102 책임저자：김군도, 608-737, 부산시 남구 대연3동 599-1번지
부경대학교 자연과학대학 미생물학과 Tel: 051-629-5618, Fax: 051-629-5619 E-mail: [email protected]
접수일：2011년 4월 1일, 1차 수정일：2011년 4월 5일, 2차 수정일：2011년 4월 11일, 게재승인일：2011년 4월 13일
Correspondence to：Gun-Do Kim
Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pukyung National University, 599-1, Daeyeon 3-dong, Nam-gu, Busan 608-737, Korea
Tel: ＋82-51-629-5618, Fax: ＋82-51-629-5619 E-mail: [email protected]
자궁경부암 세포의 Epidermal Growth Factor Receptor Kinase에 대한 해조류-공생미생물 유래 물질의 활성억제 효과
부경대학교 자연과학대학 1미생물학과, 2화학과
조미정1ㆍ손병화2ㆍ김군도1
Inhibitory Activity of Compounds Originated from Marine Algae-Symbiotic Microorganisms on Epidermal Growth Factor Receptor Kinase in
HeLa Human Cervix Carcinoma Cells
Mi Jeong Jo1, Byeng Wha Son2 and Gun-Do Kim1 Departments of 1Microbiology, 2Chemistry, College of Natural Sciences,
Pukyong National University, Busan 608-737, Korea
Binding of ligand such as epidermal growth factor on epidermal growth factor receptor (EGFR), a member of the receptor tyrosine kinases (RTK) protein, leads to the receptor heterodimerization, phosphorylation and activation the loops in downstream. Development of the specific or broad spectrum of inhibitor for phosphorylation of EGFR is worth for cancer therapy because the EGFR plays a role as regulator in cellular processes such as proliferation, differentiation and cell survival. In this study, the effects of several compounds originated from marine algae-symbiotic microorganisms on the activity of EGFR kinase in HeLa human cervical cancer cells were investigated. The results shown the purified compounds inhibited the expression and phosphorylation of EGFR and/or EGF-related downstream molecule such as extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 in HeLa cells. It has finally decreased the growth of human cervix carcinoma cells. The results suggested that the compounds may have a therapeutic potential as inhibitors for EGFR to treat EGFR mediated diseases. (Cancer Prev Res 16, 102- 109, 2011)
Key Words: Receptor tyrosine kinase (RTK), Marine algae, Symbiotic microorganism, ERK1/2, HeLa
서 론
Epidermal growth factor receptor (EGFR)는 세포의 표면에 존재하는 수용체(trans-membrane growth factor receptor) 중 의 하나로, epidermal growth factor (EGF)와 강하게 결합함 으로써 활성화되는 170 kDa의 단백질이다.1,2) 또한, EG- FR은 type 1 receptor kinase 혹은 ErbB (HER) receptor family
중 하나로, cytoplasmic domain에 tyrosine kinase를 가지고 있어 ligand가 결합하여 이를 활성화시키면 kinase의 인산 화로 인해 signaling cascade가 유도된다.3,4)
EGFR은 폐, 위, 두경부암 등 많은 종류의 암에서 과다 발현되며, 지나치게 활성화된 EGFR signaling은 다양한 악성 종양을 유도한다.5) 이는 EGFR이 다양한 signaling pathway를 통해 세포의 성장, 세포 주기 및 분화를 조절 한다는 것을 의미한다.6) EGF가 암세포의 표면에 있는
EGFR에 결합하면 EGFR family의 hetero-dimerization 또는 homo-dimerization이 일어나게 되며, EGFR에 존재하는 PTK domain의 autophosphoylation을 유발하여 그 하위에 존재하는 세포내 phospholipase-Cγ, PI3K/AKT, MAPK, ERK1/2를 활성화시키고, 궁극적으로 DNA의 합성과 세 포의 증식을 유도한다.7) 따라서 EGFR의 작용과 EGFR과 관련된 하위분자들과의 상호작용을 이해한다는 것은 항 암 치료에 있어 중요한 작용점의 한 부분이 될 수 있다.
지난 몇 십 년 동안 EGFR을 작용점으로 하는 항암 치료 가 연구되었으며, 특히 단일 클론의 항체나 tyrosine kin- ase inhibitor는 수용체의 활성을 억제하는 약물로 개발되 었다. EGFR을 억제하는 단일 클론 항체로 개발된 Cetuximab은 전이성 대장암이나 두경부암을 치료하는데 있어 화학요법과 함께 사용되고 있으며, tyrosine kinase inhibitor인 Gefitinib (IressaⓇ)과 Erlotinib은 EGFR의 signal- ing cascade를 억제하며, 비소세포 폐암, 췌장암의 치료제 로 사용되고 있다.
본 연구는 지구의 70%를 구성하는 바다에 존재하는 다양한 해양생물들로부터 EGFR의 kinase 활성을 억제하 는 신규 항암 활성물질의 발굴에 초점을 두고 있으며, 해양 천연물의 잠재력은 이미 많은 연구자들에 의해 언 급되어 그 연구가 진행되고 있다. 해양생물은 종 다양성 의 수준이 방대하고 높은 염의 농도, 고압의 환경에서 백만 년 이상을 견디며 살고 있으며 이러한 생명체로 부 터의 신규 작용물질의 발굴 및 분리는 새로운 치료제로 서의 효용가치가 높을 것으로 인식되고 있다.
해양생물과 해양생물의 이차 대사산물이 가지는 약리 학적 잠재력 또한 그 범위가 매우 광범위하다. 어떤 생리 활성 대사산물의 경우 동물 혹은 식물에서 직접 생산되 는 것이 아닌 공생미생물에 의해 생산되기도 하는데, 이 에 따라 연구자들은 생리활성 천연물 자원으로써 미생 물을 이용하여 많은 연구를 진행하였다. 해양 미생물의 산업적 응용 사례로는 호염성 해양 미생물로부터의 항 생제, 색소, 바이오폴리머 생산, 내한성 미생물의 경우 세제용 효소의 개발, 빙핵 활성 단백질 생산, 내한성 유 전자를 이용한 인터페론 안정화 등 다양한 방면에서 이 용되고 있다.8) 특히 해양 환경에서 유래한 균류의 경우 일반 미생물과 다르게 특이한 구조를 나타내며, 큰 잠재 력을 가지고 다양한 이차 대사산물을 생성함에 따라 그 가치가 더욱 높아졌으며9,10) 지금까지 보고된 생리활성 천연물의 약 25%가 균류로부터 분리된 이차 대사산물로 알려져 있다.11) 해양 미생물로부터 생리활성 물질을 생 산하는 해양 미생물 균주를 개발하기 위해 해양 미생물 을 이용한 anti-oxidant, tyrosine kinase 억제 및 anti-bacterial
활성 등을 조사하여 다양한 생리 활성 해양 미생물 균주 들이 개발되었다.12∼14)
따라서 본 연구에서는 해양 거대조류의 공생미생물에 서 분리한 단일 화합물을 이용, in vitro상에서의 EGFR kinase 활성억제 효과 분석 및 우리나라 여성 암 중 22.3%
를 차지하는 자궁경부암 세포로서 세포의 표면에 EGFR 을 많이 발현하는 HeLa 세포를 대상으로 EGFR kinase와 그 하위분자 ERK1/2의 kinase 활성억제 효과를 확인함으 로써 암세포의 성장억제 효과를 가지는 새로운 물질을 발굴하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 해조류 채집 및 공생미생물 분리
해양의 거대조류(홍조류, 갈조류, 녹조류)는 통영시 욕 지도와 여수시 거문도 연안에서 채집, 멸균한 봉지에 담 아 실험실로 운반한 후 −20oC에서 보관하면서 공생미 생물을 분리하였다. Petri dish에 여지를 깔고 채집한 해 조류를 얹어 멸균 해수를 가하여 세척한 후 27∼29oC에 서 2∼4주 동안 배양, 현미경하에서 자낭과로부터 자낭 포자를 멸균 침을 이용하여 채취하고 계대 배양하여 공 생미생물 균주를 분리하였다. 숙주재료를 무균하에서 YPG agar12∼14) 평판배지상에서 배양한 후, 현미경하에서 순수 균사(hyphae)를 채취하거나, 배지상의 균사를 계대 배양하여 표면의 공생균주를 분리하였다. 무균 상태에 서 숙주재료의 표면을 3차 증류수와 70% 에탄올로 세척 한 후, 해부용 메스(scalpel)로 균사 조직의 내부를 노출시 킨 다음 내부조직을 채취하여 YPG agar 평판배지 상에 서 배양한 후, 현미경하에서 순수 균사(hyphae)를 채취하 거나, 배지상의 균사를 계대 배양하여 내면 공생균주를 분리하였다. 분리한 공생균주는 18s rRNA를 이용하여 균을 동정하였다(SolGent, Daejeon, Korea) (Similarity 99%).
2. 미생물 배양 및 유효 물질의 분리
분리한 균주를 각각 10 ml의 YPM 배지(0.2% yeast ex- tract, 0.2% peptone, 0.4% mannitol, 100% seawater)에서 27
∼29oC로 2주 동안 배양한 후, 배양액과 같은 양의 EtOAc-MeOH (1 : 1)을 가하여 추출한 다음, 여과하여 얻 은 추출액의 유기용매를 유거하고 남은 수용액을 HP-20 column에 주입하고, 증류수로 세척하여 탈염 처리한 후, MeOH 및 EtOAc 순으로 순차적으로 용출, 이 분획들을 대상으로 EGFR 활성도를 조사, 분획을 다시 선별하여 silica gel column chromatography [CH2Cl2-MeOH (20 : 1)]에 이어, HPLC [YMC ODS-A, 10×250 mm) (MeOH)]로 분리
정제, HREIMS 및 13C NMR data로부터 분자조성을 확인 하며 3종류의 단일 물질을 분리하였다.
3. In vitro kinase assay
1) 시약 및 기기: Tris-HCl, MgCl2, MnCl2, DTT, Tween-20, HEPES, NaCl, EDTA, BSA, substrate (Poly Glu : Tyr, 4 : 1), ATP 등은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA) 의 제품들을 사용하였고, Streptavidin Donor, P-Tyr- 100 Acceptor bead, Fusion alpha-microplate analyzer는 Perkin Elmer사(Shelton, CT, USA)의 제품을 사용하였다.
2) Epidermal growth factor receptor (EGFR) kinase
assay: 해조류 공생미생물 유래 각 화합물들의 EGFR
kinase 활성 억제 효과는 Perkin Elmer사의 Alpha ScreenⓇ system을 응용하여 측정하였다. Assay는 384 well plate (Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA)를 사용하여 전체 re- action vol. 25μl에서 이루어졌고, 분리 정제된 EGFR 효소 는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. 추출물 1μl, ATP (최종농도 100 mM)가 함유된 kinase buffer 4μl, EGFR 효 소 5μl를 넣고, 15분 동안 상온에서 반응시킨 후 기질 (Poly Glu : Tyr, 4 : 1) 5μl를 넣고 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 여기에 donor와 acceptor bead 혼합물(1 : 1 ra- tio)을 10μl 넣은 다음, 빛을 차단한 상태로 상온에서 1 시간 동안 추가 반응시킨 후, 효소의 활성 억제 효과를 측정하였다. 해조류 공생미생물에서 분리한 화합물은 먼저 최종농도 50μg/ml에서 활성 억제 효과를 1차 검색 하여 활성 시료를 선정 한 다음, 최종농도 10μg/ml에서 2차 검색을 진행하여 억제 효과를 나타내는 시료를 대상 으로 IC50 값을 조사하였다. Kinase assay buffer는 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 2 mM DTT, 0.01% Tween-20의 조건으로 조제하였고, Capture buffer (2.5×concentrated)는 62.5 mM HEPES (pH 7.4), 250 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0.25% BSA의 조건으로 조제하였 다. 기질(Poly Glu : Tyr, 4 : 1)은 ATP가 함유된 kinase assay buffer로 희석하였고, Streptavidin donor와 P-Tyr-100 accept- or bead는 최종농도가 각각 20μg/ml이 되도록 capture buffer로 희석해서 조제하였다.
4. 세포 배양
실험에 사용한 자궁경부암 HeLa 세포는 American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA)에서 구입하 였으며 세포의 배양을 위해 DMEM (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA), 10% heat-inactivated fetal bovine serum (HyClone Laboratories) 및 100 U/ml Penicillin and 100 μg/
ml Streptomycin (PAA Laboratories GmbH, PA, Austria)이 포
함된 배지를 이용, 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였 다.
5. 세포의 성장 및 Cell viability 확인
세포의 성장과 Cell viability를 확인하기위해 HeLa 세포 를 배지 100μl에 1×104 세포로 96-well cell culture plate (SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea)의 각 well에 분주하였다.
그리고 화합물을 다양한 농도로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 24시간의 배양 후 EZ-Cytox Cell viability assay solution WST-1Ⓡ (Daeil Lab Service, Jong-No, Korea)을 각 well에 넣고 37oC, 5% CO2 incubator에서 3시간 동안 반응 시킨 다음 ELISA reader (Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA)를 이용하여 460 nm의 파장에서 흡광도를 측정 하였다. 세포의 성장 상태는 현미경을 사용하여 확인하 였다.
6. Western blot analysis
HeLa 세포에 각 화합물을 40분 동안 선 처리하고 epi- dermal growth factor (EGF)를 10분 동안 처리한 후, cold PBS를 이용하여 세포를 세척하고 회수하였다. 회수한 세 포에 cold lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% deox- ycholate, 0.1% SDS and proteinase inhibitors (PMSF, EDTA, aprotinin, leupeptin, prostatin A)] (Intron biotechnology, Gyeonggi, Korea)를 첨가하여 30분간 ice에서 반응시킨 후 14,000 rpm으로 20분간 원심분리 하여 그 상층액을 취하 였다. 상층액의 단백질 농도는 Protein quantification kit (CBB solutionⓇ) (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA)를 이용해서 측정하였으며 BSA를 이용하여 standard curve를 설정하였다. 각각의 단백질 sample은 Laemmli buffer와 섞어 4분간 끓였으며, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하였다. 분리된 단백 질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (PALL Life Science, MI, USA)으로 electro-transfer 시킨 후 5% skim milk를 포함하는 PBST buffer (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM NaPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.5% Tween-20)에 담가 상온에서 2시간 반응시켜 비 특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그 다음 PBST buffer로 15분 정도 세척 한 후, 1차 항체(EGF receptor, phospho-EGF receptor (Tyr1068), phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204)) (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)를 처리하 여 4oC에서 overnight 반응시킨다. 그 후 PBST buffer로 세 척하고 처리된 1차 항체에 적절한 2차 항체(Horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit or mouse IgG) (Cell Signaling
Table 1. Inhibitory activity of the compounds isolated from marine algae-symbiotic microorganisms by in vitro EGFR kinase assay Sample No. Chemical formula % Inhibition
(50μg/ml)
% Inhibition
(10μg/ml) Host marine algae Microorganism
018 C9H10O5 87.78 91.42 Hypnea saidana Phoma herbarum
019 C8H8O4 96.89 94.03 Hypnea saidana Phoma herbarum
030 C7H8O4 88.03 86.43 Ishige okamurai Aspergillus sp.
Fig. 1. IC50 values of in vitro EGFR kinase activity against the compounds.
Technology Inc.)를 상온에서 1시간 반응시킨다. 그리고 다시 PBST buffer로 세척, enhanced chemiluminescent (ECL) detection solutions (Pierce, Rockford, IL, USA)을 처리한 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양상을 비교 분석하였다.
결과 및 고찰
본 연구는 자궁암 세포주인 HeLa 세포를 대상으로 해 조류 공생 미생물에서 분리한 3종류의 서로 다른 단일 물질들이 HeLa 세포의 세포막에 존재하는 EGFR kinase의 인산화를 저해하는 활성을 가지고 있는지? 만약 활성을 가지고 있는 물질이 있다면 이를 분리하여 물질의 구조
를 분석하고자 하였다. 또한 이 물질이 EGFR kinase의 인 산화를 저해하는 활성을 가지고 있다면 EGFR 신호체계 에 관여하는 하위분자들의 인산화 혹은 활성도에도 영 향을 미치는지? 이러한 EGFR kinase와 하위분자들의 인 산화 저해 효과가 궁극적으로는 자궁암 세포인 HeLa 세 포의 성장에 영향을 주는지를 분석하고자 하였다.
Epidermal growth factor (EGF)는 EGFR에 결합, 수용체에 존재하는 kinase의 인산화를 유도하여 궁극적으로는 세 포의 생장, 증식 및 분화를 조절하는 중요한 polypeptide 이다.15) EGFR은 상피세포 및 상피세포 암의 생장을 결정 하는 중요한 수용체로, 이러한 EGF 수용체의 과다한 인 산화는 다양한 암을 유발하게 된다.16) EGFR은 특히 몇몇 암세포에서 과다 발현되기 때문에 암 치료에 있어 target
Fig. 2. Morphological changes and growth inhibition induced by three compounds. Compare to the control cells treated with only EGF, the HeLa cells were treated with each compound (10μg/ml, 24 h) and EGF (100 ng/ml, 10 min).
이 되어 이용된다. Epidermal growth factor receptor (HER1) tyrosine kinase는 수용체의 활성 억제를 통한 항암 치료 및 항암제의 target으로 알려졌다.17) 현재 가장 널리 알려 진 receptor tyrosine kinase inhibitor로서는 수용체의 활성을 억제하는 Iressa,18) Cetuximab과 같은 단일 항체17) 등이 밝 혀졌다. Iressa는 악성 종양에서 돌연변이 단백질에 선택 적으로 작용하는 EGFR inhibitor이며 Cetuximab은 암세포 표면의 단백질에 특이적으로 결합하여 lysosome에 의한 분해를 유도한다.17,19)
본 연구에서 사용한 해조류 공생 미생물의 추출물 중 018와 019는 홍조류인 Hypnea saidana (사이다가시우무)를 숙주로 이용하는 Phoma herbarum에서 추출한 것이며, 030 의 경우는 갈조류인 Ishige okamurai (패)를 숙주로 갖는 Aspergillus sp.에서 추출한 것이다. 이들 물질의 숙주 해조 류, 분자식을 EGFR kinase 활성 억제도와 함께 Table 1에 나타내었다. HeLa 세포에 대한 3종류의 서로 다른 단일 추출물이 가지는 EGF receptor kinase 활성의 억제효과를 확인하기 위하여 in vitro assay인 Alpha ScreenⓇ system을 이용하였다. 이 assay는 human EGF receptor의 cytoplasmic 부분에서 유래된 kinase domain의 활성을 측정하는 것으 로 이 kinase domain은 기질 특이성을 가지고 있다. 각각 의 추출물 농도를 50μg/ml로 처리하여 활성도 비교 실
험을 실시한 결과, 추출물 3종류 모두 85% 이상의 억제 효과를 나타내었으며, 그 중 019 물질이 95% 이상의 가 장 높은 EGFR의 인산화 활성 억제 효과를 나타냈다. 이 결과를 바탕으로 동일한 방법으로 각각의 추출물을 10 μg/ml의 농도로 낮추어 활성도를 비교한 결과, 3종류의 물질들이 모두 85% 이상의 EGFR 인산화 활성을 억제하 는 효과를 나타내었다(Table 1). 10μg/ml의 농도에서 이 kinase domain의 활성을 저해하는 것을 확인한 후 이들 각각 물질들의 IC50 값을 구하고자 3종류의 물질들을 다 양한 농도로 처리하여 in vitro assay를 실시하였다. 그 결 과 각 물질의 EGFR 인산화 활성 억제에 대한 IC50 값은 2.6 ppm, 0.6 ppm 그리고 2.8 ppm의 값으로 나타났으며, 019 물질이 가장 낮은 IC50의 값을 나타내었다(Fig. 1). 이 들 물질들이 in vitro상에서 EGF receptor의 kinase 활성을 억제하였기에, 이 물질들을 세포에 처리하면 EGF re- ceptor를 매개로 하는 신호전달 체계에 영향을 줄 수 있 을 것이라 생각되어 3종류의 물질들을 세포에 각각 처리 하였다. 물질을 처리한 세포를 확인한 결과, EGF의 신호 를 유도하기 위하여 EGF만 처리한 세포에 비해 추출물 을 함께 처리한 세포의 수가 훨씬 더 감소하였음을 확인 할 수 있었으며, 이는 추출물이 EGFR의 kinase의 활성도 를 억제함으로서 이와 연관된 하위분자들의 신호체계에
Fig. 3. Activation of EGFR kinase induced by EGF. In order to examine the effect of EGF on the activation of EGFR kinase, the HeLa cells were treated with various concentrations of EGF (0, 10, 50, and 100 ng/ml) for 10 min. The expressed levels of phospho-EGFR were detected by Western blot analysis.
Fig. 4. The inhibitory effects of the compounds and Tyrphostin AG 1478 on EGFR kinase signaling cascades. The HeLa cells were pre-incubated with 10μg/ml of each compound and Tyrphostin AG 1,478 (100 and 200 nM) for 40 min and then stimulated with 100 ng/ml EGF for 10 min. The expression of the phosphorylated EGFR and EGFR-related downstream molecule ERK1/2 were detected by Western blot analysis with the phospho-specific antibodies against EGFR and ERK1/2.
영향을 주어 HeLa 세포의 성장을 억제하였다고 생각할 수 있다(Fig. 2).
EGFR은 ligand binding domain과 kinase domain으로 구성 되어 있다.20) EGF와 같은 ligand가 ligand binding domain에 부착하면 수용체는 활성화되고, kinase domain에 존재하 는 각각의 아미노산 잔기에 인산화와 같은 생화학적 변 화가 일어난다.21) 특히 tyrosine 1,068 잔기의 인산화는 EGF에 의해 강하게 반응하여 mitogenic (Ras/Raf/MEK/
ERK) signaling pathway를 유도한다.22) 이러한 연구결과를 바탕으로 HeLa 세포에 EGF만을 처리한 후 단백질을 추 출하여 western blot을 통해 EGF의 EGFR kinase의 활성 유 무를 조사하였다. Western blot 결과에서 보는바와 같이 활성화 된 EGFR (phospho-EGFR)의 단백질 발현량이 EGF 를 처리된 세포에서 더 증가하는 것을 확인 할 수 있었 고, 비 인산화 된 EGFR은 세포 표면에 있는 EGFR의 전 체 양을 나타낸다(Fig. 3). 따라서 세포에 동일한 양의 수 용체가 존재할지라도, EGFR의 인산화는 EGF의 처리유 무에 의존적으로 나타난다고 할 수 있다.
Tyrphostin AG 1,478은 여러 가지 tyrosine kinase inhibitor 중 특히 EGFR (ErbB1)에 잘 작용한다고 알려진 억제제로 서 주로 EGFR antagonist로 사용되어 왔었으며, in vivo상 에서 EGFR의 활성을 억제 시킬 수 있는 물질로서 in vitro
와 in vivo상에서 암 세포의 증식을 억제하는 기능을 가진 다는 것이 밝혀져 있다.23∼25) 이러한 연구 결과를 바탕으 로 HeLa 세포에 해조류 공생 미생물에서 분리한 3종류 의 추출물과 AG 1478을 각각 처리하여 EGFR과 EGFR의 downstream에 있는 ERK1/2의 인산화 발현량을 western blot을 통해 비교 확인하였다. ERK1/2는 Thr202/Tyr204 잔기의 인산화를 통해 활성화되는 단백질로 growth fac- tor에 의해 활성화되어 세포의 증식 및 분화를 조절하는 단백질이다.26) Western blot 결과에서는 각각의 추출물과 AG 1,478이 EGFR의 인산화를 억제하고, EGFR의 down- stream에 존재하는 단백질 ERK1/2의 인산화를 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). AG 1,478과 마찬가지로 018, 019, 030은 EGFR의 인산화에는 강한 억제효과를 나 타내었으나, ERK1/2의 인산화에는 상대적으로 영향을 주지 않았다. 반면, 018의 경우 ERK1/2의 인산화를 가장 강하게 억제하는 보아, 018은 EGFR의 인산화에도 강한 억제효과를 나타내며 무엇인가 다른 경로를 통해서 ERK1/2의 인산화를 억제한다고 생각할 수 있다.
이들 3종류의 해조류 공생 미생물 유래의 단일 추출물 은 AG 1,478과 같이 EGFR kinase 및 EGFR의 downstream 에 존재하는 단백질의 인산화 활성을 억제하는 효과를 가진다고 할 수 있으며 FACS analysis 및 EGFR 이하의 downstream signaling pathway를 보다 더 탐색 해 봄으로써 Tyrphostin AG 1,478을 대체할 수 새로운 억제제로서의 활용 가능성 및 IressaⓇ를 대체할 수 있는 새로운 해양생 물 유래의 항암 활성 물질로서의 개발 가능성을 결정 할 수 있으리라 사료된다.
결 론
EGFR kinase의 활성억제 효과를 바탕으로, 본 연구에서 는 해조류 공생 미생물 2종을 선별, 이들 미생물로부터 3종류의 단일 물질을 분리, 이 물질들을 이용하여 자궁경 부암 세포주인 HeLa 세포에서의 EGFR kinase 활성 및
EGFR의 downstream에 존재하는 단백질의 인산화 활성을 억제하는 EGFR targeted 억제제를 발굴하고자 하였다.
해조류에서 분리한 해양 공생 미생물에서 단일 물질 을 추출, EGFR kinase 활성 억제 효과를 in vitro assay를 이용하여 분석하였다. 3종류의 물질, 018, 019 그리고 030 중 추출물 019가 가장 낮은 농도의 IC50 값을 나타낸 것으로 보아 EGFR kinase 활성 억제 효과가 가장 높았다.
HeLa 세포를 대상으로 3종류의 추출물을 각각 40분 동안 처리하고 EGF로 10분 동안 EGFR kinase의 활성화를 유도 한 후 Western blot을 행한 결과, 이들 추출물들이 phos- pho-EGFR의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한 ty- rosine kinase inhibitor로 알려진 Tyrphostin AG 1,478과 비 교 실험 한 결과, EGFR kinase 활성 및 EGFR의 down- stream에 존재하는 단백질 phospho-ERK1/2의 활성 또한 억제함을 관찰하였다. 이러한 활성억제 효과는 이들 물 질을 24시간 지속적으로 처리하였을 때 세포 수의 확연 한 감소와 함께 세포의 증식 억제 효과를 유도하였다.
이와 같은 결과들은 해조류의 공생 미생물에서 분리 한 3 종류의 단일 추출물에 대한 EGFR targeted 항암 활 성 물질로서의 개발 가능성을 제시하고 있다.
감사의 글
이 논문은 2008년도 정부(교육과학기술부)의 재원으 로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구(KRF-2008- 314-F00048)임.
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