서론
표면 topography와 표면 화학은 생체재료와 관련하여 많은 새 로운 지평을 열 수 있다.1임플란트의 성공에 있어서 골유착은 가장 중요한 요소이고 임플란트의 topography를 변형시킴으로
써 골유착을 증진시킬 수 있다. Topography에 따른 특성은 조도 의 정도나 표면의 불규칙성으로 얻을 수 있다.2샌드블라스팅, 플라즈마 스프레잉, 산에칭은 표면의 topography를 변경하여 면적을 넓히는 가장 흔하게 사용되는 방법이다.3표면적을 넓 혀 생체재료로서의 특성을 극대화할 수 있다.
마이크로그루브 상 인간치은섬유아세포의 유전자 발현 분석: DNA microarray 연구
이경호1∙이성복2∙안수진2∙박수정2∙이석원2*
1경희대학교 대학원 치의학과, 2강동경희대학교치과병원 보철과 경희대학교 치과대학, 치의학전문대학원 치과보철학교실
Regulation of human gingival fibroblast gene expression on microgrooves:
A DNA microarray study
Kyungho Lee1, Richard Leesungbok2, Su-Jin Ahn2, Su-Jung Park2, Suk Won Lee2*
1Department of Dentistry, Graduate School, Kyung Hee University,
2Department of Biomaterials & Prosthodontics, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, School of Dentistry, Kyung Hee University, Seoul, Republic of Korea
Purpose: We aimed to investigate the gene expression of human gingival fibroblasts on microgroove surface using DNA microarray. Materials and methods: Microgrooves were applied on grade II titanium discs to have 0/0 ㎛ (NE0, control group), 60/10 ㎛ (E60/10, experimental group) of respective width/depth by photolithography. The entire surface of the microgrooved Ti substrata was further acid etched and used as the two experimental groups in this study. Human gingival fibroblasts were cultured in the exper- imental group and the control group, and total RNA was extracted. The oligonucleotide microarray was performed to confirm the changes of various gene expression levels between experimental group and control group. Changes of gene expression level were determined at the pathway level by mapping the expression results of DNA chips, using the KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway analysis. Results: Gene expression levels on E60/10 and NE0 were analyzed, there were 123 genes show- ing significant differences in expression more than 1.5 times on E60/10 microgrooved surface compared to NE0 surface, and 19 genes showing significant differences in expres- sion more than 2 times. The KEGG pathway analysis confirmed the changes in gene expression levels under experimental conditions. Cell signaling, proliferation, and activ- ity among the various gene expression results were identified. Conclusion: Microgrooved surfaces induce gene expression changes and related cell signaling. According to the results of this study, microgrooves can be used as the surface of various biomaterials which need to improve cell activity through gene expression changes and activation of cell signaling. (J Korean Acad Prosthodont 2017;55:361-71)
Keywords: Titanium; Microgrooves; Human gingival fibroblasts; Gene expression changes
c cc
2017 The Korean Academy of Prosthodontics
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licens- es/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
*Corresponding Author: Suk Won Lee
Department of Biomaterials & Prosthodontics, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Institute of Oral Biology, School of Dentistry, Kyung Hee University, 892 Dongnam-ro, Gangdong-gu, Seoul 05278, Republic of Korea
+82 (0)2 440 7519: e-mail, [email protected]
Article history: Received June 8, 2017 / Last Revision September 11, 2017 / Accepted September 14, 2017
※This research was supported by the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education, Republic of Korea (NRF-2015R1D1A1A01057956).
Implant topography에 따른 세포 반응에 대한 연구는 활발히 진행되고 있고 그 중에서도 마이크로그루브는 세포접착과 세 포증식을 유도한다고 알려져 있다. 이전 연구에서, 마이크로 그루브가 형성된 표면은 골아세포의 활성 증가를 유도하여 세 포접착 및 골활성 능력을 증진시킬 수 있다는 것을 입증했다.4 또한, 마이크로그루브 표면은 평활한 표면에 비해 인간치은섬 유아세포의 이주, 분화, 증식을 더 많이 증가시켰다.5이에 대한 원인으로, 마이크로그루브 표면이 fibronectin의 양을 증가시키 기 때문이라는 것도 입증되었다.6
섬유아세포는 focal adhesion을 통해 기질과 접착한다.7 Fibronectin이 focal adhesion에서 주요한 역할을 하고 섬유아세 포의 세포외기질에서 조직공학 연구 분야에서 가장 주목하는 단백질이다.8세포의 접착, 성장, 이주, 분화에 전반적으로 작용 하기 때문에 수많은 pathway를 가지고 있다. CDK6, c-Src, cyclin D1, integrin α5, ON, paxillin, talin-2 등이 마이크로그루브 표면에서의 섬 유아세포 증식에 영향을 준다고 알려졌지만 어떤 pathway와 관 련이 있는지에 대한 연구는 부족하다.
본 연구에서는 평활한 타이타늄 표면과 마이크로그루브 표 면 간에 세포 내 다양한 유전자 발현 차이가 존재한다는 가설 을 설정하였다. 본 연구의 목적은 마이크로그루브에 의하여 발현 조절되는 인간치은섬유아세포의 유전자들을 DNA microarray 기법으로 규명하는 것이다. 마이크로그루브 표면이 인간치은섬유아세포의 어떤 pathway를 조절하여 이주, 분화, 증식 증가를 유도하는지에 대해 알아보고자 한다.
재료 및 방법 1. 재료
1) 시편 제작
시편은 포토리소그래피(Photolithography)를 이용하여 제작하 였다. Grade II 순수 티타늄 디스크(TSM-TECH Co., Ltd., Ulsan, Korea)를 기계적으로 연마하여 Ra ≤ 0.1 ㎛의 표면 거칠기를 갖도록 제작하였다. 연마된 티타늄의 표면에 UV-sensitive polymer 를 코팅시키고, 마이크로그루브의 폭과 같은 폭을 가진 photo- mask를 위치시켰다. 이후, UV광을 가하여 코팅된 티타늄의 표 면에 마이크로그루브 형태가 현상되게 만들었다. 이 상태에서 용해액(2.38% tetramethyl-ammonium hydroxide, TMAH, Dongjin, Seoul, Korea)에 티타늄을 담가서 UV광에 노출된 부분을 용해시켰다.
그 다음에 photo-mask를 용해액(아세톤, 이소프로필 알코올)으 로 제거하여 실험군인 마이크로그루브 티타늄 시편(폭/깊이:
60 ㎛/10 ㎛, E60/10)을 제작하였다 (Fig. 1). 포토리소그래피 처리 를 하지 않은 평활한 티타늄 표면(NE0)을 대조군으로 사용하였 다. 모든 티타늄 시편은 실험 전 초음파세척기에서 30분간 3회 씩, 증류수에 3회씩 세척 후, 상온에서 1일 건조하였다. 본 연구 에서는 실험군 6개, 대조군 6개의 표본으로 진행하였다.
2. 방법
1) 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM) 관찰 Field emission scanning electron microscopy (S-800 FE-SEM, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 E60/10과 NE0 표면을 관찰하 였다.
2) 세포 배양
강동경희대학교치과병원에서 발치한 사랑니에서 건강한 치은 조직을 얻었다. 강동경희대병원 의대병원 Institutional Review Board (IRB)의 승인을 얻었고 절차를 준수하였다. 4℃의 Hank's balanced salt solution (HBSS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 에서 16 - 22시간 동안 치은 조직을 배양하여 상피로부터 결합 조직을 분리하였다. 체외 배양 조직은 penicillin G sodium (50 IU/ml), streptomycin sulfate (50 mg/ml), amphotericin B가 포함된 Dulbecco's minimum essential medium (DMEM, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)의 Petri dish로 이동시켰다. 세포는 phosphate- buffered saline으로 3회 세척하였고 10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen Corporation)과 항생제가 포함된 DMEM에 부유시켰 다. Suspended fibroblast는 T-75 flask (enzymatic dissociation)으로 옮겨진 후 95% 공기, 5% CO2, 37℃ 상태에서 humidified incubator 에서 배양되었다. 배양된 3 - 5주기 인간치은섬유아세포가 본 연구에 사용되었다. 바닥을 제거한 배양접시에 표면처리된 지 름 10 mm의 티타늄 디스크 및 평활한 티타늄 디스크를 실리콘 본딩제로 접착하여, 대조군 및 실험군으로 이루어진 96-well 티 타늄 시편들이 제작되었다. 인간치은섬유아세포는 96-well 티 타늄 표본 바닥에 3 × 103cell/ml 밀도로 접착되어, 37℃, 5%
CO2의 습도 하에 16시간 동안 인큐베이터 내에서 배양되었다.
Fig. 1. Fabrication of Ti substrata using photolithography.
3) Microarray
본 연구에서 사용할 RNA를 TRIZOL (GIBCO-BRL; Cat. No.
15596-018) lysis solution을 사용하여 추출하였다. 표본들이 실험을 진행할 수 있는 quality인지 Agilent bioanalyzer 2100으로 RNA Quality check를 하였다. Total RNA에 대해 전기영동을 시행하여 28S, 18S band가 명확하게 구분되는지 확인하였다. Probe labeling 은 cyanine dye를 사용하여 microarray에서 hybridization될 핵산의 probe 혼합물에 형광물을 끼워 넣었다. Probe clean up 후 concen- tration 과정을 거쳤다.
MAUI system을 이용하여 probe hybridization을 진행한 후 MAUI mixer를 벗겨내고 chip 상의 free nucleotide, un-hybridized probe 등을 제거하였다. Gene-pix 4.1 program으로 signal detection을 시행하였 다. Image 분석 및 data 분석은 GenePix Pro 4.02 version을 사용하였 다. Raw data의 quality에 대한 정보를 통계적 수치와 다양한 plot으 로 점검하고, 추후 분석에 사용될 데이터의 전처리 과정을 거 쳤다. Quantile Normalization으로 array의 분포를 동일하게 조정하 였다.
Unsupervised Clustering으로 전체 12개의 표본을 clustering 결과 에 대한 통계적 검증을 하였고 유전자의 발현에 따라 어떻게 구분되어지는지 시각적으로 확인하였다. Basic Differentially Expressed Gene (DEG) finding을 하여 대조군, 실험군 비교를 통해 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 유전자를 확인하였다.
Pearson correlation (centered)와 average linkage를 사용하였다.
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway analy- sis를 통해 DNA chip의 발현 결과를 mapping하여, 실험 조건에 따 른 유전자 발현량의 변화를 pathway 수준에서 파악하였다.
결과
1. 주사전자현미경 관찰
포토리소그래피로 제작한 마이크로그루브 표면을 가진 시 편(E60/10)과 평활한 표면을 가진 시편(NE0)을 주사전자현미 경을 이용하여 관찰하였다 (Fig. 2). 마이크로그루브 티타늄 시 편의 폭/깊이가 60/10 ㎛로 형성된 것을 확인하였다.
2. DEG finding
각 시편에 배양된 인간치은섬유아세포의 유전자 발현의 차 이를 알아보기 위해 hierarchical clustering analysis를 시행하였다.
GenePix Pro 4.02 version을 이용하여 전체 12개의 표본들을 cluster 결과에 따라 유전자의 증감을 시각적으로 나타냈다. 인간치은 섬유아세포에서 유의한 up-regulation 또는 down-regulation을 나타 내는 유전자의 발현량을 상대적으로 정량분석하여 선정하였 다. 1.5 fold 이상 change를 보인 유전자는 123개, 2 fold 이상 change 를 보인 유전자는 19개였다 (Fig. 3). 2 fold 이상 change를 보인 유 전자는 Table 1에서 확인할 수 있다.
3. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway analysis
실험 조건에 따른 유전자 발현량 변화를 KEGG pathway analy- sis를 통하여 확인하고 어떤 pathway의 변화를 유도하였는지 확 인하였다. 총 18개의 pathway를 확인할 수 있었고 Cell communi- cation과 관련된 유전자들이 7개로 제일 많았다 (Table 2). 각각의 Pathway에 관여하는 유전자들의 up-regulation 또는 down-regulation 을 확인할 수 있었다. Cell communication에서는 COMP (Cartilage oligomeric matrix protein), COL5A3이 up-regulation되었고 KRT18, COL11A1, KRTHA4, KRT7, KRT19가 down-regulation되었다 (Fig.
4). MAPK signaling pathway에서는 PLA2G4A (phospholipase A2 group
Fig. 2. Field emission scanning electron microscopic images of (A) NE0 (×250), (B) E60/10 (×250) by Fe-SEM.
B A
Fig. 3. A. The difference in the degree of gene expression was examined by hier- archical clustering analysis. Datas were obtained using median-center, average link- age. B is a cluster of 123 genes showing 1.5 fold changes and C is a cluster of 19 genes showing 2 fold changes.
B C
A
Table 1. Genes showing significant differences in expression more than 2 times
Probe ID Symbol Definition Average Fold
P value Change
3370064 CNN1 Homo sapiens calponin 1, basic, smooth muscle (CNN1), mRNA. 0.483131589 0.001601576 2970706 COL11A1 Homo sapiens collagen, type XI, alpha 1 (COL11A1), transcript variant B, mRNA. 0.374141179 0.0430368 4590541 FRZB Homo sapiens frizzled-related protein (FRZB), mRNA. 2.019356169 0.021059884 6290440 no information UI-H-DI0-avn-b-11-0-UI.s1 NCI_CGAP_DI0 Homo sapiens cDNA clone IMAGE: 0.479095448 0.002591653
5881642 3, mRNA sequence
3120093 no information RST21962 Athersys RAGE Library Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 0.477017153 0.008553418 1170075 HSPB3 Homo sapiens heat shock 27kDa protein 3 (HSPB3), mRNA. 0.435177593 0.034243937 50341 IGF2 Homo sapiens insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (IGF2), mRNA. 0.420390437 0.032024747 4390487 KRTHA4 Homo sapiens keratin, hair, acidic, 4 (KRTHA4), mRNA. 0.481806198 0.006493006 1240064 LOC401101 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical LOC401101 (LOC401101), mRNA. 0.383574761 0.026990417
7550113 MGPHomo sapiens matrix Gla protein (MGP), mRNA. 2.378758964 0.004610905
3840193 NPTX1 Homo sapiens neuronal pentraxin I (NPTX1), mRNA. 2.330418086 0.010180884 6940524 PDE5A Homo sapiens phosphodiesterase 5A, cGMP-specific (PDE5A), transcript variant 3, 0.483356716 0.049219782
mRNA.
380400 PDK4 Homo sapiens pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 (PDK4), mRNA. 2.027026672 0.009561186
7610193 PODN Homo sapiens podocan (PODN), mRNA. 0.470499373 0.019169997
2230131 PTX3 Homo sapiens pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 beta (PTX3), mRNA. 0.456475152 0.009733912 630358 RASL12 Homo sapiens RAS-like, family 12 (RASL12), mRNA. 2.059841938 0.003575785 620220 SLC16A6 Homo sapiens solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), 2.064661273 0.004770033
member 6 (SLC16A6), mRNA.
7330167 TMEM100 Homo sapiens transmembrane protein 100 (TMEM100), mRNA. 2.046441144 8.01E-04 1430519 TPD52L1 Homo sapiens tumor protein D52-like 1 (TPD52L1), transcript variant 3, mRNA. 0.340564588 0.026558743
Fig. 4. Changes in gene expression level in cell communication. COMP, COL5A3 were up-regulated and KRT18, COL11A1, KRTHA4, KRT7 and KRT19 were down- regulated.
IV family), DUSP4 (Dual specificity protein phosphatase 4)이 up-regulation 을 보였다 (Fig. 5). Focal adhesion에서는 COMP, COL5A3 up-regu- lation, COL11A1, MYLK (myosin lightchain kinase) down-regulation을 보였고 (Fig. 6) Cytokine-cytokine receptor interaction에서는 LEPR, IL7R, TNFRSF21 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 21) down- regulation을 보였다 (Fig. 7). Calcium signaling pathway에서는 OXTR (Oxytocin receptor), ADRA1B (alpha-1B adrenergic receptor), MYLK down-regulation을 보였고 (Fig. 8), Jak-STAT signaling pathway에 서는 LEPR, IL7R down-regulation을 보였다 (Fig. 9). ECM-receptor interaction에서는 COL5A3이 up-regulation되었고 COL11A1은 down-regulation 되었다 (Fig. 10).
고찰
인간치은섬유아세포는 임플란트의 성공에 중요한 역할을 한다. 인간치은섬유아세포는 focal adhesion을 통하여 세포-기 질 접착을 얻고, extracellular matrix를 통해 타이타늄에 부착하여 생체 내와 기질을 연결시킨다.7이전 연구에 의하면, 마이크로 그루브 표면에서 인간치은섬유아세포의 증식이 크게 증가되 고 세포 부착, 증식에 관여하는 유전자와 단백질의 발현이 유 도되었다. 이 때 다양한 pathway들이 상호작용을 하는데, 본 연 구에서는 평활면과 마이크로그루브 표면에서의 유전자 발현 량 변화를 확인하여, 관련이 있는 pathway를 확인할 수 있었다.9
Fig. 5. Changes in gene expression level in MAPK signaling pathway. PLA2G4A, DUSP4 were up-regulated.
Fig. 6. Changes in gene expression level in Focal adhesion. COMP, COL5A3 were up-regulated and COL11A1, MYLK were down-regulated.
Fig. 7. Changes in gene expression level in Cytokine-cytokine receptor interaction. LEPR, IL7R, TNFRSF21 were down-regulated.
Fig. 8. Changes in gene expression level in Calcium signaling pathway. OXTR, ADRA1B, MYLK were down-regulated.
Fig. 9. Changes in gene expression level in JAK-STAT signaling pathway. LEPR, IL7R were down-regulated.
Fig. 10. Changes in gene expression level in ECM-receptor interaction. COL5A3 were up-regulated and COL11A1 were down-regulated.
Table 2. Changes of gene expression level were determined at the pathway lev- el using the KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway analysis
KEGG Pathway Gene Counts P value
Cell Communication 7 0.000073569
Complement and coagulation cascades 5 0.000433321 Neuroactive ligand-receptor interaction 4 0.276761519
Focal adhesion 4 0.134891082
Pathogenic Escherichia coli infection - EPEC 3 0.012003497 Pathogenic Escherichia coli infection - EHEC 3 0.012003497 Cytokine-cytokine receptor interaction 3 0.412359373
Calcium signaling pathway 3 0.242534299
Tryptophan metabolism 2 0.171837324
PPAR signaling pathway 2 0.148963889
MAPK signaling pathway 2 0.74403581
Limonene and pinene degradation 2 0.019351012
Jak-STAT signaling pathway 2 0.402929581
Glycan structures - biosynthesis 2 2 0.114916044
Fatty acid metabolism 2 0.070889146
ECM-receptor interaction 2 0.195272941
Arachidonic acid metabolism 2 0.070889146
Alzheimer's disease 2 0.034722279
Adipocytokine signaling pathway 2 0.15147238
Cell communication pathway는 골격 형성 및 분화에 작용하는 세 포 접합과 관계된 유전자들에 대한 유전자 변화량을 확인할 수 있었다.10본 연구에서 cell communication과 관련된 유전자 중 1.5배 이상 증가된 유전자는 COMP, COL5A3이었다. COMP는 주로 섬유성 반흔이나 전신 경화증에서 보이고 혈관벽 재형성 에 관여하는 단백질이다.11COMP의 증가는 세포의 재생능력 증가로 볼 수 있고, 따라서 마이크로그루브 표면에서의 세포 재생과 관련된 인자가 증가하였다고 할 수 있다. COL5A3은 Type V collagen의 일종으로, Type V collagen은 양은 적지만 세포 외기질에서 fibril 형성에 관여하는 조절자이다.12Fibronectin이 α5β1 integrin (green)에 부착할 때 세포골격에서 integrin의 함입은 fibril 형성과 함께 fibronectin의 구조적 변화를 유발한다.13추가적 인 receptor (orange bars)가 fibronectin에 부착하고, 이 때 Type V col- lagen은 1형 Collagen, procollagen I과 함께 fibril 표면의 fibronectin과 연결된다. 활성화된 collagen integrin은 collagen과 결합하여 fibril 형 성을 가능하게 하는 구조적 변화를 일으킨다. 마이크로그루브 표면에서 발현이 증가된 두 유전자 모두 조직을 재생하는 데 에 기여하는 유전자이다. 이 유전자들은 focal adhesion pathway와 도 관련이 있으며 focal adhesion은 세포 이주, 증식, 분화, 유전자
조절, 세포 생존에 중요한 역할을 한다.14
MAPK signaling pathway에서는 PLA2G4A (phospholipase A2 group IV family), DUSP4 (Dual specificity phosphatase 4)이 증가되었 다. MAPK signaling pathway는 세포 증식을 유도한다.15PLA2G4는 MAPK/ERK dependent phosphorylation에 의해 활성화되고 세포질 에 Ca2＋농도가 상승하면, 소포체 또는 핵막으로 이행하여 아라 키돈산을 유리한다. 이는 세포막의 형성에 기여한다.16DUSP4 는 phosphoserine/threonine, phosphotyrosine을 탈인산화시킴으로써 표적 키나아제를 불활성화시킨다. 이는 세포 증식과 분화에 관련된 MAPK superfamily (MAPK/ERK, SAPK/JNK, p38)의 양 을 줄인다. 하지만 본 연구에서 MAPK/ERK, SAPK/JNK, p38과 관 련하여 감소된 양을 보이지 않았기 때문에 superfamily가 과하게 활성화되는 것을 조절한 것으로 사료된다.17
Cytokine-cytokine receptor interaction에서는 LEPR (Leptin receptor), IL7R (Interleukin 7 receptor), TNFRSF21 (tumor necrosis factor recep- tor superfamily member 21)이 감소되었다. Cytokine-cytokine recep- tor interaction은 세포 성장, 분화, 사멸, 항상성 유지에 영향을 준 다.18LEPR은 leptin의 receptor로, leptin과 부착하여 신진대사를 증진시킨다. 본 연구에서 LEPR의 양이 평활면에서보다 마이크 로그루브 표면에서 더 적어진 것으로 보아 상대적으로 분화보 다는 축적이 더 일어날 수 있었음을 유추해볼 수 있었다.19IL7R 은 interleukin 7의 receptor로, interleukin 7은 B 세포 전구체의 증식 과 T 세포 활성화를 유도한다. IL7R의 감소는 B 세포가 이미 충 분한 양을 보일 때 일어나고, 본 연구에서 IL7R이 감소된 것은 항상성의 유지를 위한 것으로 보인다.20TNFRSF21의 down-regu- lation으로 casp3의 활성화가 억제되어 세포사멸이 줄어 들고, 세포의 생존율은 증가하였을 것이다.21
Calcium signaling pathway에서는 OXTR (Oxytocin receptor), ADRA1B (alpha-1B adrenergic receptor), MYLK가 감소하였다.
Calcium signaling pathway은 항상성을 유지하게 한다.22Oxytocin은 자궁수축호르몬으로 알려져 있고 유즙 방출, 신경전달물질 역 할 등 여러 작용을 하는 것으로 알려져 있고, 본 연구에서의 감 소된 양에 대해서는 더 연구가 필요해 보인다. Jak-STAT signaling pathway에서는 LEPR, IL7R가 감소하였다. Jak-STAT signaling pathway은 성장, 항상성과 관련된 cytokine과 성장인자를 조절하 는 데에 관여한다.23ECM-receptor interaction에서는 COL5A3이 증가되었고 COL11A1은 감소되었다.
KEGG pathway를 통해 유의한 유전자들과 관련이 있는 path- way에 대한 정보를 얻을 수 있었다. 하지만 같은 pathway 내에 있 는 유전자의 증가 혹은 감소 이외의 추가적인 정보가 없었기 때문에 pathway의 정확한 기전에 대한 영향을 평가하기는 어 려웠다. 이에 따라, 표면 차이에 따른 유전자의 증감에 대한 추 가적인 연구 및 검증이 필요하다.
결론
본 마이크로그루브 표면이 평활한 표면에 비해 인간치은섬
유아세포의 이주, 분화, 증식을 더 많이 증가시켰다는 연구결 과와 관련이 있는 결과를 도출하였다. 마이크로그루브 표면은 다양한 유전자의 발현을 up-regulation 혹은 down-regulation시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 마이크로그루브에 대한 연구가 지 속되면, 마이크로그루브는 유전자 발현 변화 및 세포신호 전 달 활성화 등을 통한 세포활성도 증진을 필요로 하는 다양한 생체재료들의 표면으로 활용될 수 있을 것이다.
ORCID
Kyungho Lee https://orcid.org/0000-0002-7546-0525 Richard Leesungbok https://orcid.org/0000-0002-8381-723X Su-Jin Ahn https://orcid.org/0000-0003-2128-1561
Su-Jung Park https://orcid.org/0000-0002-4111-2231 Suk Won Lee https://orcid.org/0000-0003-2726-3567
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마이크로그루브 상 인간치은섬유아세포의 유전자 발현 분석: DNA microarray 연구
이경호1∙이성복2∙안수진2∙박수정2∙이석원2*
1경희대학교 대학원 치의학과, 2강동경희대학교치과병원 보철과 경희대학교 치과대학, 치의학전문대학원 치과보철학교실
목적: 마이크로그루브 상 인간치은섬유아세포의 유전자발현감식을 DNA microarray를 이용하여 연구하는 것이다.
재료 및 방법: Grade II 티타늄 시편을 이용하여 표면에 마이크로그루브(폭/깊이: 60 ㎛/10 ㎛, E60/10)를 형성하고 불산으로 산에칭하여 실험군으로 사 용하였다. 표면처리를 하지 않은 평활한 티타늄 표면(NE0)을 대조군으로 사용하였다. 실험군과 대조군에 인간치은섬유아세포를 배양한 후 total RNA를 추출하였다. Oligonucleotide microarray를 시행하여 실험군과 대조군 간 다양한 유전자 발현량의 변화를 확인하였다. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway analysis를 통해 DNA chip의 발현 결과를 mapping하여 실험 조건에 따른 유전자 발현량의 변화를 pathway 수준에서 파 악하였다.
결과: E60/10 마이크로그루브 표면과 NE0 표면에 대한 유전자 발현량 비교분석 결과, NE0 표면에 비하여 E60/10 마이크로그루브 표면에서 1.5배 이 상 유의한 발현 차이를 보인 유전자는 123개, 2배 이상 유의한 발현 차이를 보인 유전자는 19개였다. 실험 조건에 따른 유전자 발현량의 변화를 KEGG pathway analysis를 통하여 확인하였고, 다양한 유전자 발현 결과들 중 대표적인 세포접착, 증식, 활성 관련 세포신호전달을 규명하였다.
결론: 마이크로그루브 표면은 다양한 유전자 발현 변화를 유도하고 관련 세포신호 전달을 유도한다. 본 연구의 결과에 따라서, 마이크로그루브는 유전자 발현 변화 및 세포신호 전달 활성화 등을 통한 세포활성도 증진을 필요로 하는 다양한 생체재료들의 표면으로 사용될 수 있다. (대한치과보 철학회지 2017;55:361-71)
주요단어: 티타늄; 마이크로그루브; 인간치은섬유아세포; 유전자 발현 변화
*교신저자: 이석원
05278 서울 강동구 동남로 892 강동경희대학교치과병원 생체재료보철과 02 440 7519: e-mail, [email protected]
원고접수일: 2017년 6월 8일 / 원고최종수정일: 2017년 9월 11일 / 원고채택일: 2017년 9월 14일
2017 대한치과보철학회
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※이 연구는 한국연구재단(National Research Foundation)의 기초 연구자 지원 사업(Basic Science Research Program)의 지원을 받아 연구되었음(NRF- 2015R1D1A1A01057956).
