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藥 學 舍 확고초균에서 폴리페놀로 유도된 DNA 손상에 대한 폴리페놀산화효소의 억제효과
김 안 근 # ■ 김유경 ■ 강 영 숙
숙명여자대학교 약학대학(Received July 2 1, 2005; August 19
，2005)
The Inhibitory Effect of Polyphenol Oxidase on Polyphenol-Induced DNA Damage of B acillus subtilis
A n K eu n K im # , Yoo K y u n g K im and Young-Sook K ang College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, Seoul 140-742， Korea
A bstract — Antimutagenic activity of the enzymatic browning reaction products (EBRPs) was investigated by using the spore rec-assay with Bacillus subtilis strains H I7 (rec+) and M45 (rec"). The EBRPs tested were prepared from the reac
tions of five different kinds of polyphenols with polyphenol oxidase isolated from the leaves Perilla frutescens. In the spore rec-assay, most of the polyphenolic compounds tested showed positive, whereas only their tested compound showed neg
ative respectively. In addition of polyphenol oxidase inhibitors such as cysteine, glutathione and ascorbic acid to the reaction mixtures consisted with the polyphenol oxidase and polyphenols, the mutagenic effects were increased in the spore rec- assay. These results show that the activity of polyphenol oxidase may play an important role in the reduction of mutagenicity of polyphenols.
K eyw ord s □ polyphenol oxidase, Perilla frutescens, rec-assay, enzymatic browning reaction product
Polyphenol oxidase(PPO
)는copper
를함유한metalloprotein
으로monophenol01 (?-diphenol
로hydroxylation
되는반응을촉 매(cresolase, tyrosinase, monophenol monooxygenase[E.C.
1 .1 4 . 1 8 . 1 J
)할뿐만아니라0-dihydoxyphenol
이o-quinone
으로산 화되는것도촉매(catecholase, diphenol oxygen oxidoreductase (E .C ,1.10 .3 .2
])하는효소이다.10
PPO
는세포의 파괴(crushing),
노화 과정에서 활성이조절되며폴리페놀물질의 산화결과로갈변현상이 나타나게 된다
.
많 은폴리페놀화합물이 항산화작용이 있는것으로알려져 있으 나폴리페놀1
화합물이 강한돌연변이원성이 있는것으로도보고되어 있다
.
폴리페놀화합물이 효소와반응하여quinonoid
를생성하게 되면이물질은강력한친전자성을지니기 때문에 자 동산화
,
교차(cross-linking)
및melanin
형성등의 다양한반응이#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-710-9561 (팩스) 02-710-9871 (E-mail) akkim@sookmyung.ac.kr
이차적으로일어나서효소적 갈변반응물질을생성2>하게된다
.
이 와같이폴리페놀물질이산화되어갈변되면변이원성이급격히저하되는것으로보고되어 있다
.3>
저자등은고초균에서 페놀성물질에 의한
DNA
손상이P P
ᄋ의 작용에의해억제되는 현상은
PPO
효소의 작용으로페놀성 물질의 감소에의한것인지또는생성된갈변물질의 작■용세의한것인지를알아보기위하여 연 구에착수하였다
.
폴리페놀물질단독과이들폴리페놀화합물이
P P
ᄋ에의한효소반응 결과생성되는 갈변물질,
또한폴리페놀물질및
PPO
에효소저해제를첨가시켜 얻은결과를검토하여고초균의
DNA
손상에미치는영향에 대해일부의지견을얻었으므로보고하고자
^
다.
재료 및 방법
실험재료
본실험에
P P
ᄋ효소를얻는데시용된들깨(Perilla frutescens)
잎은서울근교에서 채취하여
-70oC
에서보관한후入!
용하였다.
330
고초균에서 폴리페놀로 유도된 DNA손상에 대한 폴리페놀산■화효소의 억제효과 331
시약및기기
실험에 사용한 시약은
sodium dodesylsulfate, gallic acid (Junsei)， bovine serum albumin, Mmtylcatechol
，tris(hydroxy- methyl)aminomethane, ammonium persulfate, 3-methyl-2- benzo-thiazolinone hydrazone, pyrocatechol, chlorogenic acid, polyvinyl pyrrolidone(PVP), hydrocaffeic acid, 4-nitroquinoline- N-oxide(Sigma), 4-methylcatechol(Aldrich), Nutrient Broth, Bacto agar B ee f Extract, Dextrose(Difco)
이고，사용기기는Ultracentrifuge(Beckman OptimaTM XL-100k), Dialysis sacks (Sigma Diagnostics), pH Meter(Mettler Delta 340), Centrifuge (Hanil Supra 2 1K ), Freeze D ry System(Labconco), Labo Autoclave(Sanyo), Vortex mixer: Thermolyne M axiM ix II, MultiTemp III, Spectrophotometer(Pharmacia Biotech.), Microcuvettes(Kartell), Waterbath(Buchi Laboratoriums-Technik AG), Microcentrifuge(Hanil Micro-12), Haemacytometer (Superior; Germany), Plate(Becton Dickinson Labware)
이며，기타시약들은시판특급
(guaranteed reagent)
및1
급시약을사 용하였다.
효소의추출
70oC
에보관된들깨잎을교반기에 넣고10 mM ascorbic acid
와2% sodium chloride, 3% Triton X - 114
를포함하는50 mM phosphate buffer(pH 6.0
)를4
배량가하여 교반기에서1
분간분 쇄한후하루밤 방치하여8
겹의 거어즈로 여과하였다.
여액을35 0C
에서15
분간방치한후10 ,000X g
로상온에서원심분리하 여상증을취하여 이를50 mM phosphate buffer(pH 6.0
)로하 루밤동안투석하여효소로 용하였다.
M 45(Rec')
두균주의 포자를조제하였으며，포자형성에 사용한배지는우선
, Difco nutrient broth 16 g i
：적당량의 증류수에용 해하고Difco bacto agar 1 5
요을가해autoclave
중에서 가열용 해한 후, 50°C
정도로 냉각시키고 여기에KC1 2 g , M gS
ᄋ4 • 7H20 0.5 g, MnCl2 10.8 mg, F e S 0 4 • 7H
2ᄋ278 (xg, C a(N 03)2 • 4H20 236 mg, glucose 1 g
의stock solution
을가하여1
/가 되 게 만들었다.
포자 한천 배지의 조제는8
용의Difco nutrient broth
를중류수에 완전히 용해한 후1 5
요의Difco bacto agar
를가하여
autoclave
에서 가열 용해하였다.
같은 배지를2
본조제하여 용해한
broth agar
가50°C
정도까지 냉각되면 포자 액을1 /
당10 m/
가해H17
및M 45
한천을 각각 조제한 후plate
상에10 m
/씩 분주하여H17
및M 45
포자 한천 배지를 고화시켰다.
고화된 포자 한천 배지 위에 직경6 m m
，두께1 m m
의paper disc
를plate
당3
개씩 올려놓고 시료 용액을1 5 yd, 10
너, 5
^/씩 가한 다음3 70C
에서2 7
시간배양시킨 후paper disc
주위에 생성된 생육저지대의 직경을측정하여M 45
균포자 한천배지에 생성된 생육저지대와
H IT S
포자한천배 지에 나타난 생육저지대 간의 차이를 계산하여 실험에 사용된시료가고초균의
DN A
에미치는 손상정도에 대한 강도로표시하였다
.
자료분석 및통계처리
모든시험결과는평균±표준편차로표기하였고통계적 유의성 은
Student’s t-test
로하였으며p
값이0.05
미만일때통계적으 로유의하다고판단하였다.
결과 및 고찰
단백질정량
단백질의 함량은
bovine serum albumin
을표준품으로하여trichloroacetic acid
와Folin-Ciocalteu
시약을 사용하는TCA- Low ry
법4〉으로측정하였다.
효소액과갈변반응생성물의조제
추출한효소를 기질특이성 실험에 사용하였던
5
종의 폴리 페놀 화합물(pyrogallol, 4-methylcatechol, pyrocatechol, t- butylcatechol, gallic add
)과24
시간동안최적온도(450C
)에서반 웅시켜 갈변반응액을얻었다.
이반응액을Whatman No. 2
여과 지로여과한후투석막에 넣어48
시간동안물로투석하였다.
투 석후동결건조하고,
동결건조된 갈변반응 생성물을dimethyl
sulfoxide(DMSO
)에용해하여 실험에사용하였다.
Spore rec-assay
Kada
등의 방법5’6)에 의하여Bacillus subtitis H 17(R ec+)
및PPO
에관하여 많은 연구가 수행되어 왔으나 그 생리학적 기능과 세포내 위치에 대해서 잘알려져 있지 않는데 그이유 중의 하나는효소의 추출과정제의 어려움일 것으로사료된다.
따라서 최근에Triton X - 114
를 이용한temperature-induced
phase separation
으로서 페놀성 물질과클로로필이 다량 제거된latent form
의P P
ᄋ를부분정제7
ᅵ12)하는둥다양한 정제법에 대 한연구i
：U
4)가계속되고있다.
이에 본실험에서는PPO
를추출 하는데phosphate buffei
■에Triton X - 11 4
를3%
첨가하여3 5 0C
에서
1 5
분간방치함으로서온도에따라서층이 분리되는정제법을이용하여효소가함유된상층의 액을취하여 그 액을원심분 리하여 효소액으로사용하였다
(Table I).
일반적으로
P P
ᄋ의기질로사용되는5
종의폴리페놀 화합물만 을가한경우(Table II
)와폴리페놀1
화합물에P P O *
각각반응 시켜 얻은 갈변생성물,
즉효소반응 생성물(enzymatic reaction
product
)이고초균의DNA
에미치는손상정도를검토해본결과(Table III
)，기질로사용된5
종의 폴리페놀 화합물만을 가한 경Vol. 49, No. 4’ 2005
Table I - Extraction of the polyphenol oxidase from the leaves of Perilla frutescens
Purification procedure Enzyme activity (Units/m/) Protein (mg/m/) Specific activity (Units/mg) Purification (fold) Crude enzyme
Temperature-induced phase separation (upper phase)
12,884 2,589
5.3 0.058
2,431 44,538
1 18
Table II - Results of the spore rec-assay on the polyphenol
Test compound Inhibition zone (mm)
Conclusion
H17(Rec+) M45(Rec)
4-Methylcatechol 2.0± 0.2 6.4±0.2 4.4±0.5** ±
^-Butylcatechol 4.4±0.1 7.3±0.2 2.9±0.3**
Pyrogallol 2.2±0.3 7.1±0.6 4.9±0.9* +
Pyrocatechol 1 .1 ± 0.1 4.4±0.7 3.3±0.6*
Gallic acid 0.53 ±0.06 1 .0± 0.1 0.47±0.10* ±
Dimethyl sulfoxide0 0 0 0 -
Enzyme 0 0 0 -
4-Nitxoquinoline-N-oxide 1 ± 0.10 15 ±0.67 14±0.77** + +
No inhibition zone; ± , Length of inhibition zone is less than 5 mm; +
，5 —10 mm of inhibition zone; + + , 10 —15 mm of inhibition zone; + + + , more than 15 mm of inhibition zone.
The data were expressed as means ±S.D. for 3 experiments. Asterisks denote a significant difference compared with the control group0 (*p<0.05 and **p<0.01).
Table III - Results of the spore rec-assay on the enzymatic browning reaction product (EBRP)
Test compound Inhibition zone (mm)
Difference Conclusion
H17(Rec+) M45(Rec")
4-Methylcatechol EBRP 0 0 0
-/-Butylcatechol EBRP 0 1 ± 0.10 1 ± 0.10** ±
Pyrogallol EBRP 0 0 0 -
Pyrocatechol EBRP 0 0 0
-Gallic acid EBRP 0 0 0
-Dimethyl sulfoxide0 0 0 0 -
Enzyme 0 0 0 -
4-Nitroquinoline-N-oxide 1 ± 0.10 15±0.67 14±0.77** + +
-， No inhibition zone; ± , Length of inhibition zone is less than 5 mm; +
，5
〜10 mm of inhibition zone; + +
，10 —15 mm of inhibition zone; + + + ， more than 15 mm of inhibition zone.
The data were expressed as means ±S.D . for 3 experiments. Asterisks denote a significant difference compared with the control group0 (**p < 0.0 1).
우에는
Bacillus subtitis H 17
및M 45
균주에대해서pyrogallol>
4-m ethylcatechol > pyrocatechol, ^-butylcatechol > gallic acid
순으로 양성을 나타내어 고초균의
D N A
에손상을 주었으나(Table II
)，이들 폴리페놀 화합물의 효소적 갈변물질들은t-
butylcatechol
에서 약한양성이 나타나는것을 제외하고는 전부 음성을 나타내어
(Table III)
，PPO
를폴리페놀 화합물에 가하여 갈변물질이 형성되면
DNA
손상을 일으키지 않는다는 것 을 알수 있었다.
양성 대조물질로는 발암물질로 알려진4-
nitroquinoline-N-oxide
를사용하였고，효소반응 생성물을용해하는데 사용한
dimethyl sulfoxide(DM SO
)와 효소만의 단독 작용을 알아보기 위해 효소를불활성화 시킨 후실험한 결과,
이들은Bacillus subtitis H17
및M 45
균주에 대해서 아무런영향도 미치지 않았다
(Table III).
본실험에서 나타난이러한결과들은사과15>나곰취
,
참취및 참나물， 적색자두2>의효소반응 생성물에서 밝혀진사실들과 도일치하는것으로보아많은폴리페놀화합물이대부분돌연 변이원성이 있는 것으로나타났으나 이러한특성을가진폴리 페놀화합물이 이들을산화시키는효소와반응하여 갈색화되 면변이원성이 급격히 저하되는것으로나타난다는 이전의보 고들3’15'16>을 뒷받침해준다.
또한DNA
에손상을 일으키는폴리페놀화합물이
P P
ᄋ에의해손상능력이 달라지는지를확인하기위해폴리페놀
1
화합물과PPO
의혼합물에P P 0
활성저해물질 로잘알려져 있는cysteine, glutathione
및ascorbin acid
둥 의항산화제를각각세가지 농도로 첨가하여DNA
손상을검/. Pharm. Soc. Korea
고초균에서 폴리페놀로 유도된 DNA 손상에 대한 폴리페놀산화효소의 억제효과 333
Table IV - Effects of PPO Inhibitor on DNA Damage reduced by PPO from Perilla frutescens Leaves
Inhibitor Concentration (mM)
Inhibition zone (mm)
- Difference H17(Rec+) M45(Rec")
1 0 1 ± 0.10 1 ± 0.10**
Cysteine 0.5 0 0.5±0.05 0.5±0.05**
0.25 0 0 0
10 0 1 ± 0.02 1 ± 0.02**
Glutathione 5 0 0.5 ±0.05 0.5±0.05**
2.5 0 0 0
0.05 0 1 ± 0.10 1±0.09**
Ascorbic acid 0.025 0 0.5±0.08 0.5 ±0.08**
0.0125 0 0 0
Composition of the reaction mixtures are as follows substrate:
4-methylcatechol enzyme: polyphenol oxidase isolated from Perilla frutescens Leaves enzyme inhibitors: cysteine, glutathione, ascorbic acid.
The data were expressed as means ±S.D . for 3 experiments.
Asterisks denote a significant difference compared with the control group (**p < 0.0 1).
토한 결과저해제에 의해농도의존적으로
DNA
의손상이 증가되는 것으로나타났다
(Table IV).
이는저해제의 첨가에의하여기질인폼리페놀화합물이
P P
ᄋ과반응하여 생성된o-quinone
류 중일부가환원력을가진ascorbic acid
에의하여다시DN A
손 싱을주는폴리페놀물질로환원되거나cysteine
이나glutathione
등의thiol
화합물과o-quinone
이2
차반응물을 생성하기 때문이라고 사료된다
.
갈변물질 자체가DNA
손상 감소눙력이 있는지를 검토하기위해폴리페뉴화합물에 이화합묶의 효소반 응 생성물인 갈변생성물의농도를 다양하게 변화시켜 첨가하였
을때에도
DNA
손상 정도에는oi
무런 변화가없는 것으로나타났다
.
이상의 실험결과로부터 폴리페놀화합물 단독일때보다이들
페놀성 화합물과
PPO
와의 반응 생성물인경우가DNA
에대한손상능력이낮아지는 것은효소적 갈변반응에의해폴리페놀물 진의함량이 감소하기 때문이라고볼수있으며
,
또한폴리페녹 화합물에이화합물의 반응생성물인갈변생성물의 농도를달리 하여 첨가하였을때에도DNA
손상정도에는^무 런 변화가없었으므로폴리페녹 화합물로인한
DNA
손상을감소시키는 데는
PPO
가중요한역할을한다고볼수있다.
결 론
페놀성 물진로인한
DNA
손상에 있어서폴리페놀산화효소(PPO
)의억제효과를spore rec-assay
결과를통해?
ᅵ토하였다.
폼리페놀 화합물인pyrogallol, 4-methylcatechol, pyrocatechol, f-butylcatechol
및gallic acid
단독으로는대부분고초균의DNA
에손상을 일으키며，대체적으로폴리페놀 농도가증가함에 따라생육저지력도촉진되는경향을보였다
.
그러나폴리페놀 화합물들이
P P
ᄋ의작용을받아서 갈변물질로변한 경우에는DN A
손상을거의일으키지 않았다
. PPO
의활성저해물질인cysteine,
glutathione
및ascorbic acid
등의농도를증가시킴에 따라D N A
손상도증가되는것으로나타나
PPO
가페놀성 물질에 대한 고초균의
DNA
손상을 감소시키는데 중요한 역할을 하는 것이라료된다
.
감사의 말씀
본연구는숙명여자대학교
2004
년도교내연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에감사드립니다.
참고문헌
