토끼 좌골 신경 분절 결손 후 신경도관 내에서의 재생과정 중 혈소판 유도 성장인자의 역할
가톨릭대학교 의과대학 성모병원 정형외과학교실
이정호∙이상명∙박재철∙이정한∙최기범∙이승구
목 적: 토끼 좌골 신경 분절 결손 후 신경 도관 내에서의 재생 과정 중 인간 재 조합형 혈소판 유도 성장인자가 신경 재생에 미치는 효능과 신경도관으로써의 Goretex tube의 임상사용 가능성을 알아보고자 하였다.
대상 및 방법: 24마리의 토끼 좌골 신경을 12 mm 분절 결손 시킨 후 Goretex tube로 연결시키고, recombi- nant human PDGF (0.25 mg/kg)를 collagen과 혼합하여 주입한 후 9주간 경과 관찰 하여, 단순 collagen 만을 주입한 대조군과 근전도 및 조직화학적 검색을 하였다.
결 과: 실험 초기 근전도상 하퇴부 비복근 활동전위의 원위 잠시와 진폭은 양군간 큰 차이가 없었으나, 실험 5주 이후 PDGF 투여군에서 신경 재생에 따른 개선 효과가 컸으며, 조직학적으로도 초기 신생혈관 증식은 물론 신경 초세포나 섬유모세포와 같은 비신경 세포들의 증식과, 실험 말기 이들 세포들에서 축삭돌기로의 세포분화가 관찰 되었다.
결 론: Goretex관은 신경도관을 이용한 인공신경으로 사용할 수 있으며, 광범위 신경손상시 인간 재 조합형 PDGF의 투여는 재생된 축삭돌기의 성숙과정에 크게 기여함을 알 수 있었다.
색인 단어: 좌골 신경, 분절 결손, 신경도관, 인간 재 조합형 혈소판 유도성장인자
The role of Platelet Derived Growth Factor (PDGF) on nerve regeneration in segmental defect of
rabbit sciatic nerve into Nerve Conduit
Jung-Ho Lee, M.D., Sang-Myung Lee, M.D., Jae-Cheol Park, M.D., Jung-Han Lee, M.D., Ki-Bum Choi, M.D., Seung-Koo Rhee, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, St. Mary’s Hospital, Catholic University Medical College, Seoul, Korea
Purpose: To investigate the role of recombinant human PDGF on the regeneration of the 12
mm of sciatic nerve gap in 24 rabbits and the possibility of clinical use of Goretex tube as an arti- ficial nerve conduits.Materials & Methods: The gap was coapted with 16 mm in length and 3 mm in width of
� Address for Correspondence: Seung-Koo Rhee, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, St. Mary’s Hospital, Catholic University Medical College, 62, Youido, Yong Deung Po-ku, Seoul 150-713, Korea
Tel : 82-2-3779-1192, Fax : 82-2-783-0252, E-mail : [email protected]
머리말
손상된 신경의 재생은 정상 신경원(mature neuron)들은 재생되지 않는 점에서 매우 힘들다.
그러나 적절한 환경이 제공되면 근위 신경 절단단 축삭이 신장되어 손상된 부위의 간격을 메우고, 궁 극적으로 원위 신경단으로 다시 연결되어 본래의 신 경 기능을 어느정도 회복하게 된다
일반적으로 신경손상에 대한 봉합술시 봉합부위 에 긴장만으로도 섬유성 유착이나 신경종이 형성되 고28), 신경 결손의 길이가 15 mm이하인 경우는 신 경단에 긴장 없이 일차 단순 신경봉합이 가능하다.
그러나 신경 결손이 15~50 mm인 경우에는 상하 신경단을 주위 조직으로부터 분리시켜 길이를 얻거 나 또는 장관골을 단축하는 방법 등으로 봉합부위의 긴장을 줄여야 하며, 특히 50 mm이상 결손된 경우 에는 반드시 신경이식을 하여야만 신경의 재생을 기 대할 수 있다9). 그러나 신경이식을 하여도 이식된 신경절편은 살아있는 조직이 아니라 변성 과정을 밟 아 신경재생의 통로로서의 구조적 역할 밖에 할 수 없고, 공여부위 감각 둔마 등의 후유증은 물론 신경 이식 후 임상결과도 저조한 것으로 알려져 있다9). 따라서 광범위 신경결손이 있을 경우에 신경 대치물 로서 silicone chamber, 변성근육, 동맥, 정맥 및 신경도관(Goretex관)등을 이용한 인공신경(arti-
ficial nerve guide)이 유망한 대체수단으로 많은 시도가 있고, 이러한 신경대치물의 평활한 통로 내 에서 재생 신경단이 스스로 자기 방향을 찾아 성장 하도록 유도(guidance theory)한다고 알려져 있 다22). 이 중 신경도관으로 사용되는 Goretex관은 조직액이 침투할 수 있는 micropore를 갖고 있으 며, 면역학적으로 안전하고 탄력성이 있어, 인조인 대(artificial tendon)나 인조혈관의 재료로 널리 이용되고 있다. 이러한 도관은 내부가 비어있는 상 태로 이식되거나 성장인자, 골수기질세포 또는 섬유 성 물질 등으로 채워져 이식될 수 있다.
1951년 Levi와 Hamburger23)에 의하여 신경 손 상시 원위단에는 근위단에서 축삭의 재생을 유도하 는 신경 성장 인자(nerve growth factor, 이하 NGF)가 존재하고 있음이 처음 보고된 바 있고, 이들 중 혈소판 유도성장인자(platelet derived growth factor, 이하 PDGF)와 염기성 섬유모세포 성장인 자(basic-Fibroblast Growth factor, 이하 b- FGF)는 강력한 맥관 형성 인자일 뿐 아니라 섬유모 세포, 혈관내피세포, 말초 및 중추신경 교외세포 (glial cell)등을 분화, 증식시키는 분열 유발인자 (mitogen)로 알려져 있다6,8,14,16). 특히 PDGF는 1974년 Kohler와 Lipton20), Ross 등32), 1976년 Westermark와 Wasteson 등34)이 섬유모세포, 근 세포, 및 신경교외세포들의 혈청성장인자(serum
Goretex tube, filled with collagen (group I) and recombinant human PDGF, 0.25 mg/kg (group II) mixture in each 12 rabbits. All the animals were followed up for 9 weeks after surgery, and every 3 rabbits in each group at 3, 5, 7 and 9th week were examined with EMG on affected gas- trocnemius muscle, followed by sacrifice the animal for histologic examinations.
Results: There was no significant differences between the two groups in the amplitude and dis- tal latency of evoked muscle action potentials in early stage but a bit improved in later. There are apparently good effect of PDGF to enhance motor nerve regeneration.
Conclusion: The Goretex tube can be used for one of good nerve conduits, and the recombi- nant human PDGF in neural damage might act to increase the number of new blood vessels and to proliferate the non-neuronal cells at the early stage of experiment, and also to mature the regenerating axon at the end of experiment.
Key Words: Platelet derived growth factor, Goretex tube, Nerve gap, Nerve conduits
growth factor)로 분리 보고한 이래, 1982년 Johnsson 등19)이 PDGF-A와 B의 2개의 다른 다 당류 chain이 있음을 밝힌 후, PDGF family는 PDGF-AA, PDGF-AB와 PDGF-BB의 3가지 단백질로 구성돼 있음이 알려졌다15). 이후 2개의 다 른 유전자 및 단백질로 구성된 PDGF-C24)와 PDFG-D21)가 추가 확인되었고, 최근에는 PDGF 유전자들과 구조나 기능적으로 극히 유사한 동일 성 장인자인 혈관내피 성장인자(vascular endothe- lial growth factor, 이하 VEGF)가 알려져 있다13). 따라서 최근 배아와 성체의 뇌신경에서 가장 많이 발현되는 PDGF의 맥관형성, 섬유모세포, 혈관 내 피세포와 신경교외세포 등을 분열 증식시키는 (fibroblast mitogen) 기능으로, 임상적으로 glioma, sarcoma, leukemia, epithelial can- cer는 물론 망막신경병변, 폐 및 심장섬유증 등에서 PDGF의 과잉 활성화가 발견되며, 이들의 치료로서 PDGF의 기능억제나 촉진(PDGF pathway- inhibitory or stimulatory drugs)에 대한 연구 가 활발하다3,6,16).
최근 Goretex나 silicone관을 이용한 말초신경 분절결손에 관한 실험이나 b-FGF가 신경재생에 관여한다는 실험은 있으나22,33), PDGF가 말초신경 분절결손의 재생과정 중 어느 시기에 어떤 역할을 하는 지 신경 재생관련 기전에 관하여는 잘 알려져 있지 않다. 이에 저자들은 토끼에서 12 mm의 좌골 신경 분절결손을 만들고 Goretex관으로 연결시킨 후 관내 주입된 gel 형태의 재조합형 인간 PDGF가 어떠한 역할로서 신경재생에 영향을 주는가와, 인공 신경 도관으로써 Goretex 관의 임상에서의 사용 가능성을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재료
실험동물로는 체중 1.5~2.0 kg의 성숙한 집토끼 24마리를 사용하였으며, 실험 일주일 전부터 동물 사육실에서 주변환경에 적응시키고 시판 혼합사료 만으로 동일한 조건하에서 사육하였다.
2. 방법
실험동물에서 말초신경의 자연재생의 한계인 12 mm 신경결손을 토끼에서 만든 후 상하 신경단을 Goretex관과 연결 밀봉하고 I군(PDGF 비투여 대 조군, 12마리)과 II군(PDGF 투여군, 12마리)으로 나누어 3,5,7 및 9주에 각각 3마리씩 관찰하였다.
대상신경은 우측 좌골 신경만을 사용하되, 근전도 검사는 결과의 비교를 위하여 좌측 좌골신경도 측정 하여 정상 대조값으로 하였다. 따라서 PDGF 투여 군 은 재 조 합 형 인 간 PDGF (recombinant human PDGF(이하 PDGF); AMGEN Thousan Oaks. CA 91320-91789) 0.25 mg/kg를 제1형 collagen (Vitrogen100, Celtrix Lab, Palo Alto, California)과 일정비율로 혼합하여 gel형 태로 투여하였고, 비투여군은 collagen만을 투여하 였다. 모든 용액은 pH 7.5로 교정하였고 4�C에서는 액체상태이나, 실온 및 체온에서 약 60분이 경과하 면 gel상태로 되었고, Goretex관내에서는 일률적 으로 약 3 ml용량의 collagen(1군) 또는 PDGF가 혼합된 collagen(II군)이 주입되었다.
실 험 방 법 은 24마 리 토 끼 의 좌 측 대 퇴 부 에 Ketamine 125 mg/kg을 근육내 주사하여 전신 마 취시키고, 노출된 좌골신경은 좌골 절흔(sciatic notch)의 5 mm 하방에서 신경절제 후 절제한 신 경단이 견인되는 것을 방지하고 실험 후 추적이 용 이하도록 유지봉합(stay suture)을 하고 12 mm의 좌골신경을 분절 절제하였다. 이후 직경 3 mm, 길 이 16 mm의 Goretex관에 근위 및 원위 신경단을 각각 2 mm씩 삽입 후 6-0 mersilene으로 상하단 의 Goretex관과 신경외막을 수술확대경(loupe, Germany,x4)을 이용하여 연속 봉합하였다. 이후 Goretex관 상하단을 fibrin glue로 밀봉하고, I군 12마리에서는 collagen을, 그리고 II군 12마리에 서는 PDGF가 섞인 collagen을 관내 주입하여 실 험을 완료하였다(Fig. 1).
3. 관찰
실험동물들은 실험 후 매일 gentamycin 20 mg
씩을 4일간 근육 내 주사하여 수술창의 감염을 방지 하였고, 외고정 없이 사육하였다.
1) 육안적 관찰
실험 후 관찰시까지 매일 좌골신경 마비 및 재생 에 따른 족장부 욕창 발생 및 치유과정을 관찰하였 다. 또한 보행시 족관절을 포함한 하지의 상태와 족 부를 forceps로 자극시켰을 때 하지의 운동성 여부 를 정상측과 비교하여 감각 및 운동기능의 회복 정 도를 근력평가법(muscle grading method)에 따 라 육안적 관찰을 하였다.
수술 후 3,5,7 및 9주에 I, II군 공히 3마리씩 근전 도 검사를 시행하였고, 그 후 희생시켜 조직검사를 시행하였다.
2) 근전도 검사
토끼를 Ketamine마취 하에 복와위로 고정 후 수 술한 좌골신경을 좌골공(sciatic foramen)으로부 터 Goretex관까지 노출시키고 활동기록 전극은 침 전극(CADWELL 7400 Lab., Kennewick, WA) 을 경골 결절의 1 cm 하방의 비복근에, 표준기록 전 극은 발등에 삽입하였으며, 접지전극은 대퇴부의 피 하에 삽입하였다. Goretex관 근위부(활동기록 전
극에서는 근위 6 cm)의 좌골신경을 쌍전극으로 초 당 1회의 비율로 최대 상 자극(supramaximal stimulation)하여 비복근에서의 복합근 활동전위 의 원위잠시(distal latency)와 진폭(amplitude) 을 측정하였다. 또한 결과 비교를 위하여 좌측 좌골 신경의 근전도를 측정하여 정상 대조값으로 하였고, 모든 측정치는 평균±표준편차로 표시하였다.
3) 조직학적 관찰
각군의 희생 동물은 유지 봉합부와 Goretex관을 중심으로 상하 약 20 mm의 좌골신경을 절취하였으 며, 이때 Goretex관 내외의 신경 재생여부와 상하 신경단에서의 신경종의 발생여부를 육안 관찰하였 다. 또한 좌골신경의 정상적인 형태, 축삭의 수 및 해부학적 변화를 비교 관찰하기 위하여 반대편 좌골 신경의 근위부에서 약 10 mm길이의 정상 신경절편 도 채취하였다. 절취한 신경절편은 미세 수술가위로 도관의 한 면을 종절개하여 고정액이 잘 스며들도록 한 후 10% formalin액에 고정하고 다시 파라핀에 포매하여 6 um두께의 조직박편을 만들었으며, 신 경 주위 조직들의 일반적인 변화과정과 신생혈관의 수 등을 관찰하기 위하여 hematoxylin-eosin 이 중 염색을, 그리고 유수화 축삭돌기 수 및 비신경세
Fig. 1. Schematic drawing of the experimental proce- dure for injecting PDGF.
After putting the cutting ends of the sciatic nerve into the Goretex tube, the tube was fixed with stay sutures and sealed off with continuous suture and fibrin glue. The collagen with (Group II) or without (Group I) PDGF was injected in semi-liquid form.
(FG: fibrin glue, SS: stay suture, PS: proximal nerve. segment, DS: distal nerve. segment)
Fig. 2. Nerve regeneration at cut end of rabbit sciatic nerve showing good cuffing effect of Goretex tube (arrow) and filled with non-neuronal fibrous tissues into artificial nerve conduit (Goretex) at the 3rd week of group I (non- PDGF), HE, X40.
포(non-neuronal cell)등 신경자체의 변화를 관 찰하기 위하여는 조직의 이염색성(metachroma- sia)검색을 위한 toluidine blue (pH 2.5)염색을 하였다. 재생된 유수화 축삭의 수효 측정은 절제된 좌골신경 중간부위 전체를 400배의 고배율로 여러 장에 촬영한 후 계측 평균하여, Student-T test로 검정하였다.
결 과
1. 육안적 관찰
총 24마리 중 I군 6마리, II군 4마리 등 10마리 (41.7%)에서 실험 첫 3주 사이에 하지 마비 및 철창 에 긁혀 족장부에 궤양이 발생하였으나, 실험말인 9 주경 거의 자연 치유되었다. 통증의 감지 및 운동기 능의 회복은 술 후 6주경부터 양군에서 관찰되기 시 작하였으며 실험 9주에 forceps로 발등을 자극하였 을 때 발목을 움츠리는 정도의 근력평가상 불량이상 으로 회복된 것이 I군은 5예(41.7%), 그리고 II군은 8예(66.7%)였다. 양군의 시기별 실험부위 관찰에서 양군 모두 이식물이 잘 생착되어 있었으며 주위 조 직과의 유착은 경미하여, 양 군사이의 차이를 관찰
할 수 없었다. Goretex관은 양측 신경 절단단과의 연결부에서 양호한 cuffing effect를 보여(Fig. 2) 신경조직들이 Goretex관내로만 자라 들어감으로 써 관밖에서 신경종은 형성되지 않았다(Fig. 3, 5주 군). 또 신경간격의 전장에 걸쳐 경미한 염증성 세포 들의 침윤 외, 주위 연부조직으로부터 섬유조직의 침윤(extraneural fibrosis)소견도 거의 없어 Goretex관은 주위조직과의 유착보호는 물론 신경 절단단의 신경종 형성을 예방하는 효과가 있는 것으 로 판단되었다(Fig. 2, 3, 6).
실험말, 미세 수술가위로 Goretex관을 종절개 하였을 때 정상과 같은 연미색의 재생 신경조직을 관찰할 수 있었고 그 중간부위는 I군이 직경이 2 mm정도로 잘룩하였으나, II군은 정상 좌골신경 굵 기와 비슷한 그리고 Goretex관내에 꽉차게 약 3 mm직경의 재생 신경조직을 관찰하였다(Fig. 4).
2. 근전도 검사
1) 원위 잠시는 정상에서 평균 0.82±0.15 msec 였으며, 전 실험기간 중 I군의 평균 1.34±0.10 msec와 II군의 평균 1.02±0.24 msec와는 유의하 게 차이가 컸다. 그러나 PDGF 투여II군의 실험 7
Fig. 3. Normal rabbit sciatic nerve
A1-A2 : longitudinal section, HE (A1), Toluidine blue stain (A2)×100 B1-B2 : cross section, HE (B1), Toluidine blue stain (B2)×100
A1 A2
B1 B1
주군(0.81±0.09 msec)이후 부터는 정상치와 차이 가 없었으며, 또한 실험 5주 이후의 II군(1.18±
0.84 msec)은 I군(1.40±0.03 msec)보다 매우 유 효하게 작았다(P<0.01). 따라서 실험 7주 이후의 PDGF효과는 실험 5주 이내에서의 효과보다 매우 유의하게 컸다(P<0.01) (Table 1).
2) 진폭은 정상에서 평균 86.06±0.15 mv로 I군 의 평균 33.06±11.58 mv와 II군의 평균 42.99±
10.96 mv보다 매우 유의하게 컸으며(P<0.01), PDGF 비투여군보다 투여군이 매우 유의하게 컸다.
또한 PDGF 투여군중 7주군 이후는 5주군 이하나 전체 비투여군에 비하여 매우 유의하게 증가하여, PDGF투여는 시간이 진행되면서 진폭의 개선에 큰 효과를 나타내었다(Table 1).
3. 조직학적 관찰
1)일반적 조직변화
정상토끼의 좌골신경은 연미색을 띄고 직경은 3mm정도였으며, 조직학상 유수화 축상의 수효는 평균 6,600±199개였다(Fig. 1, Table 2).
실험 3주에 Goretex관내에는 fibrin기질인 jelly양의 섬유질이 차 있었으며(Fig. 2, 4, 5), 실험 5주경에는 관의 내벽쪽으로는 단핵세포 및 임파구, 드물게 거대세포들과 같은 염증세포가 있었으며 관 의 중 앙 부 에 는 섬 유 모 세 포 들 과 신 경 초 세 포 (Schwann cell)등이 산재되어 있었다. 이후 실험 말기에 관내벽으로는 섬유성 결체조직들이 그리고 관의 중앙에는 섬유모세포나 신경초 세포 등에서 분
Table 1. Muscle action potential in EMG (mean±SD)
Group Distal latency (msec) Amplitude (mv)
3W 5W 7W 9W Av. 3W 5W 7W 9W Av.
Normal 0.84 0.80 0.83
0 0.81
0 0.82 88.43 82.20 87.31
0 86.30
0 86.06
±0.11 ±0.30 ±0.02 ±0.18 ±0.15 ±0.11 ±0.30
0 ±0.02
0 ±0.18
0 ±7.63 Group I 0
1.46 1.40 1.240 1.250 1.34 26.47 31.30 33.270 40.210 33.06 (Non-
±0.15 ±0.03 ±0.12 ±0.08 ±0.10 ±9.82 ±10.40 ±12.04 ±14.07 ±11.58 PDGF)
Group II 1.4.
0 1.18 0.81* 0.91* 1.02 22.42 30.40 48.20� 58.02� 42.99 (PDGF) ±0.03 ±0.84 ±0.07 ±0.02 ±0.24 ±3.06 ±9.24
0 ±6.23
0 ±12.31 ±10.96
*: P<0.05 vs. group I
�: P<0.01 vs group I
Table 2. Number of myelinated axons and blood vessels at the mid-cross section of the regenerated nerve (mean±SD)
Group No. of myelinated axons No. of new blood vessels
3W 5W 7W 9W 3W 5W 7W 9W
Normal
6,600±199 19.4±11
(n=10)
Group I (-) 2,792 4,278 4,391
11.3±12.8 20.7±17.6 24.7±9.6 28.2±13.4
(non PDGF) ±176 ±12 ±101
Group II (-) 3,119 6,078* 5,979*
62.4±11.0� 83.3±11.0� 76.3±8.9 73.7±11.6�
(PDGF) ±162 ±147 ±243
*: P<0.05 vs. group I
�: P<0.01 vs group I
화되었을 것으로 추정되는 재생된 축삭들이 많이 관 찰되었다(Fig. 4, 5).
특히 I군에서는 이러한 세포분화 등이 II군에서 보다 5주경 현저히 지연되어, 세포배열도 성글고
Goretex관의 중앙부위가 잘록해진 소견을 보였다 (Fig.4). 반면 II군은 실험 5주와 7주경 세포배열도 Goretex관내에 꽉 차있었고 세포분화도 5주경부터 잘 이루어져 있었다(Fig. 5).
Fig. 4. Regenerating sciatic nerve in nerve conduit (Goretex), longitudinal section, HE (×100)
A1-A2 : group I (non-PDGF) at 5th (A1), 9th (A2) week, B1-B2 : group II (PDGF) at 5th (B1), 9th (B2) week
; Jelly like fibrin and non-neuronal fibrous tissues are filled into the tube at the 5th week of both experiment groups but numerous fibroblasts and Schwann cells are shown at the 9th week, much more in group II.
A1 A2
B1 B1
Fig. 5. Regenerating sciatic nerve in nerve conduit (Goretex), cross section, HE (×100)
A1-A2 : group I (non-PDGF) at 5th (A1), 9th (A2) week, B1-B2 : group II (PDGF) at 5th (B1), 9th (B2) week
; Newly formed blood vessels are increased, non-neuronal cells and regenerating axons are also proliferated and matured at the late stage of experiment in group II than in group I.
A1 A2
B1 B1
2) 유수화 축삭돌기의 수효
실험 3주에 양군 공히 유수화 축삭돌기는 발견되 지 않았고, 신경초 세포, 섬유모세포 및 염증세포와 같은 비신경세포가 Goretex관 내에 산재되어 있었 다(Fig. 4, 5). 실험 5주에는 재생된 유수화 축삭이 많이 관찰되었는데, I군(2,792±176개)과 II군 (3,119±162개)사이에 유의한 차이가 없었다. 반면 7주군에서는 II군(6,078±147개)에서 I군(4,278±
123개)에서 보다 매우 유의하게 많았고, 정상군 (6,600±199개)과는 비슷하였고, 9주군의 결과도 같았다(Table 2).
3)신생 혈관의 수효
신생혈관의 수효는 실험 전 기간을 통하여 I군에 서는 정상군(19.4±11개)과 비슷하였으나, II군에 비하여는 4배 이상 매우 유의하게 적었고(P<0.01), II군에서는 실험초기인 3주경부터 현저히 증가된 신생혈관(62.4±11.0)이 일정한 수효를 유지하여 (Table 2), PDGF의 투여가 신경 재생초기에 급격 한 혈관증식을 유도하여 실험말까지 계속되는 것으 로 판단되었다(Table 2, Fig. 5).
이상의 실험 결과들은 신경 분절결손의 재생시 PDGF의 투여는 조직학적으로 실험 초기에 신생혈관 증식은 물론 신경초 세포나 섬유모세포들의 증식에 관 여하며, 실험말기에는 이들 세포들에서 축삭돌기로의 세포분화와 성숙과정에 기여하는 것으로 판단된다.
고 찰
말초신경이 심한 좌상이나 분절 결손이 있는 경우 에는 무리하게 일차 신경봉합을 하여 봉합부위에 긴 장을 주어 신경종의 발생 가능성을 높이기 보다는 신 경초 세포의 활성도가 손상후 최고에 달하는 2~3주 후에 이차적 신경복원술이 권장되고 있다7). 신경 복 원의 목적은 손상 후 신경 변성으로 인해 야기된 원 위부의 신경절 손실을 대체하여 목적 장기의 신경지 배를 허용하여 본연의 사지 기능을 회복하는데 있다.
그러나 단열된 신경단이 상하로 심하게 마모 견인되 어 있거나 또는 절단단의 신경종을 제거하고 봉합할 경우 등에서는 신경 결손부위가 커져 현재까지는 주 로 자가 신경이식술을 시행하게 된다. 신경이식시에 는 이식된 신경절편이 살아있는 조직이 아니라 일단 변성과정을 밟아 신경재생의 통로로써의 역할을 담 당하게 되는데, 이식된 신경내의 신경 내막관 (endoneurial tube)이 근위단에서 자라 내려온 축 삭들이 원위단으로 잘 향하도록 도관 역할을 하고 또 이식된 절편에 있는 신경초 세포가 살아있다가 근위 단에서 자라 들어온 축삭과 만나면 성장 촉진물질들 을 분비하여 신경재생(axon triggered prolifera- tion)을 촉진시킨다18,27). 그러나 이러한 자가 신경이 식법은 이식신경이 제거된 부위에서 발생하는 본연 의 신경기능 상실과 통증을 유발하는 신경종의 생성, 제공신경과 수여 신경간의 크기 차이 및 절단단의 간 격 등 조직 상이성 등의 문제점이 있을 수 있어 이식 수술로 재생된 사지 기능은 불완전하게 된다11).
이런 신경이식시의 문제점을 해결하기 위하여 신 경도관(nerve conduit)으로 알려진 인공신경 (artificial nerve guide)을 이용하여 신경결손 사 이를 연결하는 가교(bridge) 역할과, 도관내 b- FGF, PDGF 또는 IGF 등의 성장인자, 변성근육 (degenerated muscle)12)또는 증식된 골수기질세 Fig. 6. Schematic nerve regeneration in artificial nerve
conduit (Goretex tube).
포(bone marrow stem cell)10)등을 충진시켜 정 상 신경으로 재생시키는 연구가 지속되어 왔다. 이 러한 인공신경 도관을 이용한 신경결손의 치유과정 은 Fig.6과 같으며, 저자들은 이 도관내에 신경재생 촉진을 증폭시키고자 Fig. 1 에서와 같이 PDGF를 충진 주입하여 성장인자인 PDGF의 말초신경 재생 에 관한 역할을 확인하고자 하였다.
이상적인 신경 대치물의 조건으로는 절단된 근위 신경단에서 재생된 축삭이 대치물 내를 통하여 원위 단으로 향하는 통로 역할을 할 수 있어야 하고, 주위 로부터 육아조직의 침투를 방지하고, 신생 혈관들이 나 조직액들이 대치물 내로 쉽게 침투할 수 있는 micropore를 갖고 있어야 하며 또한 면역학적으로 안정되고, 어느 정도의 탄력성이 있어야 한다. 이러 한 신경 대치물들은 모양과 크기 및 길이 등을 자유 롭게 선택할 수 있어 주로 동맥, 정맥과 silicone chamber등이 임상에서 사용되고 있으며, 그 외 1986년 Fawcett와 Keynes12)에 의해 변성 골격근 을 신경대치물로 이용한 실험결과도 보고되었다.
본 실험의 Goretex관은 양측 연결부위의 봉합사 주위에 재생된 축삭이 연결부 밖으로 나가지 않아 Goretex관이 cuffing의 역할을 충분히 한 것으로 보이며(Fig. 2, 3, 4), 그 외 조직학적으로도 포식성 대식세포가 간혹 관찰되었으나 심한 염증성 변화는 관찰되지 않아 이식된 Goretex관은 신경 대체물로 써 이상적인 것으로 판단되었다.
신경손상시 재생되는 축삭의 성장유도에 관하여 는 현재까지 향신경성(neurotropism), 접촉유도 (contact guidance), 화학 및 기계적 인자 (chemical and mechanical factor)들이 알려져 있으며, 또한 1982년 Lundborg26)의 쥐를 이용한 실험에서 탈신경상태의 원위 신경 절단단이 근위부 에서의 재생 축삭의 방향과 성장을 유도한다는 보고 등은 본 실험의 Goretex관 이식과 같은 신경 대치 물이 접촉유도(guidance theory)를 통한 신경 간 격재생에 필수적임을 알려준다고 하겠다.
즉 본 연구에서와 같이 실험 I군에서의 신경간격 의 재생은 축삭들이 Fig. 2의 도해에서와 같이, 주 로 Goretex관의 중앙을 따라 재생되며, 관 내막을 따라서는 염증세포들과 결체조직들이 생성되다가
실험 5주부터는 지방조직으로 대치되어 신경간격의 중앙 재생부위가 잘록하게 좁아짐이 관찰되었고, 이 러한 현상은 신경결손의 길이가 길어질수록 심화될 것으로 판단되었다(Fig. 4, 6).
I군 실험 초기에 신경간격 사이의 Goretex관내 에는 fibirin기질로 꽉 차 있었으며, 조직학상 관의 중앙부위에서는 섬유모세포들과 신경초 세포들이 관찰되었으며, 또한 실험말기에는 관의 내벽을 따라 서는 섬유성 결체조직이 그리고 관의 중앙에는 섬유 모세포나 신경초 세포들에서 분화되었을 것으로 추 정되는 재생된 축삭이 관찰되었다(Fig. 4, 5). 1987 년 Achparaki-Alvanou 등2)은 신경이 재생되는 데에는 신경초 세포와 섬유모세포의 역할이 중요하 며 신경봉합 후 24시간이 지나면 절단된 축삭의 조 기변성과 함께 섬유모세포들이 침투되고 1주후에는 신경초 세포의 세포질 내에 많은 수포가 보이며, 재 생되고 있는 축삭들이 관찰되고, 이후 6주경에는 신 경재생이 끝나 정상상태와 비슷하게 된다고 하였다.
본 실험에서도 실험초기에 Goretex내의 신경 간격 사이에 고이는 fibrin기질에 섬유모세포와 신경초 세포들이 나타나고 실험 전과정을 통하여 관 중앙으 로만 축삭들이 재생되는 것을 관찰할 수 있었다. 그 러나 신경손상 초기에 나타나는 이들 세포 성분외에 원위 신경단이나 주변 연부조직에서 분비되는 것으 로 알려진 gangliosides, fibronectin, collagen, PDGF, FGF, laminin이나 insulin-like growth factor (IGF)와 같은 NGF나 target derived neurotropic factor (TDNF)등 고유인자들의 존 재와 역할규명에는 아직 분자생물학적 연구단계에 있다1,3,6,8,12-16,19-22,24,26-27,30,32,34,35)
.
튜브 형태의 인공 신경 도관 내에 fibrin이나 collagen 또는 laminin 을 함유한 gel등을 충진시 키면 비어있는 도관에 비해서 말초신경의 재생이 증 진되며 아울러 축삭 재생에 있어서도 좋은 영향을 미친다는 보고가 있다27,35). Labrador 등21)은 쥐에 실리콘 도관 내에 I형 콜라겐, laminin, 히아루론산 및 피브린을 미리 채워 이식한 결과, 낮은 농도에서 의 laminin과 콜라겐 겔을 충진 한 경우 신경 재생 이 촉진되었으나, 이들 결과는 자가신경이식에서 보 다 신경 재생율이 50%, 재생된 축삭의 수는 정상 신
경의 25% 정도였다고 하였다7). 즉 축삭이 긴 신경 결손부위를 통과하여 재생하는 데는 도관의 외인성 충진물의 구조, 밀도 및 성분 조성들이 중요하다.
최근 PDGF 는 조골세포(osteogenic cell)를 포 함한 기질세포들(mesenchymal cell)의 증식작용 과 혈관형성(angiogenesis)등의 기능을 이용한 골 절치유, 골이식 등에는 물론 골다공증, 당뇨와 담배 등으로 약화된 조골세포(osteoprogenitor cell)의 활성화에 많이 사용되며16), 특히 신생혈관의 생성기 능에 대하여는 빨리 자라는 악성암의 신생혈관형성 억제를 위한 anti-PDGF 연구가 활발하다6). 또한 PDGF의 중추 및 말초 신경내 교원세포 성장과 신 경보호 기능에 대하여는 2008년 Cao 등6)이 중추신 경과 신경세포체(neuronal cell body)에서 PDGF-A가 neuron 및 astrocyte에서 분비되며, Aase 등1)은 PDGF-C가 성인 중추신경의 발달에 극히 중요하며, 그 외 Gerhardt 등14)은 PDGF-A 와 PDGFR-α가 망막신경세포(retinal astro- cyte)의 기능 조절을 하여 PDGF-A가 부족하면 retinal hyperplasia를 유발한다고 하였다. 또 축 삭 재생의 속도는 손상된 종류, 손상의 정도, 표적기 관 사이 즉 신경 간격의 거리 및 실험동물의 나이와 종에 따라 차이가 있으며, 단순파열에 의한 Waller 변성 시 신경섬유가 유수축삭이나 무수축삭에 관계 없이 하루 1~2 mm재생된다고 한다31). 1981년 Muller 등30)은 laminin을 관내 주입하여 실험 16 일경 유수화 축삭돌기가 근위부 3 mm까지 자란 것 을 보고하였으나, 본 실험에서는 양군 공히 3주군에 서까지 유수 축삭돌기가 관찰되지 않았으며, 이는 PDGF가 laminin의 신경재생에 대한 효과보다 약 하기 때문인 것으로 추정된다. 본 실험에서도 실험 I 군에서는 실험7주에, 실험 II군에서는 실험 5주경 형태학적으로 정상 신경의 굵기에 도달한 것으로 보 이나, 그 기능 회복 정도를 알기 위하여는, 비록 본 실험에서는 수회 측정하였으나, 동물 실험상 근전도 측정 기술상의 어려움과 측정 결과의 차이가 커 인 용할 수 없었으나, 향후 재생된 신경의 신경 전도속 도(nerve conduction velocity)등을 측정하는 것 이 필요하리라 생각된다. 본 연구에서 주기적으로 실시한 근전도상 PDGF투여군과 비투여군의 원위
잠시와 진폭은 모두 7주경에서 큰 차이를 보였는데 이는 PDGF투여가 신경재생의 실험초기에 영향을 주는 것으로 조직학적 재생의 정도와도 일치하였다.
그러나 이러한 사실은 5 mm신경간격에 PDGF의 투여결과에서 원위잠시와 진폭이 통계적 유의치가 없었다는 Cordeiro 등8)의 결과와는 달랐는데 이는 PDGF의 신경재생에 대한 효과차이로 보여진다. 비 신경세포수는 I,II군 모두에서 3주보다 5주에서 심하 게 감소하였음이 관찰되었는데 이는 신경초 세포의 감소가 아니고 재생축삭의 증가에 따른 섬유모세포 와 염증세포의 감소 때문인 것으로 풀이된다. 그러나 혈관의 수는 PDGF투여군에서 비투여군보다 크게 증가하였으며 각각 3주와 5주에서 모두 PDGF의 혈 관형성 효과가 컸다. 그러나 II군의 7주와 9주의 비 교에서는 그 수가 크게 변하지 않아 일단 자라 들어 온 혈관이 수적으로 줄어들지는 않는 것으로 보였다 (Table 2).
1987년 Williams 등35)도 재생된 신경조직의 직 경이 1주에 가장 크고 이후 계속 적어진다 하였으 며, 이는 신경손상 혹은 silicone tube 수술 후 형 성된 fibrin기질의 경화(consolidation)에 의한다 고 하였다. 그러나 신경절단 후 4~5개월에 신경섬 유의 직경은 정상화 된다고 하며4), 본 실험에서는 실험 9주경 I군의 관내 재생신경의 중간부위가 잘록 하게 좁아져 있는 반면, II군에서는 중간부위가 관 내 꽉차게 재생되어 있었다. 이는 PDGF가 신경손 상 초기에 급격한 신생 혈관증식과 섬유모세포들의 증식 및 분화에 크게 작용한 이유인 것으로 판단되 었으며, 이러한 본 실험의 결과는 PDGF의 신경세 포에 대한 직접효과는 유수 축삭 및 신생혈관의 증 식으로 알려져 있으나 그 작용시기는 알 수 없다고 하며 통계적 의미도 없다고 한 보고8)와는 그 결과가 달랐다. 또한 임상적으로 신경절단이나 결손시 즉각 적 봉합이나 신경이식 등으로 신경의 연속성을 손상 초기에 유지시켜 재생과정을 거치지 못하여, 신경손 상 후 2~3개월 이상 경과시에는 손상신경의 신경지 배 근위축 등이 심하여(irreversible changes of denervated muscle), 실제적으로 임상 효과는 크 지 않을 것이다. 다만 본 실험을 통하여 분절형 신경 결손 시의 신경도관과 도관내 PDGF투여는 PDGF
들이 축삭의 재생과 성장을 촉진시켜 수복 불가능할 정도로 간격이 큰 신경손상도 성공적으로 재생 가능 케 할 것으로 보인다. 그러나 정상 신경원(mature neuron)으로의 재생은 불가능할 것으로 보이며, 향 후 신경이식과 겸비한 PDGF투여나, 배양된 골수기 질세포10)또는 슈반세포를 이용한 자가 이식법의 개
발5,21,29)등이 필요할 것으로 판단된다. 특히 최근에는
배아줄기세포외에 골수에서 채취하는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)와 간엽모세포(mes- enchymal stem cell)들은 신경세포로 분화될 수 있는데, 이처럼 중배엽성의 세포가 외배엽에서 유래 한 신경세포로 분화되는 trans-differentiation에 대한 연구가 활발하다10).
결 론
본 실험의 결과, 말초신경의 광범위한 손상시 Goretex관은 신경대치물로 사용할 수 있으며, 신 경손상시 PDGF의 투여는 실험초기에 신생혈관과 비신경세포들의 분화와 증식에 크게 관여하며, 실험 말기에는 재생된 축삭돌기의 성숙과정에 기여하는 것으로 판단되었다. 다만 임상에서 PDGF등 성장촉 진인자들의 투여는 시기적으로 신경손상의 봉합 후 나 신경결손 시 신경이식 후 또는 Goretex와 같은 신경도관의 연결 후 즉시 투여하여야 하며, 장시간 이 경과된 신경결손 시 PDGF의 단독투여는 비록 신경재생유도에 보다 효과적이겠으나, 투여가 수주 이상 지연된다면 장기간의 신경기능손실에 따른 지 배근육들의 근위축 등 변성변화로 그 효과를 기대하 기 어려울 것으로 판단되었다.
참고문헌
01) Aase K, Abramsson A, Karlsson L, Betsholtz C And Eriksson U: Expression analysus if PDGF-C in adult and developing mouse tissues. Mech. Dev, 110:187-191, 2002.
02) Achparaki-Alvanou A, Manthos A, Kontopoulos V, Kerameos-Foroglou C and Foroglou G:
Ultrastructural study of rabbit sciatic nerve regen-
eration following experimental excisional transac- tion and autograft reconstruction. Acta Neurochir, 85: 172-182, 1987.
03) Andral J, Gallini R and Betsholz C: Role of platelet- derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev, 22: 1276-1312, 2008.
04) Bowe CM, Hildebrand C, Kocsis JD and Waxman SG: Morphological and physiological properties of neurons after longterm axonal regen- eration: Observations on chronic and delayed sequelae of peripheral nerve injury. J Neurol Sci, 91: 259-292, 1989.
05) Buti M, Verdu E, Labrador RO, Vilches JJ, Fores J and Navarro X: Influence of physical parameters od nerve chambers on peripheral nerve regeneration and reinnervation. Exp Neurol, 137: 26-33, 1996.
06) Cao Y, Cao R and Hedlund EM: A regulation of Tumor angiogenesis and metastatic by FGF and PDGF Signaling Pathways. J Mol Med, 86: 785- 789, 2008.
07) Ceballos D, Navarro DX, Dubai G, Wendelschafer- Crabb G, Kennedy WR and Tranquillo RT:
Magnetically aligned collagen gel filling a colla- gen nerve guide improves peripheral nerve regen- eration. Exp Neurol, 158: 290-300, 1999.
08) Cordeiro PG, Seckel BR, Lipton SA, D’Amore PA, Wagner J and Medison R: Acidic FGF enhance peripheral n. regeneration in vivo. Plast Recon Surg, 1013-1019, 1989.
09) Crenshaw AH: Campbell’s Operative Orthopaedics.
8th ed, Mosby Co: 2213-2285, 1991.
10) Dejawa M, Takahashi I, Esaki M, Takano M, Sawada H: Sciatic nerve regeneration of in vitro differentiated bone marrow stromal cells.
Euporean J neuroscience, 14: 1771-1776, 2001.
11) Fields RD and Ellisman MH: Axons regenerated through silicone tube slices: I Conduction proper- ties. Exp Neurol, 92: 48-60, 1986.
12) Fawcett JW and Keynes RJ: Muscle basal lami- na: a new graft material for peripheral nerve repair. J Neuro surg, 65: 354-363, 1986.
13) Fredriksson L, Li H and Erilsson U: The PDGF
family: Four gene products form five dimeric isoforms.
Cytokine Growth Factor Rev, 15-A: 197-204, 2004.
14) Gerhardt H, Golding M, Fruttiger M et al.:
VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol, 161:
1163-1177, 2003.
15) Heldin CH and Westermark B: Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev, 79: 1283-1316, 1999.
16) Hollinger JO, Hart CE, Hirsch SN, Lynch S and Friedlaender GE: Recombinant Human Platelet-Derived Growth Factor: Biology and Clinical Applications. J Bone Joint Surg Am, 90-1:
48-54, 2008.
17) Holmes W and Young JZ: Nerve regeneration after immediate and delayed rupture. J Anat, 77:
63-39, 1942.
18) Ide C, Tohyama L, Yokota R, Nitatori t and Onodera S: Schwann cell, basal lamina and nerve regeneration. Brain Res, 288: 61-75, 1983.
19) Johnsson A, Heldin CH, Westermark B and Wasteson A: Platelet-derived growth factor:
Identification of constituent polypeptide chains.
Biochem Biophys Res Commun, 104: 66-74, 1982.
20) Kohler N and Lipton A: Platelets as a source of fibroblast growth-promoting activity. Exp Cell Res, 87: 297-301, 1974.
21) Labrador R O, Buti M and Navarro X : Influence of collagen and laminin matrices on nerve regeneration after resection and tube repair.
Exp Neurol, 19: 243-252, 1998.
22) Lee JS and Rhee SK: The role of b-FGF on nerve regeneration in segmental defect of rabbit sciatic nerve into Goretex tube. J Catholic University Medical College, 18-3: 238-249, 1997.
23) Levi MR and Hamburger V: Selective growth stimulation effect of mouse sarcoma on sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo. J Exp Zool, 116: 321-362, 1951.
24) Li X, Ponten A, Aase K et al.: PDGF-C is a new protease-activated ligand for the PDGF α-recep- tor. Nat Cell Biol, 2: 302-309, 2000.
25) Lundborg G: Nerve regeneration and repair.
Acta Orthop Scand, 58: 145-169, 1987.
26) Lundborg G: Nerve regeneration across on extended gap: A neurological view of nerve repair and the possible involvement of neurotrophic fac- tor. J Hand Surg, 7: 580-588, 1982.
27) Madison RD, Da-Silva CF, Dikkes P, Disman RL and Chiu TH: Peripheral nerve regeneration with entubulation repair: Comparison of biodegradable nerve guide versus polyethylene tubes and the effects of a laminin-containing gel.
Exp Neurol, 95: 378-390, 1987.
28) Millesi H: Reappraisal of nerve repair. Surg Clin North Am, 61: 321-334, 1981.
29) Morrisey TK, Kleitman N and Bunge RP:
Isolation and functional characterization of Schwann cells derived from adult peripheral nerve. J Neurosci, 11: 2433-2442, 1991.
30) Muller H, Williams LR and Varon S: Nerve regeneration chamber: Evaluation of exogenous agents applied by multiple injections. Brain Res, 416: 320-326, 1987.
31) Nahm I, Shin T and Chiba T: Regeneration of the recurrent laryngeal nerve in the guinea pig:
Reorganization of motor neurons after freezing injury. J Otolaryngol, 111: 90-98, 1991.
32) Ross R, Clomset J, Kariya B and Harkerm L: A platelet-dependent serum factor that stimulates the proliferation of arterial smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci, 71: 1207-1210, 1974.
33) Song SW and Kim JM: The role od b-FGF on nerve regeneration in segmental defect of diabetic rat. J Catholic University Medical College, 14-4:
1489-1503, 1993.
34) Westermark B and Wasteson A: A platelet fac- tor stimulating human normal glial cells. Exp Cell res, 98: 170-174, 1976.
35) Williams LR, Danielson N, Muller H and Varon S: Exogenous matrix precursors promote function- al nerve regeneration across a 15mm gap within a silicone chamber in the rat. J Comp Neurol, 264:
284-290, 1987.
