화상 흉터 개선을 위한 돼지태반 추출물의 효과

책임저자：이정숙, 대전시 동구 신안동 293-1

󰂕 300-060, 베스티안 중앙연구소 Tel: 070-7603-7422, Fax: 042-633-7055 E-mail: [email protected]

화상 흉터 개선을 위한 돼지태반 추출물의 효과

김홍신

․이정희

․윤천재

․이정숙

1베스티안 중앙연구소, ²베스티안 부천병원 응급의학과

The Therapeutic Effect of Porcine Placenta Extract for Improvement Sequelae of Burn

Hong Shin Kim, M.S.

, Jung Hee Lee, M.S.

, Cheon-Jae Yeon, M.D.

and Jung-Suk Lee, Ph.D.

1Bestian Research Center, Deajeon, ²Department of Emergency Medicine, Bestian Bucheon Hospital, Bucheon, Korea

Purpose: Burn injury cause pruritis, pain, psychological and

Methods: To investigate the effect of PPE, we performed in vitro cell cytotoxity test (MTT assay), antioxidant activity as-

Results: As a result of cell cytotoxity test (MTT assay), PPE

Conclusion: Our data showed anti-oxidant effect, diminution

Key Words: Porcine placenta extract (PPE), Wound healing,

서 론

화상은 심한 경우 치료 후에도 기능적 장애 및 많은 후유 증을 가져온다. 집중력 장애, 우울증, 가려움증, 통증, 불안, 관절구축, 색소 침착, 저색소증 및 비후성 반흔이 발생된다.

2도 및 3도 이상의 화상 피부에서 나타나는 비후성 반흔 (Hypertrophic scar)은 피부가 두꺼워지고 소양감 및 건조 함과 일상생활 장애를 유발한다

. 비후성 반흔 조직에서 a-SMA (alpha smooth muscle actin)를 표현하는 과도한 근 섬유세포 증가 및 콜라겐과 섬유결합소의 과도한 합성이 관찰되어지고, 형질전환인자(TGF-β1, Transforming growth factor), PDGF (Platelet derived growth factor) 등의 성장인 자와 IL-16 (Interleukin-16), IL-13 (Interleukin-13) 등의 사 이토카인이 증가한다

. 그 외 비후성 반흔 및 섬유증(Fibro- sis) 형성에 TGF-β1와 P311 유전자가 깊이 관여하고

발현 이 증가되는 것으로 보고되었다. TGF-β1은 활성화된 혈소 판, 대식세포 및 림프구에서 분비되며

근섬유세포에 의한 콜라겐과 섬유소 결합 생성을 증가시킨다. P311은 근섬유 세포 분화와 섬유증을 촉진하고, TGF-β1와 콜라겐 type1 의 mRNA 발현을 유도하고 상처표면 수축(Contraction)에 관여하는 것으로 실험결과가 보고되었다

.

일반적인 비후성 반흔 치료는 스테로이드의 병변내 주 사, 압박 요법 외과적 절제술, IFN-α 주입 및 TGF-β1에 대한 항체 요법 등이 시도되고 있다

.

태반은 혈액 융모막으로 구성되어 있는 태아와 모체의

자궁을 연결해 주는 기관으로 태아에게 산소와 영양분을

공급해 주고, 노폐물을 제거하는 역할을 한다

. 태반 추출

물은 싸이토카인, 호르몬, 활성 펩타이드, 효소, 성장인자,

인, 철, 지방, 핵산 단백질이 포함된 것으로 알려져 있다

.

그 중 돼지태반 추출물은 비교적 안전하고 인간과 면역 효

과가 유사한 것으로 알려졌으며, 대식세포 활성억제로 접

촉성 피부염(Contact hypersensitivity)진행을 억제시켜 염

증 반응 줄여 주는 것이 실험적으로 확인 되었다

. 또한

섬유아세포(NIH3T3 cell, fibroblast)에 30 mg/ml의 돼지태

반 추출물을 처리하였을 때, 4.17배 정도의 세포성장이 증

가하였고, Rat에 화상을 유도 후 30 mg/ml의 돼지태반 추 출물을 피부에 처리하여 1, 5, 10, 15일에 bFGF (basic fibro- blast growth factor) 발현을 확인한 결과, 5일째부터 bFGF 발현이 양이 증가하는 것이 보고되었다

.

화상 피부재활치료에 있어서 비후성 반흔 치료와 관련하 여 돼지태반 추출물의 효능은 거의 알려지지 않았다. 본 연 구는 비후성 반흔과 색소침착 등의 돼지태반 추출물의 효 과를 분자생물학적인 기법을 이용하여 확인하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 재료

본 연구에 사용한 돼지태반 추출물(Porcine placenta ex- tract)은 일본 호루스(Horus, ホルス)사의 SPF 돼지 태반으 로부터 효소를 이용한 추출과 동결건조방법의 동결효소추 출법

을 이용하여 추출하였다.

2. 세포배양

1) 섬유아세포 배양 및 각질 형성 세포 배양

사람의 각질 형성 세포(HaCaT cell) 및 섬유아세포(Human fibroblast)를 Dulbecco's modified eagle media (DMEM), Bovine calf serum (BCS)와 Penicilline-streptomycin이 함 유된 배지에서 37

C, 5% CO

의 조건으로 배양시켰다. 배양 된 섬유아세포 및 각질 형성 세포는 2×10

개로 나누어 6 well cell culture dish에 넣고 돼지태반 추출물을 24시간 동 안 처리하였다.

2) 멜라닌 세포 배양

사람의 멜라닌 세포(Human melanoma cell: MNT-1 cell) 를 Dulbecco's modified eagle media (DMEM), fetal bo- vine serum (FBS), Non-essential amino acid, 1 mM So- dium pyrubate, Penicilline-streptomycin 배지에서 37

C, 5% CO

의 조건으로 배양시켰다.

3. 세포생존율시험

세포생존율시험은 6 well에 섬유아세포(Human fibro- blast) 및 인체 각질형성 세포(HaCaT cell)를 24시간 배양 후 돼지태반 추출물을 1.25∼10% 농도로 처리하여 24시간 동안 다시 배양하였다. 여기에 MTT (3-(4,5 dimethylothia- zol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide, sigma) 5 mg/

ml를 첨가하여 37

C, 5% CO

의 조건으로 3시간 동안 배양 후 DMSO로 녹이고, 96 well plate로 옮겨 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

4. 항산화 활성 측정 시험(SOD like activity)¹⁴⁾

항산화 활성 측정시험은 SOD (Superoxide dismutase) 유사활성으로 측정하였다. SOD 유사활성은 활성 산소종을 과산화수소 (H

O

)로 전환시키는 반응을 촉매하는 py- rogallol의 생성량을 측정하여 나타내었다. 각 시료 용액 0.2 ml에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6 ml와 7.2 ml pyrogallol 0.2 ml (Sigma)를 가하여 25

C에서 10분간 반응시킨 후 1.0 M HCl 0.1 ml을 가하여 반응을 정지시키고, 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 대조군과 처리군의 흡광도 감소율 로 나타내었다.

5. 멜라닌 함유량 측정 시험^15,16)

인간의 멜라닌 세포(Human melanoma cell, MNT-1 cell) 를 6 well에 접종하여 24시간 배양 후 돼지태반 추출물 2, 5%를 처리 하였다. 48시간 추가 배양하여 세포를 수확 한 후 멜라닌 양을 측정하기 위해 NaOH를 처리, 가열 및 용해 시켜 475 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

6. 세포 창상치유능 시험(Wound healing assay, Cell migration assay)¹⁷⁾

섬유아세포(Human fibroblast)를 12 well plate에 접종한 후 24시간 동안 배양 하여 세포가 plate에 80% 이상 되도록 하였다. Yellow tip을 이용하여 배양접시 바닥을 십자로 그 어 균일한 너비로 선을 만들었다. PBS로 세척 한 후 돼지태 반 추출물 10%를 포함한 배지를 처리하였다. 돼지태반 추 출물을 처리하지 않은 대조군과 처리군을 비교하였고, 세 포 창상치유능 시험은 현미경 배율 ×100으로 3, 12, 24, 48 시간에서 사진을 찍어 비교하였다.

7. Total RNA 분리 및 cDNA 합성

수확된 세포에 easy-BLUE

Total RNA Extraction Kit

(Intron Biotechnology Inc, Korea)를 잘 풀어준 후 0.2 ml의

클로로포름을 첨가하여 교반해 주었다. 이 혼합물을 4

C에

서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액을 취한 후,

동량의 2-propanol을 첨가한다. 4

C에서 10분 이상을 두었

다가 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 튜브의 상층

액을 제거하고 얻은 침전물에 80% 에탄올을 넣어 13,000

rpm으로 원심분리 후 에탄올은 제거해 준다. 실온에서 건

조 후 0.1% dDEPC water 30μl에 용해시켜 RNA를 얻었

다. 2μg의 RNA에 전체량이 9.5μl가 되도록 멸균수와 혼

합 후 oligo dT 1μl를 tube에 첨가하고 75

C에서 5분간 반

응시킨다. Ice에 적어도 1분 이상 처리하고, 10 U/μl

Fig. 1. Cell cytotoxity test (MTT assay) of porcine placenta extract. Cell cytotoxity test showed cell viability in treatment group on

Fig. 2. SOD (superoxide dismutase) like activity assay of

RNase inhibitor 1μl, 5x RT buffer 4μl, 10 mM dNTP 2μ l, 0.1 M DTT 2μl, AMV RT enzyme 0.5μl를 넣고 42

C에 서 60분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

8. 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)

실험에 사용된 모든 PCR primer는 Gene bank data base 를 기본으로 Primer 3 software를 이용하여 합성하였고, in- itial denaturation으로 95

C에서 5분, 95

C에서 30초(dena- turation), 58

C에서 30초(annealing), 72

C에서 30초(exten- sion), 72

C에서 5분(final extension)으로, 유전자에 따라 25∼

32 cycle을 증폭시킨 후 1.2% agarose (BIO-Rad, USA) gel 에 reaction mixture 5μl씩 전기영동하고 발현정도를 확인 하였다.

결 과

1. 세포생존율 시험(MTT assay)

돼지태반 추출물의 세포생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 추출물을 1.25, 2.5, 5, 10%의 농도로 배지에 첨가하 여 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다. 섬유아세포 (Human fibroblast)는 2.5, 5, 10%의 농도에서 100% 이상의 세포생존율을 보였으며, 각질형성세포(HaCaT)에서는 80∼

90%의 세포생존율을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

2. 항산화 시험(SOD like assay)

돼지태반 추출물 항산화 효능 검정을 SOD (Superoxide dismutase) 유사활성으로 검정하였다. SOD (Superoxide dismutase) 유사 활성을 가지는 물질은 Superoxide로부터

생체를 보호하며, 인체 내의 Superoxide를 제거함으로써 노화억제와 산화적 장애 방어효과를 가지는 것으로 알려져 있다

. 돼지태반 추출물의 SOD 유사활성은 19%로, Vitamin C 1 mM 보다 높고, Vitamin C 5 mM와 비슷하였 다(Fig. 2).

3. 멜라닌 함유량 측정 시험

멜라닌 세포(Human melanoma cell- MNT-1 cell)에 돼

지태반 추출물을 2, 5% 처리하여 Melanin 함유량 저해 능

력을 확인한 결과, 돼지태반 추출물 2% 처리하였을 경우

19%, 5% 처리하였을 경우 23%의 Melanin 함유량 저해 능

력을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Melanin contents assay by porcine placenta extract. After

t-test, PPE = porcine placenta extract.

Fig. 4. Wound healing assay by porcine placenta extract (×100).

Cell were treated with PPE after wounding. The wound width gradually were decreased in PPE group after 48 hours. PPE = porcine placenta extract.

4. 세포 상처치유능 시험

섬유아세포(Human fibroblast)를 이용하여 세포 이동성 시험(Cell migration assay) 통해 돼지태반 추출물 10% 처 리한 군에서 처리 하지 않은 군보다 빠른 이동과 증식이 확인되어 양단간의 간격이 좁아졌다. 돼지태반 추출물을 처리 한 후 12시간대까지는 차이가 거의 없으나 24시간이 후부터 간격이 서서히 좁아지는 것을 확인되었고, 48시간 에서 대조군에 비해 간격이 많이 좁아진 양상이 확인되었 다(Fig. 4).

5. 역전사 중합효소 연쇄반응

각질 형성 세포(HaCaT cell)에 돼지태반 추출물 5, 10%를 처리한 후 24시간 후에 Cell을 회수하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 세포부착 단백질(Cell adhe- sion protein)인 JUP (Plakoglobin), DSP (Desmoplakin) 발 현을 확인한 결과, 유전자 발현변화는 없었다. 그 외에 스트 레스 및 콜라겐 합성 인자로 알려진 HSP47 (Heat shock protein 47)은 발현의 차이를 보이지 않았지만, 열 등의 스 트레스에 의해 발생하는 HSP70 (Heat shock protein 70)는 대조군과 비교하여 돼지태반 추출물을 처리하였을 때 발현 이 감소됨을 확인하였다.

섬유아세포를 동일한 방법으로 근섬유세포의 확인 표지 자로 쓰이는 a-SMA와 근섬유세포 분화 촉진 및 수축에 관 여하는 것으로 알려진 P311발현을 확인한 결과, 처리하지 않은 것과 비교하였을 때, 돼지태반 추출물 5, 10%를 처리 한 군에서 a-SMA와 P311 발현이 농도 의존적으로 감소되 는 경향을 관찰하였다(Fig. 5).

고 찰

본 연구에서는 화상 치료 후에 빈번하게 발생하는 비후 성 반흔과 색소침착 등의 문제를 개선하기 위해 돼지태반 추출물(Porcine placenta extract)의 효능을 피부세포를 이 용하여 분자생물학적 기법을 통해 분석하였다. 돼지태반 추출물은 피부 미용과 관련하여 엘라스타아제(Elastase) 20

∼30%의 저해 활성을 보이며 주름 개선 효과가 있는 것으 로 보고되었다

. 또한 간 손상을 유발한 백서에서 돼지태 반 가수 분해물을 투여하였을 때, 혈청 AST와 ALT 농도 증가를 억제시키고 간 조직 형태 변형을 감소시켜 손상 억 제 효과가 있는 것으로 확인되었다

. 화상과 관련하여, Rat 에 화상을 유도한 후 돼지태반 추출물을 처리 하였을 때, 유도된 피부에서 bFGF와 TGF-β1의 발현이 피부 도포 후 5일째부터 발현이 증가하였고 상처치유기간이 50% 정도 빠르게 진행됨이 보고되었다

.

본 연구에서는 세포 독성 시험결과, 섬유아세포에서는

Fig. 5. RT-PCR analysis of porcine placenta extract treated on

100% 이상의 세포생존율을 보였고 각질형성세포에서는 80% 이상의 생존율을 보여 세포독성이 없는 것으로 나타났 다. SOD like activity를 이용한 항산화 효능 확인 시험에서 는 대조군인 Vitamin C 1 mM보다 높고, 5 mM과 유사한 것을 확인하였다. 항산화 작용은 화상에서 Mitochondria integrity를 유지하는데 도움을 준다고 보고되었고

, 세포 손상을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 결과로 Vitamin C 5 mM과 유사한 항산화 효능을 갖고 있어, Mitochondria integrity 유지 및 세포손상 억제에 도움을 줄 수 있다고 추측할 수 있다.

화상 치유 과정은 지혈(hemostasis), 염증반응(Inflammat- ion), 면역반응(Immune response), 상피화(re-epitheliza- tion), 혈관생성(Angiogenesis), 재형성(Remodelling)의 과 정을 거치게 된다. 치유과정 마지막 단계, 화상 후 3개월∼6

개월 사이 결합조직 침착 및 상처표면 수축이 나타난다

. 과도한 결합조직 침착 및 상처표면 수축(contraction)은 비 후성 반흔의 특징이며, 근섬유세포 증가가 주요 원인으로 알려져 있다. 이와 관련하여 돼지태반 추출물의 효능을 확 인하기 위하여 섬유아세포에 처리한 후 근섬유세포 분화와 수축에 관련되는 유전자로 보고된 a-SMA와 P311 발현을 역전사 중합효소 연쇄 반응을 통하여 확인하였다. 결과적 으로 돼지태반 추출물 5, 10%을 처리하였을 때, a-SMA와 P311 발현이 농도 의존적으로 감소하는 경향이 확인되었 다. 이러한 결과는 돼지태반 추출물이 재형성 과정에서 비 후성 반흔으로 인한 흉터개선에 효능이 있다는 것을 의미 하기도 한다.

각질형성세포에 돼지태반 추출물을 처리한 후 RT-PCR 을 통하여 세포부착(Cell adhesion) 및 세포접합(Cell Junction) 유전자인 JUP (Plakoglobin), DSP (Desmopla- kin)

발현을 확인하였지만 변화를 관찰 할 수 없었다. 그 외에 섬유화 과정에서 콜라겐 생성을 증가시키는 역할로 알려진 HSP47 (Heat shock protein 47)

발현은 큰 변화 를 확인할 수 없었으나, 열과 산화 스트레스(Stress) 지표이 며 방어기작 지표인 HSP70

(Heat shcok protein 70)은 처 리군에서 대조군과 비교하였을 때 유전자 발현이 감소되는 양상을 관찰 할 수 있었다. 이를 통하여 돼지태반 추출물은 세포부착과 콜라겐 합성 증가에는 영향을 주지 않고, 열과 산화 스트레스 등을 억제하는 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

또한 세포 창상 치유능 시험을 통해, 돼지태반 추출물이 섬유아세포의 이동을 좀 더 원활하게 함으로써 상처치유 시간을 줄여줄 것으로 볼 수 있었다.

화상 후유증 중 색소침착과 관련된 멜라닌 함유량 측정 시험에서는 대조군 대비 23% 멜라닌 합성 억제 효능을 나 타내어 돼지태반 추출물이 멜라닌 합성을 억제함으로써 색 소 침착을 완화시키는데 도움을 줄 것으로 생각한다.

결 론

태반추출물은 상처치유 또는 화상에 대한 여러 효능이

보고되어 왔다. 성장호르몬, 싸이토카인 등의 발현 증가로

상처치유를 촉진하고 접촉성피부염 등의 질환에도 효과가

있다고 알려져 있다. 하지만, 본 연구에서는 화상을 입은 후

오게 되는 문제점 중 비후성 반흔 등의 피부이상증상과 관

련하여 돼지태반의 효능이 비교적 알려지지 않아 이를 분

자생물학적으로 증명해보고자 하였다. 피부세포를 이용하

여 분석한 결과, 항산화 효과, 멜라닌 합성 억제, 창상 치유

효능 및 a-SMA와 P311 유전자 발현이 감소되는 현상을 확

인하였다. 이는 돼지태반 추출물이 화상치유과정 중 재형 성 과정에서 비후성 반흔과 관련된 피부이상현상을 억제하 는 효능과 화상 후 피부 개선을 위한 유효성이 있음을 말해 준다. 화상피부에 발생하는 비후성 반흔 등의 증상에 돼지 태반 추출물을 사용할 경우 임상적인 효과를 볼 수 있을 것으로 기대한다.

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