in the ukemia Arsenic Trioxide-Induced Fusion Expression Bcr-Abl

(1)

일상병리검사과악외 ^I: 저134면 저12호，

42-46 , 2002

만성 골수성 백혈병 세포주에서 AS2Û3에 의한

Bcr-Abl 융합유전자 발현의 변화

안산1 대학 임상병리과

·

고대안암병원 임상병리과l

심문정 ·최현일 1

Arsenic Trioxide-Induced Bcr-Abl Fusion Oncogene Expression in the Chronic My elogenous Le ukemia Cell Line

S피m， Moon Jeong.

, Ch oi , Hyun 11

¹

Department 01 M edical Technology , Ansan College , Ansan , Korea

De JX1 rtment 01 Cliniml

Patholo，양" Korea Univeπity Mediml Center Anam Hospitα1， Seoul,

Korea

¹

Human chronic myelogenous leukemia(CML) is a malignacy of pluripotent hematopoietic cells caused by a dysre gu1 ated activity of the tyrosine kinase encoded by the chimeric bcr-abl oncogene. Ars enic trioxide( As 203) has recently been demonstrated to be an effective inducer of apoptosis in patients with relapsed acute promyelocytic leukemia(APL) and in patients with APL in whom all-trans-retinoic acid and conventiona1 chemotherapy has failed. As 203 induced apoptosis in NB4 cells , cloned from a relapsed patient with APL , by inducing loss of the PML/RAR

α

protein and by suppressing expression of the Bcl-2 protein. We have focused our studies on the effects of AS203 on the CML K562 cells and examined morphological changes of the cells undergoing apoptosis with electron microscopy. Next the bcr-abl rearrangement was not detected after treatment with concentrations more than 50

μ

MjL As 203 for 24 h.

πùs

result shows that As 203 is a new promising antileukemic drug for treatment of CML and we needs to be investigated further.

Key Words : CML , RT-PCR , Bcr-Abl , K562 cell , Apoptosis , As 20 3

1 .

서 로 」 을 함이 밝혀진 이래 많은 연구가 되어왔다.9번과 22번 염색체의 역전위 결과

abl

유전자의

exon

2와

bcr

유전자의

exon 2

또는

exon

3 이 결합되고 이러 한

bcr-abl

융합유전자는

8.5

Kb의

bcr-abl

mRNA를 전사한다고 알려 졌다

(Shivelman et al., 1985).

사람 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포는

bcr-abl

만성 골수성 백혈병 (CML)은 모든 성숙단계의

골수구계 세포의 증식과 세포유전학적으로 펼라델 피아 염색체를 특징적으로 나타내는 조혈모세포 질

환으로

bcr-abl

융합유전자가 발병에 결정적인 역할

(2)

융합유전자에 의해 발현되는

tyrosine

kinase의 높은 활성에 의해 발생되는 백혈병세포로서， 여러 자극 에 대해 상당히 높은 내성을 가지고 있다. 이 질병 은 만성기에 진단되고， 평균 2-3 년후에 급성기로 전 환되어 항백혈병 복합요법에도 불구하고 수개월내에 사망하는 난치성 혈액종양으로 알려져 있다 (αlamp-

lin RE et a l., 1985;

Kanta낀ian 뻐-1

et al. , 1987).

Ars enic trioxide

(As203)는 최 근 재 발된 급성 전 골 수성 백혈병 치료에 있어서 좋은 효과를 보였음을 보고 한 바 있는데， 특히 골수기능 억저l 및 기타 독 성이 적은 장점이 있으며， 1 차 치료에 저항성이 있 거나 재발된 급성 전골수성 백혈병

(APL , AML-M3)

환자들에게서 좋은 효과를 보였다. As203의 APL에 대한 항암작용은 mRNA와 단백질 합성단계에서

bcl-2

유전자 표현의 하향조절

(Chen GQ et al. ,

1996) 과 PML-RARα 융합유전자의 퇴화유도와 연 관되어 세포 아포토시스 (apoptosis)를 유발함으로써 나타난다고 알려졌다

(Shao W et a l., 1998).

아포토시스 (apoptosis)는 특히 외부 자극에 대한 세포내부에 이미 존재하는 일련의 프로그램에 의해

K562

세 포를

10% FBS (Gibco BRL ,

USA)가 포함된

RPMI 1640 (Gibco BRL , USA)

성장배지로

37t , 5%

C02

항온 항습기

(NAPCO 6001 ,

USA) 에 배양하였으 며

,

음성 대 조균주로는

human myelomonocytic leuke- mia

세포주인

U937

세포를 사용하였다.

2.

전자현미경을 이용한 세포의 형태변화 관찰

정상적으로 24시간 배양한 세포에 아무것도 처리 하지 않은 대조군과 10μM과 20μM

As 20 3

(Si맑la，

USA)를 24시간 동안 처리한 실험꾼을 400Xg로

4

⁰

C

에서 10분간 원심분리하여 모으고 여기에 PBS 에 녹 인

2.5 %

glutaldehyde로 2시간 고정하였다.

0.1 M caocodylate buffer (pH

7.4)로 세 척 후，

2% osmium

tetroxide로 후고정하고 세척， 탈수과정을 거친 후 치 환을 하고，

Polybed

812를 이용하여 포매를 하였다.

포매과정이 끝나면 열중합 과정을 거친 후， 박절을 하고

uranyl

acetate와

lead

citrate를 이용하여 이중전 자 염색을 하였다. 그리고나서

JEM 1200 EX- II

전

자현미 경

(JEOL ,

Japa띠을 사용하여 관찰하였다.

세포가 사멸하는 과정을 의미하는데， 이 때 주로 관 찰할 수 있는 것은

DNA

분절， 세포의 형태학적인 ι

~

3. Primer

변화와 세포주기의 변화 등이다. 아포토시스시의 형태학적 변화는 전자현미경을 통해서 관찰할 수 있는데， 핵막 주위로 핵 염색질이 농축되기 시작하 면서 핵막과 세포막이 수포를 형성하고 마지막에는 남아있는 핵이 분절되어 막으로 둘러싸인 특이적인

apoptotic

body를 형성하면서 떨어져 나가게 된다.

(Wyllie AH et a l., 1980; Allen TD , 1987).

이에 본 연구에서는

t

(9;22) 과

bcr-abl

융합유전자 를 가진

K562

세포에서 As2⁰3에 의한 전자현미경적 형태의 변화와 RT-PCR을 이용하여

bcr-abl

융합유 전자 표현정도의 변화를 관찰하고자 한다.

ll.

재료 및 밤법

1.

세포배양

만성 골수성 백혈병 환자의 골수세포에서 유래된

Maurer

등의 방법을 일부 변형한 primer를 사용하

여

nested

PCR을 시 행하였다

(Table 1). RNA

존재여 부를 확인하기 위한 내부대조로 정상

abl

유전자를 이용하였다. 일차 PCR에서는 bcr-abl의 바깥쪽 primer를， 이차 PCR에서는 안쪽 primer를 사용하였 다

(Fig. 1).

Table 1. Sequences of primers

Primεrs Sεquencε

Al

^’

ATC TGC CTG AAG CTG GTG GGC T 3'

A2

5

^’

AGT GAA GCC GCT CGT TGG AAC TCC AA 3

^’

A3

^’

TGA TTA TAG CCT AAG ACC CGG A 3' A4

^‘

ATC TCC ACT GGC CAC AAA ATC AT A CA

γ Bl

5

’

GAA GTG TTT CAG AAG CTT CTC C 3

’

B2 5

’

TGG AGC TGC AGA TGC TGA CCA ACT CG 3

^‘

(3)

RT -PCR of major bcr-abl rearrangement

mrrers

^랴옮 ^뿌#

| 않 excn b1 I ι | 어 I ^a2 I 혀 메 ]

RT-PCR of normal c-abl as intemal RNA control

A1

f.2 M þ3

--+ --+ ‘- ‘-

| ^C-abl â1 Î â2 Î

려 ^a4

Fig. 1. Th e locations of the primers used for RT-PCR test of bcr-abl

reaπangement.

4.

mRNA추출

K562세 포에 As2^{03를 각각}

10. 50 , 100 , 250

μ

MJL

첨가하고， 24시간 배양한 후 PBS로 2회 세척하고，

모은 세 포에 서

RNAzol B RNA isolation system

(TEL-TEST ,

USA)을 이용하여 mRNA를 추출하였다.

5.

cDNA으| 합성

cDNA는 약 10μ6의 RNA를 가열한 후，

5X RT buffer 4

μQ，

333

μ

M random primer 2

따，

35

Ujμ4

inhibitor 0.5

따， 20 Uj따

reverse transcriptase 0.5

μ，

200

μM

dNTP 2

μ， DW

1

μ6를 넣어 총량이

20

따 가 되도록 하여 37⁰C 에서 1 시간， 95⁰C 에서 5 분간 반 응시켜 제조하였다.

6. Nested cDNA PCR

cDNA

합성 후 일차

PCR

반응은

10 pM primer mix2

μQ，

10X PCR buffer 5

μ， 200 μ

M dNTP 2

μ-e，

2

Ujμ

Taq polymerase 0.5

μ6 에

cDNA 10

따를 혼합하여

50

μ 로

94

⁰

C

1 분，

61 t

1 분으로

26 cycle

을 시행한 후 72⁰C 에 7분간 두고 종료하였다. 이차 PCR은 일차 PCR의 산물

1

μP 에， 일차 PCR과 동일 한 조성에

10 mM dNTP 1

μV 만 추가하고

94

⁰

C

1 분，

68

⁰

C

1 분에

30

cycle을 시행한 후 72⁰C 에서 7분간 두고 종료하였다.

반응 종료 후 PCR산물을

2 % agarose

gel에 서 전 기영동하여 band를 확인하였다.

ill.

결 과

1.

전자현미경을 통한 세포 형태변화 관찰

전자현미경을 통해 세포의 형태학적인 변화를 관 찰하기 위해

10

μM과

20

μM

As

2

0

3 를 24 시간 동 안 처리한 것을 확인한 결과， 대조균파는 다르게 As203에 의해 유도되는 아포토시스 과정을 확인할 수 있었다. 핵 내 염색질이 핵막 주위로 농축되고 세포 수축과 세포질 내 공포 형성이 관찰되었다

(Fig. 2).

(A)

^‘

^,

^{‘ \}^/^배

(c)

Fig. 2. Electron micrographs of K562 cells treated with AS

2

0

3 • πle

cells were treated with the control vehicle (A) , 10

μ

M

As

203 for 24 h (B) , 20

μ

M

As

203 for 24 h

(C),

stained with uranyl acetate and lead citrate, and analyzed under an electron microscope (X

4，α)()).

2. Bcr-Abl

융합유전자의 변화

RT-PCR

결과

K562

세포에서는 음성대조군인

U937세포에 비해

305

bp의 위치의 band로 양성을 보였으며，

As

2

0

3 10μM 첨가 24시간 후에 관찰한 결과 같은 위치의 양성 band가 보였으나 처음 As203을 처리하지 않은 대조군에 비해 넓어졌으며，

50μM 첨가 후부터는 보이지 않아

bcr-abl

융합유 전자가 소설되었음을 알 수 있었다

(Fig. 3).

(4)

1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 1112

305 bp-' 105 bp-'

Fig. 3. RT-PCR results of bcr-abl rearrangmen t.

Lan e 1: K562 contzrol; Lane 2: As

2

0

3

10

μ

M;

Lane 3: 50

μ

M; La ne 4: 100

μ

M; Lan e 5: 250

μ

M; Lan e 6: U937 cell (negative); Lanes 7-12:

Intemal controls for Lane 1-6; respectively; M:

molecular weight marker;

N.

고 화

E

항암기 전에 관한 연구는 세포학， 유전학 및 분자 생물학의 발전과 병행되어 발전되어 새로운 기전이 밝혀져 왔다. 또한 암의 병태생리를 토대로 새로운 항암물질의 발견과 항암제의 임상적 응용을 시도하 였다. 따라서 동서의학의 공동연구로 소개된

AS

2

03

의 항암작용은 현대 의학적인 방법으로 그 가전을 밝힐 필요가 있으며， 특히 APL에 있어서는

ATRA

분화요법의 문제점이 발생한 후 더욱 관심이 높아 졌으며， 실제 임상연구까지도 시행된 단계이다

(Chen Z et a l., 2001: Huang SY et al , 2 (00).

유핵 세포의 아포토시스 (apoptosis) 의 병태생리는 세포증식과 세포사멸 사이의 균형을 유지하여 조직 내 항상성을 유지하는데 중요한 파정으로， 유전적 으로 손상받은 서l 포의 제거나， 개제방어 기작， 배발 생 과정파 종양이나 자가면역병， 바이러스감염등의 병의 진전을 조점하는데 나타나고 있다. 아포토시 스는 세포사 중 괴사 (necrosis) 과정과 대별되는 과정 으로， 세포고사 개시동안은 여러 종류의

proapoptic ,

antiapoptic

단백질의 발현이 조절되며， 이에 따라서

caspase 가 활성화되고 세포수축， 세포막수축， 염색질 응축，

DNA

분절현상이 야기되며， 후반기에는

apoptic

body를 형성하여 세포는 파괴된다고 알려져

있다

(Ellis HM et a l., 1986; Wyllie AH. , et

씨

1980).

본 연구에서 전자현미경을 통하여

AS

2

0

3 처라시 아 포토시스로 진행중인 세포의 형태학적인 변화를 관

찰할 수가 있었다. As2⁰3가 APL세포주에서 아포토 시 스 억 제 자

(apoptosis inhibitor)

인 bcl-2를 mRNA와 단백질 단계에서 둘다 효과적으로 하향조절할 수 있는 것으로 알려져 왔다

(Zhu J et a l., 1997).

이에 반해

CML

세포주에선 아직까지 As2⁰3^{에 대한}

bcr- abl

융합 유전자의 발현의 변화에 관한 보고가 없는 실정이며， 이에 본 연구에서 살펴본 결과 의미있게 감소， 소설됨을 관찰하였으며， 아포토시스와 관련해

DNA

분절이나， caspase의 활성， bcl-2의 발현 등 계 속적인 연구의 진행이 필요하리라 사료된다.

v.

결 로 」

만성 골수성 백혈병 (CML) 은 모든 성숙단계의 골 수구계 세포의 증식과 세포유전학적으로 펼라델피 아 염색체를 특징적으로 나타내는 조혈모세포 질환 으로 특징 적 인

t(9;22)

및

bcr-abl

융합 유전자의 발 현이 병태생리의 중심이 되는 것으로 밝혀졌으며，

이에 대해 CML의 치료제로서의 가능성을 살펴보고

자

K562

세포주를 이용하여 As2⁰3에 의한 전자현미

경적 형태변화를 살펴본 결과 아포토시스로 진행중 인 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 또한

bcr- abl

융합유전자의 발현 변화를

RT-PCR

방법을 통해

살펴본 결과 매우 의미있게 약물의 양에 따라 감소 또는 소설됨을 관찰하여 앞으로의 CML에 대한 As203의 항암기전을 밝히는데 기초자료가 될 것이 며， 세포의 apoptosis와 관련된 다른 기전에 대해서 도 지속적언 연구가 펼요하리라 사료된다.

잠고문흰

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