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The Anti-oxidative and Anti-inflammatory Effect of Lonicera Japonica on Ulcerative Colitis Induced by Dextran Sulfate Sodium in Mice

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금은화 추출물의 항산화, 항염증 효과가 Dextran Sulfate Sodium으로 유도된 생쥐의 궤양성 대장염에 미치는 영향

차호열1․정아람1․천진홍1․안상현2․박선영3․김기봉1

1부산대학교한방병원 한방소아과

2동국대학교 한의과대학 해부학교실

3세명대학교 한의과대학 생리학교실

Received: July 30, 2015∙ Revised: August 13, 2015 ∙ Accepted: August 14, 2015 Corresponding Author: Kim Ki Bong

Department of Oriental Pediatrics, Pusan National University Korean Medicine Hospital, 20, Geumo-ro, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, Republic of Korea.

Tel: +82-55-360-5952, Fax: +82-55-360-5952 E-mail: kkb@pusan.ac.kr

ⓒ The Association of Pediatrics of Korean Medicine. All rights reserved. This is an open-access article distributed under the tenus of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), http://dx.doi.org/10.7778/jpkm.2015.29.3.054

Abstract

The Anti-oxidative and Anti-inflammatory Effect of Lonicera Japonica on Ulcerative Colitis Induced by Dextran Sulfate Sodium in Mice

Cha Ho Yeol1․Jeong A Ram1․Cheon Jin Hong1․Ahn Sang Hyun2 Park Sun Young3․Kim Ki Bong1

1Department of Pediatrics of Korean Medicine, Pusan National University Hospital

2Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Dongguk University

3Department of Physiology, College of Korean Medicine, Semyung University

Objectives

This study was to investigate the anti-oxidative and anti-inflammatory effect of Lonicera japonica water extracts (LE) on Ulcerative Colitis Induced by DSS (Dextran Sulfate Sodium) in Mice

Methods

Colitis was induced by DSS in Balb/c mice. The sample group was divided into three. The mice in control group were not inflammation-induced. The pathological group was composed of untreated colitis elicited mice. The experimental group was administered Lonicera japonica water extracts (LE) after colitis elicitation. The effects on ulcerative colitis were evaluated the anti-oxidant effect, inhibition of COX-2 mRNA expression, the morphological change of colonic mucosa, decrease effect of HSP 70 and COX-2 in mucosa.

Results

The SOD ability of LE was dose-dependently increased and the LPS-induced COX-2 mRNA expression of LE was dose-dependently decreased. LE showed the protective effects on DSS-induced experimental colitis. LE inhibited shortening of colon length, the hemorrhagic erosion in colonic mucosa. LE also showed the decrease effect for HSP70 and COX-2 in mucosa.

Conclusions

The current results demonstrate the clinical utility of LE in traditional medicine and indicate the possible treatments for ulcerative colitis from natural products. Further investigations for exact mechanisms will be needed.

Key words : Lonicera japonica, Ulcerative colitis, Anti-inflammatory activity, Anti-oxidative activity, Dextran sulfate sodium (DSS)

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Ⅰ. Introduction

궤양성 대장염 (ulcerative colitis, UC)은 대장의 점막 또는 점막하층에 국한된 염증을 특징으로 하는 원인불 명의 만성 염증성 장질환으로, 호전과 악화가 반복되 는 혈성 설사와 대변급박감 (urgency) 및 복통 등을 주 증상으로 한다1,2). 궤양성 대장염은 유전적, 환경적 요 인이 복합적으로 작용하여 발생하며, 환자는 전 세계 적으로 분포하지만 북미와 북유럽에서 가장 호발한다.

인종별로는 유태인과 코카시안에서 발생이 많고 동양 인에서는 상대적으로 드물다2,3). 하지만 최근에는 남유 럽과 우리나라를 포함하는 아시아 국가, 그리고 다른 개발도상국에서도 발병률이 증가하고 있으며, 궤양성 대장염으로 인해 고통을 받는 환자들이 점점 더 늘어 나고 있다3,4).

우리나라에서는 1970년대부터 궤양성 대장염 증례 가 보고되기 시작하여5) 1980년대 이후로 이 질환의 임 상상을 정리한 논문이 발표되었으며6) 발병률과 유병률 이 서구에 비해서는 높지 않으나 최근 빠르게 증가하 고 있다7). 국내 궤양성 대장염 유병률은 인구 100,000 명당 30.87명 정도로 추정된다8). 발병연령은 서양연구 와 같이 젊은 나이에 흔하며, 20-40대의 연령에서 가장 빈도가 높다9). 남녀비는 1 : 1.1-1.3으로 여성이 약간 더 많다10). 국내 궤양성 대장염 환자의 1.6-2.0%는 궤 양성 대장염의 가족력이 있으며 이는 서구에 비해 낮 지만 궤양성 대장염 환자의 일차 친족 (부모, 형제, 자 식)에서 궤양성 대장염 발병 위험도는 일반인에 비해 14.2배로 서구에 필적한다11).

궤양성 대장염 치료의 목표는 증상과 점막의 염증 을 호전 시켜 관해를 유도하고 가능하면 오랜 기간 동 안 관해를 유지 하여 환자의 삶의 질을 높이는 것이다.

궤양성 대장염 환자의 약 15%가 위약만으로도 관해 상태에 도달한다고 하지만12) 대부분 환자들에서는 치 료를 받지 않으면 혈변과 설사 등의 증상이 지속되므 로 적절한 치료를 시행하는 것이 바람직하다13). 궤양성 대장염의 표준적인 약물치료로 5-aminosalicylic acid (5-ASA) 제제, 스테로이드, 면역조절약물이 사용되고 있으나 환자의 20~40%는 통상적인 약물치료에 실패하거나 부작용으로 대장절제술을 받게 되어14), 최근에는 부작 용이 적으면서도 대장염에 효과적인 후보 약제를 한약 을 포함한 천연물질에서 개발하고자 하는 노력이 시도 되고 있다15).

한의학에서 염증성 장질환은 만성적인 혈변과 복통,

설사가 주증상이라는 점에서 腸澼, 便血, 腸風, 腸毒, 腹痛, 積聚, 休息痢, 久痢, 久瀉 등의 범주에 해당한다 고 볼 수 있다. 국내에서 염증성 장질환에 대한 한약 처방의 치험례 및 DSS (Dextran Sulfate Sodium)로 유발 된 대장염 동물모델에 대한 한약 처방의 실험적 효과 가 발표된 바 있으나15) 이에 대한 기전 연구가 뒷받침 되지 못하여 치료제 개발로는 이어지지 못하고 있다.

금은화 (Lonicera japonica)는 인동과 (Caprifoliaceae) 에 속하는 인동덩굴 (Lonicera flos Thunberg)의 꽃으로서 한의학에서 청열해독 (淸熱解毒), 양산풍열 (凉散風熱) 등의 효능이 있어 소염 (消炎), 청혈 (淸血), 이뇨 (利尿), 살균 (殺菌) 작용을 나타내어 열성병 (熱性病), 신열무한 (身熱無汗), 화농성질환 (化膿性疾患), 급만성임질 (急慢 性淋疾), 매독 (梅毒), 이질 (痢疾), 농양 (膿瘍), 옹저 (癰 疽), 개선종독악창 (疥癬腫毒惡瘡), 인후종통 (咽喉腫痛) 을 치료하는데 사용되어 왔다16). 금은화에 대한 최근의 연구동향 분석에 따르면 항염증, 독성학 및 간손상, 호 흡기 관련, 피부 관련, 항바이러스 및 항균 효과, 항산 화 효과, 항암 효과의 연구가 있으며, 그 외 코카인 중 독, 막성신증, 망막허혈 및 혈소판 활성 연구 등에 이르 기까지 폭넓은 분야에 걸쳐 연구가 이루어지고 있다17). 이에 근거하여 금은화가 만성 복통, 설사를 주된 증 상으로 하는 염증성 장질환에 효과가 있을 것으로 생 각되나 아직까지 금은화의 항산화효과와 COX-2 발현 억제 효과 및 DSS로 유발된 궤양성 대장염 동물모델 대한 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 금은화를 통한 궤양성 대장염 치료에 활용될 수 있는 근거를 마련하기 위해 금은화의 항산화 효과, COX-2 발현 억제 효과 및 DSS로 유발된 궤양성 대장염 생쥐 에 대한 조절효과를 관찰한 결과 유의성이 있었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. Method and Materials

1. 실험 재료 1) 실험동물

오리엔트 (Korea)에서 분양 받은 태령 4주된 Balb/C 수컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군 (CON군), DSS로 궤양성 대장염 유발군 (CE군), DSS와 금은화 물추출물 동시 처리군 (LT군)으로 나누었으며,

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각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 본 실험은 동국대학 교 동물실험윤리위원회의 심의 (심의번호 2015-006)를 거쳤다.

2) 세포주와 세포배양

실험에 사용한 마우스의 RAW 264.7 macrophages는 Korean Cell Line Bank (KCLB; Korea)에서 구입하였다.

세포는 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma)를 사용하여 배양하였다. 오염 방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖

streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다.

3) 금은화 추출물의 제조와 투여

금은화 (Lonicera japonica)를 증류수 500 ㎖에 넣고 2시간동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 감압․농축 후 동결 건조하여 금은화 물추출물 (LE, 수득률 31%)을 얻었다. LT군에 궤양성 대장염 유발 후 5일 동안 45 ㎎/㎏/day 량으로 구강투여 하였다. 한편 in vitro 실험에서의 LE의 첨가 량 결정을 위해 MTT assay를 실시하였고, LE 10 ㎎/㎖

까지는 세포생존률의 변화가 일어나지 않아 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖를 첨가량으로 결정하였다.

2. 실험 방법

1) 항산화 효과 조사

항산화능력은 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell에 40 mM buffer 2.6 ㎖, ni- troblue tetrazolium 100 ㎕, EDTA/cyanide 200 ㎕, ribo- flavin 100 ㎕, LE 100 ㎕을 넣고 3번 섞어준 다음 Abs 560 nm에서 autozero를 잡고 light box에서 1분 동안 조 사한 후 흡광도를 측정하였다. 이 작업을 7번 반복하여 평균값을 얻은 다음, 시료를 첨가하지 않은 3차 증류수 에 대한 결과와 비교하여 억제율을 계산하였다. 그 결 과를 Buthylated hydroxyanisole (BHA)와 비교하였다.

2) COX-2 발현 억제 효과 조사

금은화가 cyclooxygenase (COX)-2의 mRNA 발현 양상 에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄 반응법 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. RAW 264.7 macrophages - 5 × 105 cells/well을 6 well에 plating 하고 12시간 후에 lipopolysaccharide (1 ㎍/㎖, Sigma)를 2시간 처리하고 LE 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 배양 후 수거한 RNA를 trizol reagent (Sigma)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer (introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다 (Table 1). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평 가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.

3) DSS로 유도된 생쥐 궤양성 대장염의 항염증효과 조사

(1) DSS를 통한 궤양성 대장염 유발

궤양성 대장염을 유발하기 위해 5일 동안 5% (wt/vol) Dextran sulfate sodium (DSS, with a molecular weight of 40,000, ICN, Aurora,OH)을 voluntary administration 시켰다.

(2) 조직표본제작

DSS 처리 후 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였 다. 맹장에서 내림주름창자까지 적출하여 길이를 측정 하고 내림결장만 따로 분리한 후 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방 법으로 paraffin에 포매한 후 5 ㎛ 두께의 연속절편으로

Table 1. The Primer of COX-2 and β-actin mRNA

Primer Primer sequences Product (bp) No. of cycles

COX-2 sense 5'-TCTCCAACCTCTCCTACTAC-3' 624 35

antisense 5'-GCACGTAGTCTTCGTTCACT-3'

β-actin sense 5'-GGAGAAGATCTGGCACCACACC-3' 840 35

antisense 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3' Abbreviation : COX-2, cyclooxygenase-2.

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제작되었다. 일반적인 형태변화를 관찰하기 위해 연속 절편을 Wright's 염색 후 광학현미경 (BX50. Olympus, Japan)으로 관찰하였다.

(3) 창자 점막 손상 스트레스 변화 관찰

점막 손상 스트레스를 조사하기 위해 스트레스에 대한 완충적 물질인 열 충격 단백질 (heat shock protein, HSP)의 하나인 HSP70의 분포 변화를 항HSP70항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편 을 proteinase K (20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 1차 항체인 rabbit an- ti-mouse HSP70 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 4 humidified chamber에서 7일동안 동안 반응시켰다.

그런 다음 2차 항체인 biotinylated goat anti-rabbit IgG2a

(1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 4 ℃ humidified chamber에서 5일동안 link 하였고, 그런 다음 avidin bi- otin complex kit (Vector Lab, USA.)에 1시간동안 실온 에서 반응시켰다. 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB;

Sigma)과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충 용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조 염색하였다.

(4) COX-2 생성 변화 관찰

염증 효소인 COX-2의 조직내 분포를 조사하기 위 해 mouse anti-mouse COX-2 (1:250, Santa Cruz Biotec) 를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.

4) 영상분석과 통계처리

유전자 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였 다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (SPSS INC, USA) 을 통해 student t test로 유의성을 검증하였다.

Ⅲ. Results

1. 항산화효과

금은화 물추출물(LE)의 항산화 효율은 1 ㎎/㎖에서 72.3 ± 0.2%, 2 ㎎/㎖에서 75.2 ± 2.5%, 3 ㎎/㎖에서 77.5 ± 0.9%, 4 ㎎/㎖에서 80.3 ± 1.5%, 5 ㎎/㎖에서 81.2 ± 1.8%, 10 ㎎/㎖에서 89.0 ± 0.9%로 농도-의존 적으로 증가하였다. 금은화 3 ㎎/㎖이하 농도에서는

LE

Fig. 1. The Anti-oxidant effects of Lonicera japonica water extracts.

The SOD ability of Lonicera japonica were dose-dependantly increased. Abbreviation. ●, Buthylated hydroxyanisole (BHA); ▼, Lonicera japonica water extracts (LE)

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Buthylated hydroxyanisole (BHA)보다 우수한 항산화효 능을 나타내었다 (Fig. 1).

2. COX-2 발현 억제

RAW 264.7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현은 증가하였는데, LE 처리 후 농도- 의존적으로 발현이 감소되었다. LE 처리 후 LPS 자극 시 발현되는 COX-2 mRNA 발현량에 비해 0.4 ㎎/㎖에 서 8.9%, 0.6 ㎎/㎖에서 25.7%, 0.8 ㎎/㎖에서 33.3%, 1.0 ㎎/㎖에서 40.2%가 감소하였다 (Fig. 2).

3. DSS로 유도된 생쥐 궤양성 대장염의 항염증효과 1) 창자 길이 변화

대조군의 내림주름창자의 길이는 36.5 ± 0.6 ㎜ 였 지만, DSS 처리로 궤양성 대장염이 유도된 CE군에서는 대조군에 비해 33% 감소한 24.5 ± 1.3 ㎜로 측정되었 다. 그러나 LT군에서는 CE군에 비해 20% 증가한 29.3 ± 1.3 ㎜로 측정되었다 (Fig. 3).

2) 창자 점막 손상 완화 (1) 일반적인 형태 변화

CE군의 점막 표면상피의 많은 부분에서 창자세포와 창자샘이 유실된 출혈성 침식 (hemorrhagic erosion)이 관찰되었는데 (Fig. 4-A), 많은 수의 림프구, 섬유모세 포, 과립백혈구 등 염증관여세포의 침윤 (infiltration)이 점막고유층에서 관찰되었다 (Fig. 4-B). 일부 창자에서 는 창자 점막에서 일어난 출혈성 침식은 점막근층 (muscularis mucosae)을 지나 점막밑층 (submucosa)까지 확대된 것을 확인 할 수 있었다. 표면상피 상층부 (apical surface)에 위치한 창자세포는 거의 손상된 형태 로 나타났고, 솔모양가장자리는 관찰되지 않았다. 한 편 LT군에서는 CE군에 비해서는 출혈성 침식이 완화 된 것으로 나타났으며 (Fig. 4-A), 점막고유층에서도 염 증관여세포의 침식 감소가 확인되었다 (Fig. 4-B). 일부 지역의 표면상피 상층부를 제외하고는 정상적인 창자 세포의 배열을 확인 할 수 있었으며, 솔모양가장자리 도 관찰되었다.

LE

LE

Fig. 2. In Vitro test for anti-inflammation effects of LE.

A. Inhibition of COX-2 mRNA Expression. The RAW 264.7 macrophages were treated with LPS for 1 hours prior to the addition of indicated concentrations (0.4 - 1.0 ㎎/㎖) of LE, and the cells were further incubated for 24 hours. The LPS-induced COX-2 mRNA expression were dose-dependantly decreased in LE treated RAW 264.7 macrophages. B. Relative Intensity for COX-2 mRNA Expression. Abbreviation. LPS, lipopolysaccharide; COX-2, cyclooxygenase-2.

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Fig. 3. The repair effects of colonic length by LE.

A. Photograph of Colon. The colonic length in LE treated mouse was elongated than Dextran sulfate sodium (DSS) only treated mouse. B. Graph for Changes of Colonic Length. Abbreviation. CE, DSS only treated mouse; LT, DSS and LE treated mouse; *, P < 0.05 compared with CE.

Fig. 4. The mitigative effects of DSS induced ulcerative colitis in mouse by LE.

A. The hemorrhagic erosion in mice treated with LE noticeably decreased than DSS only treated mouse (Wright, stain, x40). B.

Enlargement (x1000) of square in A-photo. Abbreviation. LU, lumen; MU, colonic mucosa; SM, submucosa; EM, muscularis externa;

arrow, hemorrhagic erosion.

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(2) 창자 점막 손상 스트레스 변화

DSS 처리로 궤양성 대장염을 유발 후 스트레스에 대한 완충적 물질인 HSP70의 양성반응세포의 분포는 점막고유층에 증가하였으며, 양성반응세포의 핵과 주변세포질에서 강하게 양성반응을 보였다. 이러한

양성반응세포의 분포 증가는 CON군 (601 ± 42/100000 pixel) CE군에서 283% (2803 ± 124/100000 pixel) 증가 하였다. 이에 반해 LT군에서는 CE군에 비해 HSP70 양성 반응세포의 분포가 57% (987 ± 30/100000 pixel) 감소 하였다 (Fig. 5).

Fig. 5. The decrease effect of LE for HSP70 in mucosa.

A. Decrease of HSP 70 positive reacted cell (arrow, HSP70 immunohistochemstry, x200). B. Image analysis of HSP70. Abbreviation.

HSP70, heat shock protein.

Fig. 6. The decrease effect of LE for COX-2 in mucosa.

A. Decrease of COX-2 positive reacted cell (arrow, COX-2 immunohistochemstry, x400). B. Image analysis of COX-2.

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(3) 염증효소 COX-2 분포 변화

염증 효소인 COX-2의 양성반응세포의 분포는 CE 군에서는 증가하는 반면 LT군에서는 감소하였다. 이런 COX-2 양성반응세포는 점막상층부에 분포하였고, 핵 막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. COX-2 양성반응의 영상분석 결과 CE군 (3482 ± 106/100000 pixel) 은 대조군 (470 ± 32/100000 pixel)에 비해 641%

증가하였고, LT군 (1601 ± 77/100000 pixel) 은 CE군에 비해 54% 감소하였다 (Fig. 6).

Ⅳ. Discussion

서구화된 식습관의 증가는 궤양성 대장염 (ulcerative colitis, UC)과 크론병 (Crohn's disease, CD)등의 염증성 대장 질환 (inflammatory bowel disease, IBD)의 발병을 증가시켰으며, 최근에는 한국인의 대장암 사망을 주도 하는 원인의 하나로 인식되고 있다. 이러한 IBD 발병 기전에 관한 다양한 연구가 진행되고 있으며 특히, 전염 증효소 (pro-inflammatory cytokine), 전사인자 (transcription factor), arachidonic acid metabolites, reactive oxygen and nitrogen species (RONS) 등과 같은 염증반응 조절을 통 한 치료법에 많은 관심이 집중되고 있다18-20).

궤양성 대장염의 임상증상들은 염증, 궤양, 직장길 이 감소, 상처 부위에 염증세포의 침윤을 보인다. 현재 사용되는 궤양성 대장염 치료제는 sulfasalazine, mesala- zine 등의 aminosalicylate 제재와 스테로이드 제제가 사 용되고 있으나 완치를 기대할 수 없다. 또한 이러한 약 물들의 장기간 투여 시 구역, 구토, 소화불량, 식욕부 진, 두통 등의 다양한 부작용 발생과 내성이 초래될 수 있다21). 따라서 궤양성 대장염에 대해 유효성과 안전성 이 높은 새로운 치료제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 최근에는 한약이 이러한 질환의 치료제로서 관심이 증가되고 있다22).

금은화 (Lonicera japonica)는 인동과 (Caprifoliaceae)에 속한 인동 (Lonicera japonica Thunb)의 꽃봉오리를 건조 한 것으로 여름철 꽃이 피기 전에 채취한 것을 약재로 사용한다. 性은 寒하고 味는 甘하며 淸熱解毒, 凉血止 血, 散風熱의 효능이 있어 癰腫疔瘡, 腫瘍, 喉痺, 丹毒, 疥癬, 楊梅惡瘡, 五種尸疰, 瘰癧, 痔漏, 熱毒血痢, 風熱 感冒, 溫病發熱 등을 치료하는 대표적인 항염증 약물 이다. 주성분으로는 luteolin, inositol, saponin, tannin과 ginnol, sterols, glycoside, chlorogenic acid, flavonoid 화

합물 및 isochlorogenic acid 등이 있다23).

대식세포 (macrophage)는 전염증 효소인 inducible ni- tric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase (COX)-2를 생산할 뿐만 아니라, IBD 발병 초기의 염증과 면역반응 조절에 중요한 역할을 한다. iNOS에 의한 과도한 nitric oxide (NO)의 생산은 장내 항산화방어체계의 불균형을 초래하여 IBD에서 장내 산화스트레스에 의한 조직손상 을 일으킨다24). 한편 염증 자극으로 유도 발현된 COX-2 는 염증세포와 중추신경계에서 prostaglandin 생합성을 주도하여 만성염증을 유발하는 것으로 알려져 있다25). iNOS와 COX-2를 비롯한 전염증 효소의 생산은 nu- clear factor interleukin-6, fos/jun (AP-1), CCAAT/en- hancer-binding protein (C/EBP) 그리고 nuclear fac- tor-kappa B (NF-κB) 등과 같은 전사인자에 의해 조절 된다26). 특히 NF-κB는 IBD에서 산화스트레스에 의한 염증과 발암과 관련된 유전자의 발현을 조절한다27). 장 내 산화적 스트레스에 의한 NF-κB 활성 기전은 산화 적 스트레스 증가가 IκB kinase로 알려진 IKK (IKKα, β)를 활성화시켜 IκB protein의 serine residue를 인산화 시킴으로서 인산화된 IκB protein은 ubiquitination 되어 26S proteasom에 의해서 분해되며 (degradation), 불활성화 된 상태로 세포질에 존재하는 nuclear factor (NF)-κB는 핵으로 들어가 target 유전자의 NF-κB binding site (con- sensus sequence: 5'-GGGpuNNPyPyCC-3')에 결합하여 염증관련 유전자의 발현을 유도한다28).

이와 관련하여 본 연구에서 금은화의 항산화 능력 을 알아보기 위해 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실 험을 실시하여 BHA와 비교하였다. 그 결과 LE의 항산 화 효율은 농도-의존적으로 증가하는 경향을 보였으 며, 특히 BHA와의 항산화 효능 비교에서 금은화 3 ㎎/

㎖이하 농도에서 BHA보다 항산화효능이 우수한 것으 로 나타났다. 이러한 금은화의 항산화효능은 장내 산 화스트레스에 의한 조직손상 예방에 효과가 있을 것으 로 생각된다.

또한 금은화의 COX-2 발현 억제 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현 양상의 변화를 측정한 결과 CON 군에 비해 LE 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되 었다. 이를 통해 금은화가 COX-2 발현 억제를 통한 항 염증 효과가 있음을 알 수 있다.

궤양성대장염에 활성이 있는 물질의 동물모델 평가 방법으로는 마우스, 흰쥐 및 햄스터에서 dextran sulfate sodium (DSS)로 유발시킨 궤양성 대장염 동물모델이

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주로 이용된다. Polyanionic compound인 DSS는 배속 대 식세포에 탐식되어 장막 (intestinal flora)의 구성 변화 를 일으켜 점막내로 luminal antigen 유입을 자극하고 장내 염증반응을 유도한다29). 유발 초기에는 혈변, 체 중감소, 대장의 축소 및 점막 궤양 등이 생기며, 조직학 적으로 소장 및 대장 상피세포에 손상을 유발해 상피 층의 장샘이 염증 없이 떨어지는 것이 특징이다. 급성 기에는 면역 매개반응이 일어나지 않다가 만성으로 발 전할 경우에는 점막 내에 여러 면역물질의 양이 증가 해서 장관의 염증을 유발하는 것으로 보인다. 이러한 양상은 사람의 궤양성 대장염과 흡사한 부분이 많고, 무엇보다도 현재까지는 모델의 유발율이 높고 편리하 여 널리 이용되고 있다30,31). 마우스에 DSS을 투여할 경우 2.5% 이하를 투여하면 그 병적 특징이 만성적으 로 나타나는 반면 5%의 고농도로 투여하면 급성 대장 염을 일으키는 모델을 만들 수 있어서 UC의 병리 및 면역학적 특징을 연구하는 좋은 모델로 알려져 있다32).

본 연구에서는 실험적 UC 유발을 위해 5% DSS를 사용하였으며, 내림주름창자 길이의 변화를 통해 금은 화의 대장 보호효과를 관찰하였다. 그 결과 CE군은 CON군에 비해 대장 길이가 33% 짧았으며, LT군은 CE 군에 비해 대장 길이가 20% 길었다. 이를 통해 CE군에 서 대장염이 잘 유발되었고, LT군의 내림주름창자 길 이 증가로 금은화의 대장 보호효과를 확인하였다.

소화기 점막상피는 다양한 자극에 대해 방어 장벽 으로 작용하는데, DSS 처리는 폐쇄이음 단백질의 하나 인 zonula occludin (ZO)-1 분포를 감소시킨다. 이는 점 액상피세포사이에 있는 이음 복합체의 가장 꼭대기 부 분에 존재하는 폐쇄띠 (zonula occludens)의 손상에 의한 것이다. 폐쇄띠의 손상에 따른 intestinal permeability의 증가는 장내 염증반응을 유도하여 UC을 일으키는 것 으로 알려져 있다33). 또한 DSS로 유도된 마우스 결장은 표피 주위에 궤양 형성, 조직벽의 심각한 부종, 점액 조직의 비대, 호산구를 비롯한 과립백혈구의 침윤이 과도하게 나타나는 병리학적 특징을 가지는 것으로 알 려져 있다34).

본 연구에서도 창자 점막의 일반적인 형태 변화를 확 인한 결과 CE군의 점막 표면상피의 많은 부분에서 출혈 성 침식 (hemorrhagic erosion)과 염증관여세포의 침윤 (infiltration)이 점막 고유층에서 관찰되었다. 하지만 LT 군에서는 CE군에 비해서 출혈성 침식이 완화된 것으로 나타났으며, 점막 고유층에서도 염증관여세포의 침식 감소가 확인되었다. 이를 통해 금은화가 폐쇄띠 손상을

완화하여 장내 투과성을 감소시키고 출혈성 침식 및 염 증관여세포의 침윤을 완화시키는 것으로 판단된다.

HSP 70은 72,000 mol의 질량을 가지고 있으며 HSP72, 73, glucose regulated protein (GRP) 75, 78 등이 이 단백질 군에 속한다. 대부분의 생물체에서 발견되는 스트레스 저항 단백질로써, 허혈, 열, 저혈당, 바이러스 감염, 경련, 중금속 오염 등 다양한 형태의 스트레스 상황에서 농도가 증가한다. 세포내 변성된 단백질은 열성단백질 인자를 자극하여 HSP70유전자의 전사를 유도하여 HSP70을 생성하며, HSP70은 세포상해에 저항 이 있는 지역에서 주로 발견되는 것으로 알려져 있다35).

본 연구 결과 DSS 처리로 궤양성 대장염을 유발 후 스트레스에 대한 완충적 물질인 HSP70의 양성반응세 포의 분포는 점막 고유층에 증가하였으며, 양성반응세 포의 핵과 주변세포질에서 강하게 양성반응을 보였다.

이러한 양성반응세포의 분포 증가는 CON군에 비해 CE군에서 283%증가하였고, 이에 반해 LT군에서는 CE 군에 비해 57% 감소한 사실을 확인하였다. 이는 금은 화가 궤양성 대장염으로 인한 점막 손상 스트레스를 상당 부분 완화한다는 의미로 보여진다.

UC에서는 NF-kB 활성에 의한 iNOS와 COX-2생성 증가로 심각한 염증상황을 유발한다. COX-2는 유도성 동종효소 (inducible isoform)로 섬유모세포와 대식세포 를 포함한 여러 세포에서 발현되는 COX-2는 성장인자 와 mitogen에 유도되어 prostaglandin 분비 지속을 통한 다양한 만성염증질환, 즉 류마티스성 관절염, Crohn's disease, 궤양성 대장염, Helicobacter pylori 유도 위염 등을 유발하며, 혈관이완과 혈관신생성에도 관여 한다36,37).

이와 관련하여 본 연구에서 염증 효소인 COX-2의 양성반응세포의 분포를 살펴보았는데 CE군에서는 COX-2의 양성반응세포의 분포가 증가하는 반면 LT군 에서는 감소하였다. 특히 조직 분포에서 COX-2 양성 반응세포는 점막상층부에 분포하였고, 핵막주변 세포 질에서 강한 양성반응을 보였다. COX-2 양성반응 영 상분석 결과에서도 CE군은 CON군에 비해 641% 증가 하였고, LT군은 CE군에 비해 54% 감소하였다. 이러한 결과로 금은화가 항염증 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

본 연구는 RAW 264.7 macrophages와 DSS 동물모델 을 사용하여 얻은 결과로써, 실제 인간의 궤양성 대장 염에 적용하기에는 한계가 있다. 아울러 향후 금은화 에 함유된 항염증 성분의 분리 동정 및 금은화의 항염

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증성과 관련된 기전에 관한 후속 연구가 필요할 것으 로 생각된다.

이상의 결과로 볼 때, 금은화는 항산화 작용, 항염증 작용 및 창자점막 보호작용으로 인하여 궤양성 대장염 치료제의 가능성을 충분히 가지며, 본 연구를 바탕으 로 궤양성 장질환에 충분히 응용할 수 있을 것으로 판단된다.

Ⅴ. Conclusion

금은화의 궤양성 대장염에 대한 치료 효과를 조사 하기 위해 본 연구는 금은화 물추출물의 항산화 효과, 항염증 효과, DSS 처리를 통한 궤양성 대장염 유발 생 쥐의 주름창자 길이 변화, 창자점막 손상, COX-2의 면 역조직학적 변화를 관찰한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 금은화 물추출물의 항산화 효율은 농도 의존적으 로 증가하였다.

2. RAW 264.7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현은 금은화 물추출물 처리 후 농도-의존적으로 감소하였다.

3. 금은화 물추출물이 투여된 생쥐에서 주름창자의 길이는 DSS 처리군 보다 증가하였다.

4. 금은화 물추출물이 투여된 생쥐에서 창자 점막손 상 스트레스 완충 물질인 HSP70의 양성반응세포 의 분포가 감소하였다.

5. 금은화 물추출물이 투여된 생쥐에서 염증 효소인 COX-2의 양성반응세포의 분포가 감소하였다.

Acknowledgement

본 연구는 2015년도 부산대학교병원 임상연구비 지 원으로 이루어졌음

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수치

Table 1. The Primer of COX-2 and β-actin mRNA
Fig. 1. The Anti-oxidant effects of  Lonicera japonica  water extracts.
Fig. 2.  In Vitro  test for anti-inflammation effects of LE.
Fig. 4. The mitigative effects of DSS induced ulcerative colitis in mouse by LE.
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참조

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