pISSN 1598-642X eISSN 2234-7305
사찰의 된장에서 분리된 Bacillus licheniformis YB-1234의 내열성 α-Amyalse
이은지·윤기홍*
우송대학교 식품생물과학과
Received : October 4, 2012 / Accepted : November 21, 2012
Thermostable α-Amyalse of Bacillus licheniformis YB-1234 Isolated from the Fermented Soybean of a Korean Buddhist Temple. Lee, Eun Ji and Ki-Hong Yoon*. Department of Food Science & Biotechnology, Woosong University, Daejeon 300-718, Korea − A bacterial strain was isolated from soybean paste fermented in a Korean Buddhist temple as a producer of the extracellular thermostable α-amylase. The isolate YB-1234 has been identified as Bacillus licheniformis on the basis of its 16S rDNA sequence, morphology and biochemical properties. A gene encoding the thermostable α-amylase of B. licheniformis YB-1234 was cloned into Escheri- chia coli and its nucleotide sequence was determined. The deduced amino acid sequence of α-amylase was very highly homologous to those of the thermostable α-amylases of B. licheniformis belonging to the glycosyl hydro- lase family 13. The α-amylase produced by recombinant E. coli carrying the α-amylase gene exhibited maximal activity at pH 6.0, identical to α-amylase in the culture filtrate of B. licheniformis, while the temperature profile was somewhat different between the two. Particularly, α-amylase produced from B. lcheniformis is much more thermostable than that from recombinant E. coli. The predominant products resulting from the α-amylase hydrol- ysis were glucose, maltose and maltotriose for maltotetraose and maltohexaose.
Key words: Bacillus licheniformis, α-amylases, gene, property
서 론
α-Amylase는 포도당으로 구성된 전분을 가수분해하여 저 중합도의 당과 dextrin으로 전환시키는 액화효소로 알려져 있으며 동물, 식물, 미생물에서 모두 발견되는 효소이다. α- Amylase는 식품, 직물, 제지, 양조, 제약 및 사료산업에 광 범위하게 이용되고 있으며 전체 효소시장에서 25-30%의 점 유율을 보이고 있다. 미생물로부터 산업적으로 생산되고 있 는 α-amylase는 여러 균주로부터 효소의 물리화학적 특성[1, 2, 7, 8], 단백질 구조와 기능[21], 변이효소 개량[22], 유전 자 재조합 균주 개발[18] 및 경제성이 있는 생산배지와 배 양법[23]에 대한 연구가 최근까지도 활발히 이루어지고 있다.
α-Amylase의 생산균으로 B. subtilis[23], B. licheniformis [2], B. stearothermophilus[5], B. amyloliquefaciens[13]를 포함한 다양한 Bacillus속 균주가 분리되었으며[1, 20], 이들 이 생산하는 효소는 균종에 따라 중온성, 내열성, 산성, 및 알칼리성의 특성을 갖는 것으로 확인되었다. B. subtilis AS- S01a로부터 생산되는 호알칼리성 α-amylase는 산화제, 계 면활성제, EDTA, 여러종류의 세제성분이 존재해도 활성에 큰 저해를 받지 않아 세제 산업에 그 활용성이 높을 것으
로 기대되며[23], 실험용 소금농장에서 분리된 Bacillus sp.
의 α-amylase는 110oC와 pH 8.0에서 최대활성을 보이고 넓은 범위의 pH에서도 높은 활성을 유지하여 전분액화용과 식품가공용 효소로 이용 가능성이 높을 것으로 보고되었다 [20]. 내열성 효소는 α-amylase 중에서 그 활용성이 가장 크며 초기에는 B. stearothermophilus에서 생산되었으나, B.
licheniformis의 α-amylase가 내열성이 더 우수하므로 현재 는 B. licheniformis가 생산균으로 사용되고 있다. 실제 B.
licheniformis 584 유래 α-amylase의 아미노산 서열은 B.
stearothermophilus및 B. amyloliquefaciens의 효소와 각각 65.4%와 80.3%의 상동성을 보이나, 최적 반응온도와 열안 정성은 이들에 비해 크게 높은 것으로 알려졌다[26]. 한편 B. thermooleovorans NP54의 α-amylase는 100oC에서 반감 기가 3시간이며 B. licheniformis 유래의 효소보다 내열성이 높은 것으로 보고되었다[17].
대두 발효식품은 우리나라를 비롯한 대부분의 아시아 국 가뿐 아니라 아프리카 지역에서도 고유식품으로 이용되고 있으며, 이로부터 발효 미생물이 분리되어 그 기능에 대한 연구가 진행되고 있다. 국내에서는 된장이나 청국장으로부 터 여러종류의 Bacillus속 미생물이 protease[25], mannanase [15], β-glucanase[10] 등을 생산하는 균주로 분리되고 그 효 소의 특성이 연구되었다. 본 연구에서는 사찰에서 제조된 발 효식품으로부터 유용한 발효미생물을 분리하고 이들 중 내
*Corresponding author
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열성 α-amylase를 생산하는 균을 탐색하여 그 효소 특성을 조사하였다.
재료 및 방법 내열성 α-amylase 생산균의 탐색과 동정
국내 사찰에서 수집한 된장을 적정량의 생리식염수에 현 탁하여 희석한 후 LB 평판배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g; water, 1 L)에 도말하여 37oC 에서 하룻밤 배양하였다. 서로 다른 모양을 보이는 콜로니 를 채취하여 LB 배지에 접종하고 37oC에서 24시간 동안 배 양 후 배양상등액을 80oC에서 30분간 열처리하고 α-amylase 의 잔존활성을 비교 조사함으로써 내열성이 우수한 α- amylase 생산균을 탐색하였다.
분리균주의 동정
분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였으며, 배양균체 현탁액을 API 20E와 API 50 CHB (Biomereux사, France) kits에 제조사의 지침을 따라 접종하 고 37oC에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 관찰하여 탄수 화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다. 분리균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염 색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열을 primers로 사용하여 중합효소 연 쇄반응(PCR)을 실시함으로써 얻은 PCR 산물을 정제하여 그 염기서열을 결정하였다[15].
α-Amylase 유전자의 클로닝
이미 보고된 B. lichniformis의 내열성 α-amylase 유전자 염기서열에 근거하여 구조유전자의 개시와 말단 지역에 해당 하는 염기서열 5'-TCATGAAACAACAMAAACGGCTTTA- 3' (AmyG-F)과 5'-CTATCTTTGAACATARATYGAAAC- CGA-3' (AmyG-R) 및 구조유전자 상부와 하부 주변지역의 염기서열 5'-CATRTGTTTCACWTTGWAAGGGGAG-3' (AmyG-U)과 5'-GATTTCCTTYAGGAAATCCGTCCT-3' (AmyG-D)의 primers를 각각 설계하였다. 내열성 α-amylase 유전자를 증폭하기 위해서 Genomic DNA prep kit (Solgent, Deajeon)로 분리한 B. licheniformis의 총 유전체 DNA를 주 형으로 하고 primers AmyG-F/R과 AmyG-U/D를 각각 사용 하여 pfu-X DNA polymerase로 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응은 95oC에서 3분간 열처리한 후 95oC에서 30초, 59oC에서 40초, 72oC에서 2분간 반응을 30회 반복하고 최종 적으로 72oC에서 10분간 방치하여 수행하였다. 증폭된 DNA 는 HincII로 절단된 pUC19와 ligation 시킨 후 Escherichia coli DH5α에 도입하고 2% 가용성 전분과 ampicillin (100 µg/ml)이 첨가된 LB 배지에서 전분분해환을 보이는 형질전 환주를 선발하였다.
α-Amylase 활성 측정
α-Amylase 활성은 감자전분을 기질로 하여 효소 반응 후 에 유리된 환원당을 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법으 로 다음과 같이 정량함으로써 측정하였다. 감자전분을 2 N NaOH 용액으로 전처리하여 증류수에 현탁시키고 pH를 7.0 으로 조절하여 0.4% (w/v) 감자전분 용액을 제조하고 이를 기질로 사용하였다. 효소반응을 위해 감자전분용액 0.5 ml와 200 mM 인산 완충용액(pH 6.0) 0.25 ml를 효소 용액 0.25 ml와 혼합하여 50oC에서 15분 동안 방치한 후 DNS 시약 3 ml을 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5분 동안 방 치하여 발색시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Glucose를 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정 하였다. 효소 활성도 1.0 unit는 위의 조건하에서 1분 동안 감자 전분으로부터 1 µmol의 glucose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
α-Amylase 반응특성 분석
α-Amylase 활성에 미치는 반응 온도와 pH의 영향을 조 사하기 위하여 50~90oC와 pH 4.5~10.0의 범위에서 α- amylase 활성을 각각 측정하였다. 이때 pH 4.5~6.0의 범위에 서는 citrate 완충용액, pH 6.0~8.0에서는 phosphate 완충용 액, pH 8.0~9.0의 범위에서는 Tris 완충용액, pH 9.0~10.0의 범위에서는 KCl-borate 완충용액을 각각 사용하였다. α- Amylase에 의한 maltooligosaccharide (MOS)의 분해산물을 분석하기 위해서는 0.5% MOS와 과량의 효소를 포함한 최 적 pH의 반응액을 65oC에서 5시간 반응시킨 후 95oC에서 5분간 열처리하여 원심분리한 다음 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수(4.3:5:0.7, (v/v)) 혼합용액 을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck Kiesegel, No. 5748)에서 박층 크로마토그래피를 수 행하였다. 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 9 ml ethanol, 0.5 ml p-anisaldehyde, 0.5 ml sulfuric acid와 glacial acetate 몇 방울을 혼합한 발색제 용액을 뿌린 후, 120oC에서 10분 간 방치하였다.
결과 및 고찰 α-Amylase 생산균의 분리와 동정 및 특성
국내 사찰에서 제조된 된장을 14점을 수집하여 LB 한천 배지에 도말한 후 37oC에서 하룻밤 배양한 결과 각 시료당 콜로니의 모양이 다른 것으로 보이는 균주가 5~8씩 분리되 었다. 분리균 중 내열성 α-amylase의 생산균을 탐색하기 위 해 액상배양한 분리균의 배양상등액을 80oC에서 30분간 열 처리한 후 이를 0.2% 감자전분, 40 mM sodium phosphate 완충액(pH 6.0)과 1.5% agar로 제조된 평판에 점적하고 60oC에서 5시간 반응하였다. 요오드 용액(0.1% potassium
iodide, 0.2% iodine)으로 염색하여 열처리 전후의 전분분해 환 크기를 비교함으로써 내열성이 우수한 효소를 생산하는 균주를 얻었으며 이를 YB-1234로 명명하였다.
분리균 YB-1234는 포자를 형성하는 그람양성 간균이며 API 50 CHB와 20E kit를 사용하여 생화학적 특성을 조사 한 결과 B. licheniformis와 유사도가 99.9%로 가장 높게 나 타났고 당 이용성 중 glycerol, sorbitol, galactose와 5-keto- gluconate 이용능에 차이가 있었으며 분리균은 glycerol, sorbitol과 galactose를 이용하지 못한 반면에 5-keto-glu- conate를 이용하였다. 또한 분리균은 β-galactosidase, urease, gelatinase, oxidase 활성이 있으며, citrate 이용능, acetoin 생성능 및 nitrate 환원능을 보였으며, arginine dehydrolase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, tryptophane deaminase 등의 활성 및 indole과 황화수소 생성능이 없었다.
분리균의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후 1,427 bp 크기의 염기서열을 결정하였으며 이를 미국 NCBI의 BLAST 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 세균들의 상응하는 염 기서열과 비교한 결과, B. licheniformis NBRC 12197 (AB680252)과 동일하였다. 따라서 분리균 YB-1234는 형태 적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 서열로 볼 때 B. licheni- formis로 판단되었다. 한편 된장이나 청국장으로부터 protease [25]와 β-glucanase[10]를 생산하는 B. licheniformis나 비전 분성 다당류를 분해하는 B. subtilis가 분리된 바 있으나[15], 전분을 분해하는 Bacillus속 균주에 대한 연구는 흔치 않다 [19].
α-Amylase 유전자의 클로닝과 염기서열
B. licheniformis YB-1234의 내열성 α-amylase 유전자를 클로닝하기 위해서는 이미 그 염기서열이 알려진 6종류의 B.
licheniformis 내열성 α-amylase 유전자들을 (GenBank acces- sion no. AMI183787, DQ517496, EF125542, GQ284655, JN853583, M13256) 비교 분석함으로써 상동성이 높은 염 기서열로 설계된 primers AmyG-F와 AmyG-R 및 AmyG- U와 AmyG-D을 각각 사용하여 분리균의 α-amylase 유전 자를 PCR로 증폭하였다. 그 결과 primers AmyG-F/R과 AmyG-U/D로 크기가 1.5 kb와 1.6 kb인 DNA 단편이 각각 증폭되었다. 따라서 α-amylase 유전자를 클로닝하기 위해서 는 AmyG-U/D로 증폭된 DNA 단편이 α-amylase 구조유전 자와 더불어 주변의 염기서열을 더 포함하고 있으므로 이를 정제하여 pUC19의 HincII에 도입하였다. 이렇게 제조된 재 조합 플라스미드를 함유한 E. coli 형질전환주는 전분을 함 유한 평판배지에서 콜로니 주변에 분해환을 형성하였다. 클 로닝된 α-amylase 유전자의 염기서열을 조사하기 위해서는 AmyG-U/D로 증폭된 DNA 단편 및 이 단편이 도입된 재조 합 플라스미드를 정제하여 각각 염기서열 분석에 사용하였 다. 그 결과 분리균의 α-amylase 구조유전자는 종결코돈을 포함하여 총 1,539 bp 크기로 확인되었고 그 염기서열은 B.
licheniformis SVD1 (AB643493)의 유전자와 가장 유사하였 으며, 7 nucleotides의 서열만이 다른 것으로 나타났다(결과 미제시). 한편 PCR로 증폭된 DNA 단편을 직접 염기서열 분석에 사용한 결과와 재조합 플라스미드를 염기서열 분석 에 사용한 결과는 동일하였으며 이로 보아 클로닝된 유전자 는 PCR 반응시 변이된 지점이 없는 것으로 추정되었다.
클로닝된 α-amylase 유전자의 염기서열로부터 추론된 아 미노산 서열을 다른 효소와 비교한 결과 Fig. 1에 보인 바와 같이 B. licheniformis의 내열성 α-amylase와 99.4~95.7%의 높은 상동성을 보였다. Signal peptide로 알려진 아미노 말 단 지역의 29 잔기[24]를 포함하여 여러 위치에서 다른 서 열이 발견되었다. 활성잔기인 Asp231, Glu261과 Asp328 [11], Ca 이온의 결합잔기인 His235와 Tyr302 및 Na 이온 의 결합잔기인 Aps194[22]는 다른 효소와 동일한 것으로 나 타났다. α-Aamylase의 내열성이나 내산성을 개선하기 위해 B. licheniformis를 비롯한 여러종류의 Bacillus속 균주 유래 의 효소에 대해 각종 변이효소가 제조되어 그 특성이 조사 되었다. Declerck 등은 B. licheniformis α-amylase의 H133Q 또는 A209T 변이효소가 내열성이 증진된다고 보고하였는데 [6], 특이하게도 분리균의 α-amylase는 133과 209 지점의 아 미노산이 각각 Q와 T로 존재하였으며 이는 Declerck등이 그 지점에 변이를 일으켜 제조한 변이효소의 아미노산 잔기와 동일한 것으로 확인되었다.
α-Amylase의 반응특성
B. licheniformis YB-1234는 내열성 α-amylase를 균체외 로 분비하지만, 이 유전자를 함유한 재조합 대장균의 배양 상등액에서는 α-amylase 활성이 거의 관찰되지 않고 대부분 균체내에서 관찰되므로 재조합 대장균으로부터 생산된 효소 가 거의 분비되지 않는 것으로 판단된다. 따라서 α-amylase 의 반응특성을 조사하기 위해서 B. licheniformis YB-1234 를 LB 액상배지에서 약 48시간 진탕배양한 배양상등액과 ampicillin이 첨가된 LB 배지에서 약 22시간 배양된 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 조효소액으로 각각 사용하였다.
반응 pH가 α-amylase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 B. licheniformis와 재조합 대장균으로부터 생산된 α-amylase 간에 큰 차이가 없으며 pH 6.0에서 최대활성을 보이고 pH 5.0~7.0 범위에서 최대활성의 90% 이상의 활성을 나타냈다 (Fig. 2). 한편 Ghalanbor 등은 Tris 완충용액을 사용하여 α- amylase 반응을 실시할 경우 Tris 분자가 효소 활성위치에 결합하여 전분분해 활성에 경쟁적 저해제로 작용한다고 보 고하였는데[7], 분리균의 α-amylase는 반응액의 pH 8.0에서 인산완충용액을 사용하였을 때나 Tris 완충용액을 사용하였 을 때 그 활성이 최대활성의 약 80%로 거의 유사하여 Tris 에 의해 저해를 받지 않는 것으로 확인되었다.
반응온도에 따른 α-amylase 활성을 조사한 결과 Fig. 2에 보인 바와 같이 재조합 대장균에서 생산된 효소는 75oC에서
최대활성을 보이며 70~80oC 범위에서는 최대활성의 93% 이 상에 해당하는 활성을 보이나, 65oC에서는 84%, 85oC에서 는 87%의 활성을 나타냈고 90oC에서는 급격히 감소되어 28% 정도 수준의 활성을 보였다. 그러나 B. licheniformis에 서 생산된 α-amylase는 70oC에서 최적반응 온도를 보였으
며 65~80oC 범위의 온도에서 95% 이상의 효소활성을 나타 냈고 90oC에서도 62%의 활성을 유지하여 재조합 대장균으 로부터 생산된 효소보다 고온의 넓은 온도범위에서 효소활 성이 우수한 것으로 확인되었다. 이는 재조합 대장균에서 생 산된 α-amylase가 B. licheniformis에서 생산된 α-amylase와 Fig. 1. Comparison of the B. licheniformis YB-1234 α-amylase with others. The amino acid sequences of seven α-amylases from B.
licheniformis strains YB-1234 (YB), NH1 (AB; GenBank accession no. ABL75259), MSG (AS; ACS92482), 3TB2 (AT; ACT63870), SHG10 (AE; AEU12641), DSM 13 (YP_077883), and NCIB 8061 (AA; AAA22240) are indicated by the one-letter code. Residues iden- tical to the amino acid sequence of the YB-1234 α-amylase are indicated by asterisks in other sequences. Catalytic triads are shaded, and the calcium and sodium binding residues are underlined, respectively. Italicized amino acids indicate the signal peptide. Numbers at the end of each line correspond to the amino acid position in the mature protein of α-amylases.
Fig. 2. Effects of reaction temperature and pH on the α-amylase activity of cell-free extract of recombinant E. coli (left) and culture filtrate of B. licheniformis YB-1234 (right). Temperature profile (closed symbols) was obtained by measuring the α-amylase activities at different temperatures and pH 6.0. The reactions were done at 50oC and various pHs for determining the pH profile (open symbols). Buff- ers used were as follows: sodium citrate (-○-), sodium phosphate (-▽-), Tris (-□-), KCl-borate (-△-).
는 달리 균체내에서 분해된 상태로 존재하게 되어 그 반응 특성이 변화된 것인지 또는 B. licheniformis가 최적 반응온 도가 다른 2종류 이상의 α-amylase를 균체외로 생산하여 배 양상등액을 이용하여 α-amylase 활성을 분석할 때 넓은 온 도범위에서 최대활성이 유지되고 있는지 그 원인을 확실히 추정할 수는 없으며 향후 이에 대한 원인 규명이 필요하다 고 판단된다.
한편 B. licheniformis NRRL B14368의 α-amylase는 pH 5~7과 76oC에서 최대활성을 보여[4] 분리균 효소와 유사 하였으며, B. licheniformis TCRDC-B13의 α-amylase는 분 리균의 효소와는 달리 최적 반응온도가 90oC이며, pH 5.5~10의 넓은 범위에서 최대활성을 나타냈다[2]. 또한 Bacillus sp. Ferdowsicous (70oC, pH 4.5)[1], Bacillus sp.
AAH-31 (70oC, pH 8.5)[14], B. mojavensis A21 (80oC, pH 6.5)[9]과 B. amyloliquifaciens TSWK1-1 (70oC, pH 7)[13]
로부터 생산된 α-amylase의 최적 반응온도는 70~80oC로 분 리균의 효소와 유사하였으며, 최적 반응pH는 차이가 있는 것으로 확인되었다.
내열성을 조사하기 위해 조효소액을 75oC와 80oC에서 시 간을 달리하여 방치한 후 α-amylase의 잔존활성을 측정한 결과 B. licheniformis로부터 생산된 α-amylase의 열안정성 이 재조합 대장균에서 생산된 효소보다 높은 것으로 나타났 다(Fig. 3). 재조합 대장균에서 생산된 α-amylase의 반감기 는 75oC에서 약 80분이고 80oC에서는 20분 미만인데 비하 여 B. licheniformis로부터 생산된 α-amylase의 반감기는 75oC에서 5시간, 80oC에서는 60분으로 각각 추정되었다. 한 편 재조합 대장균에서 생산된 α-amylase는 70oC에서 8시간 까지 방치한 결과 50% 이상의 활성을 유지하였고, B.
licheniformis로부터 생산된 α-amylase는 85oC에서도 20분간 방치한 후에 50% 이상의 잔존활성을 보였다(결과 미제시).
그러므로 분리균의 α-amylase는 80oC에서 35분, 85oC에서 10분 미만의 반감기를 보이는 B. licheniformis NH1의 효 소[8]에 비해 열안정성이 높은 것을 알 수 있다. 한편 B.
licheniformis 유래의 내열성 α-amylase는 protease 처리시 활성에는 큰 변화가 없으나 열안정성이 감소한다는 연구결 과로 보아[12], 재조합 대장균이 생산하는 분리균의 α- amylase가 분리균에서 생산된 효소보다 열안정성이 낮은 이 유가 재조합 대장균의 균체내에서 단백질 분해효소에 의한 분해가 일어난 때문일 수도 있다고 추측된다. 한편 α- amylase의 내열성은 pH에 의해서도 영향을 받아 산성의 pH 에서는 열안정성이 감소하지만, 알칼리 조건에서는 열안정 성이 증가하는 것으로 보고되었다[16]. 또한 중온성 효소로 알려진 B. amyloliquifaciens의 α-amylase와는 달리 열수 보관조에서 분리된 B. amyloliquifaciens TSWK1-1의 α- amylase는 내열성이 높은 것으로 보고된 바 있다[13].
반응산물
대장균 균체파쇄상등액과 B. licheniformis 배양상등액에 Fig. 3. Thermostability of the α-amylase in cell-free extract of recombinant E. coli and culrue filtrate of B. licheniformis YB- 1234. Thermostability was determined by measuring the residual activities of the culture filtrate (open symbols) and the cell-free extract (closed symbols) after pre-incubations for various times at 75oC (circles) and 80oC (triangle).
Fig. 4. Thin-layer chromatogram of hydrolysis products of α-1,4-linked maltooligosaccharides with α-amylase from recombinant E.
coli (left) and B. licheniformis (right). The reaction mixtures containing the α-amylase and maltooligosaccharides in 20 mM sodium phos- phate buffer (pH 6.0) were incubated for 5 h at 65oC. M, M3, M4 and M6 represent maltose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose, respectively; E, crude α-amylase; G, glucose.
존재하는 α-amylase에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해 기질로 중합도가 다른 maltose, maltotriose, maltotetraose 그리고 maltohexaose를 사용하여 동일량의 효소를 처리한 후 가수분해 산물을 TLC로 조사하였다. 그 결과 Fig. 4에 보인 바와 같이 기질과 효소사용량이 동일한 상태에서 maltohexaose로부터 분해된 산물의 양이 가장 많은 것으로 관찰되었는데, 이로 보아 α-amylase는 기질의 중합도가 높 을수록 가수분해 효율이 높은 것으로 판단된다. Maltotriose 는 매우 약하게 분해되었으며 maltotetraose는 maltotriose 보 다는 잘 분해되었다. Maltohexaose와 maltotetraose의 주된 분해산물로 glucose, maltose와 maltotriose가 관찰되었으며, maltohexaose에서는 maltotetraose 보다 이동도가 낮은 maltopentaose로 추정되는 산물이 관찰되었고 그 양은 maltotetraose 보다 많은 것으로 판단된다. 한편 재조합 대장 균 균체파쇄액에 의해 maltose가 가수분해 되지 않았으며 이 로써 α-amylase는 maltose를 분해하지 못하는 것을 확인하 였다. 그러나 B. licheniformis로부터 생산된 배양상등액의 효 소에 의해서는 maltose의 가수분해산물로 glucose와 이동도 가 동일한 물질이 생성되었는데 이는 B. licheniformis의 배 양상등액에 α-amylase외에 maltose를 분해하는 효소가 존재 하기 때문으로 판단된다.
한편 Blakeney와 Stone은 B. licheniformis 유래의 α- amylase로 전분의 가수분해산물을 HPLC로 분석하여 glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose 가 생성된 것을 확인하였는데[3], 이 중에서 maltotetraose의 생성량이 가장 적은 것은 분리균의 α-amylase에 의한 maltohexaose 분해산물의 결과와 유사하였다. Bacillus sp.
AAH-31의 α-amylase도 분리균의 효소와 같이 maltotriose 이상의 중합도를 갖는 MOS를 분해하며, 주된 가수분해산물 로 maltose와 maltotriose를 생성하는 것으로 알려졌다[14].
그러나 분리균의 효소와는 달리 glucose가 가수분해 산물로 관찰되지 않았다. 또한 B. mojavensis A21의 α-amylase는 전분을 분해하여 maltohexaose, maltopentaose와 maltotriose 를 주된 산물로 생성하는 것으로 알려졌다[9].
요 약
국내 사찰에서 제조된 된장으로부터 내열성 α-amylase 생 산균으로 분리된 YB-1234는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA 유전자 염기서열에 근거하여 Bacillus licheniformis 로 동정되었다. B. licheniformis YB-1234의 α-amylase 유 전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정하였으며 그로부터 유추된 α-amylase의 아미노산 서열은 glycosyl hydrolase family 13에 속하는 B. licheniformis의 내열성 α-amylases 와 매우 높은 상동성을 보였다. α-Aamylase 유전자를 함유 한 재조합 대장균과 B. licheniformis에 의해 각각 생산된 α- amylase는 pH 6.0에서 최대활성을 보였으나, 최적 반응온도
는 약간의 차이가 있었다. 또한 B. licheniformis로부터 α- amylase는 재조합 대장균에서 생산된 효소보다 열안정성이 매우 높았다. 이들 효소에 의한 maltotetraose와 maltohexaose 의 주된 가수분해산물로는 glucose, maltose 및 maltotriose 가 관찰되었다.
REFERENCES
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