서 P B N 의 p e a l # 얻을 수 있었다. H P L C chrom atogram

의 결과를 바탕으로 혈장과 뇌 에서의 P B N 의 standard dose

cu rv e 를 작성한 결과 직선 상관계수가 각각 r 2= 0 .9 6 3

인 회귀직선을 얻을 수 있었고 이 직 선을 시용하여 혈장과 뇌 내

의 P B N 의 농도를 정량하였다.

흰쥐의 대퇴정맥으로 PBN을 투여한 후

1 2 0

분간의 혈장 중 을 Fig. 3 에 나타내었다. P B N 은 혈장 중에서 biexponential equation 에 따라 소신됨을 알 수 있었다. P A R B M D P p ro g ra m 을 이용하여 계산된 P B N 의 p h a rm a c o k in e tic p a ra m e te r 는 Table I

에 나열하였다. 120 분까지의 P B N 의 혈장 중 농도 곡선하 면적

(A U C ) 은 4 5 .7 ± 6 .2 % ID - m in /m /, 혈장 중 전신 클리어런스 (C L ) -!： - 6 .2 4 ± 0 .8 1 m //m in/kg, 소싶 반감기는 약 57 분을 나타내었다.

P B N 을 대퇴정맥으로 투여한 후 120 분에서의 뇌 투과량과 뇌투

과 고유상수 (P S ) 는 Fig. 4 에 나타내었다. P B N 의 뇌 투과량을 표시하는 % ID / g 값은 0 .1 5 ± 0 . 이이었다. IC A P 방법으로 P B N 을

m 00 o ^6

e 00n

7 9

寸

이 寸

S 9

•寸

SS.

CN

J. Pharm . Soc. Korea

흰쥐에서 nitrone 계 항산화제인 a-phenyl务 fer^-butyl nitrone(PBN) 의 뇌 투과성 및 체내동태 127

0 20 40 60 80 100 120

minutes

Fig. 3 - Plasma clearance profile of PBN in SD rats after intravenous injection of the injectate for up to 120 min. Data values are means

土

S.E.M. (n=3).

Table I - Pharmacokinetic parameters of PBN obtained with intravenous injection technique in SD rats

parameter PBN

A1 (%ID/m/) 9.14 ± 2.89

A

2

(%ID/m/) 0.67 ± 0.05

kx (min-1) 2.71 ± 1.00

k

²

(min-1) 0.013 ± 0.001

t

V 2

(min)

Distribution 0.39 ± 0.19

Elimination 57.1 ± 7.4

AUC

0— 1 20

(%ID . min/m/) 45.7 ± 6.2

AUCt (%ID • min/m/) 59.6 ± 11.6

Vdss (m//kg) 478 ± 13

CLt (m//min/kg) 6.24 ± 0.81

MRT (min) 77.5 ± 10.5

Pharmacokinetic parameters were estimated from plasma profile data up to 120 min in SD rats. Data values are means

士

S.E.M (n=3)

t

1/2

: half time, Vdss : volume of distribution at the steady-state CLt : plasma clearance, MRT : mean residence time

경동맥에적용하였을때뇌의분포용적

(vu)

과뇌투과고유상수

(PS)

값을구히여

Table II

에나타내었다

. PBN

의뇌분포용적은

60.0±12.0 |i//g

이었다

.

ICAP

법은흰쥐의 혈류속도인

1.25

해/면노보다빠른속도인

4 mZ/minsL

물질을

infUsion

하여물질이 혈액의 영향을받거나혈관 에침착되는것을방지하면서 뇌로이행시키

-;:?

방법이다

.8) ICAP

법으로

PBN

의뇌이행량을 조사한 결과혈관용적 표지자인

sucrose

의뇌분포용적과비교하였을때약

10

배정도큰값을나

0.05-

0.00

Fig. 4

ᅳ

The brain delivery amount measured as %ID/g of brain, the blood-brain barrier permeability surface area (PS) product and under the plasma concentration curve at

1 2 0

min for PBN. Values are expressed as means

士

S.E.M. (n=3).

Table II - The blood-brain barrier permeability of PBN using ICAP method

brain uptake PBN

VD i[xl/g) 60.0 ±

1 2 . 0

PS (|i//min/g) 240 ± 48

Brain were perfused for 15 second at rate 4 ml/min by internal carotid artery perfusion method in rats. Data values are means

土

S.E.M. (n=3)

타내었다

.11)

분자량이 약

400-600 Da

이하인 소분자약물일경우 물-옥탄올분배계수

(log P)

즉

,

지용성이 클수록 뇌투과성

(PS)

은커진다는논문의보고가있다

.1^

이와길미

PBN

이뇌내로비 교적많은양이이행되는것은

PBN

이분자량이 적고

(MW 177),

지용성

(log P 1.23

)인약물이기때문일 것으로사료된다

.

정맥투여법을이용하여

PBN

의뇌이행링을구했을때에도이 와유사한 결과를나타내었다

. In w'w

에서 정맥투여 투진통효 과를보이는

morphine

의경우

brain uptake

는약

0.08 %>ID/g

을 나타내었고

13) BBB

에존재하는

transferrin receptor

를통해 뇌 내로 이행하는

neutral avidin-OX26 conjugate (NLA-OX26)

의 경우에는 약

0.2 %ID/g

을 나타내었다

.14)

실험 결과

PBN

은

morphine

에비해서는

2

배가량많은 양이

, BBB

에수용체가존

재하는

NLA-

ᄋ

X26

와유사한 정도로뇌로 이행되는 것을알수

있었다

. PBN

을정맥투여하고

120

분에서의

brain chromatogram

을 살펴보면

(Fig. 2)

약6분에서 대사체의

peak

를볼수 있으며 본 실험에서는

intact

한

PBN peak

인

4.3

분대의 것만을 계산에 사용하였다

.

% I D / g P S A U C

(jjJ/m in /m l) ( % I D m in / m l)

0 . 2 0

- "

ᄊ

128 이나명

•

강영숙

결 론

이상의결과에서

a-phenyl-w-te/f-butyl nitrone (PBN

)의뇌이 행량을정맥투여법과내경동맥관류법

(ICAP)

의두가지방법으 로살펴본결과유의한뇌이행량을나타내었다

.

그러므로

PBN

은뇌로이행하여

free radical

에의해유도된 여러뇌신경질환 에효과를나타내며

,

이를모델물질로사용하여 새로운치료제 의개발이 가능하리라사료된다

.

감사의 말씀

본연구의 일부는숙명여자대학교^{2 0 0 2}년도교내 연구비지원 에의해수행되었으며 이에감사드립니다

.

문 헌

1) Facchinetti E, Dawson V L. and Dowson T. M. : Free radicals as mediators of neuronal injury. Cell Mol. Neurobiol. 18，667 (1998).

2) Knecht K. T. and Mason R. P. : In vivo spin trapping of xenobiotic free radical metabolites. Arch. Biochem. Biophys.

303，185 (1993).

3) Phillis J. and Clough-Helfman C. : Protection from cerebral ischemic injury in gerbils with the spin trap agent a-phenyl-w- ter^-butyl nitrone (PBN). Neurosci. Lett. 116，315 (1990).

4) Cao X. and Phillis J. : a-pheny 1-w-tert-bu.ty\ nitrone reduced cortical infarct and edema in rats subjected to focal ischemia.

Brain Res. 644，267 (1994).

5) Zhao Q., Pahlmark K., Smith M. L. and Siesjo B. K. : Delayed treatment with the spin trap a-phenyl-w-ter^-butyl nitrone

(PBN) reduces infarct size following transient middle cerebral artery occlusion in rats. Acta Physiol Scand. 152，349 (1994).

6

) He Q. R, Smith M. L.，Li E A. and Siesjo B. K. : Necrosis of the substania nigra, pars reticulate, in flurothyl-induced status epilepticus is ameliorated by spin trap a-phenyl-w -te^-buty 1 nitrone. Free Radical Biol Med. 22, 917 (1997).

7) Edumatsu R., Mori A. and Packer L. : The spin trap a-phenyl- n-tert-b\ity\ nitrone prolongs the life span of the senescence accelerated mouse. Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 847 (1995).

8

) Takasato Y., Rapoport S. I. and Smith Q. T : An in situ brain perfusion technique to study cerebrovascular transport in the rat. Am J. Physiol 247

，

H484 (1984).

9) Kang YS.，Saito Y. and Pardridge WM. : Pharmacokinetics of [

3

H]biotin bound to different avidin analogues. J. Drug Target.

3, 159 (1995).

10) Gibaldi, M. and Perrier, D .: Pharmacokinetics, Marcel Dekker Inc., New York p. 1 (1982).

1 1

)

강영숙

,

김유정

:

생쥐에 있어서약물의혈액•뇌관문투과성평 가를위한간편한

in vivo

방법

.

약제학회지

30，99 (2000).

12) Levin VA. : Relationship of octanol/water partition coefficient and molecular weight to rat brain capillary permeability. J.

Med. Chem. 23, 682 (1982).

13) Wu D., Kang Y. S, Bickel U. and P^rdridge W M. : Blood-brain barrier permeability to morphine-6-glucuronide is markedly reduced compared with morphine. Drug Metabol. Distrib. 25

，

768 (1997).

14) Kang Y. S and Pardridge W M .: Use of neutral avidin improves pharmacokinetics and brain delivery of biotin bound to an avidin-monoclonal antibody conjugate. J. Pharm. Exp. Ther.

269, 344 (1994).

J. Pharm . Soc. Korea