줄기세포를 이용한 특이적 세포 분화에 대한 연구 동향

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줄기세포를 이용한 특이적 세포 분화에 대한 연구 동향

이 철

울산과학기술원 생명과학연구부 E-mail: cheollee@unist.ac.kr 요약문 인체를 구성하는 모든 종류의 세포를 생산할 수 있는 잠재력을 지닌 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 재생의학 분야에서 없어서는 안될 중요한 수단으로 여겨진다. 따라서 효과적으로 만능줄기세포의 분화를 유도하여 원하는 종류의 세포를 얻는 과정에 대한 이해와 기술의 확립은 매우 중요하다. 이를 위해 세포 외부에서 인위적인 자극을 주어 줄기세포의 분화를 유도하거나, 줄기세포에 내재하는 자가형성 능력이 극대화될 수 있는 환경을 만들어주는 방식이 이용되고 있다. 줄기세포를 보다 완벽하게 특이적 세포(specific cell type)로 분화시키고 재생의학 분야에서 활용하기 위해서는 아직 해결해야 할 과제들이 많이 남아있지만, 최근에 비약적인 발전을 이룬 연구 추세와 더불어 다양한 첨단 과학기술의 접목으로 앞으로도 줄기세포 분화 연구 분야는 더욱 발전하리라 기대한다.

Key Words: pluripotent stem cells, directed differentiation, in vivo reprogramming, genome editing, organoids

목 차

1. 서론 2. 본론 2. 1 줄기세포의 종류 2.2 유도분화 (Directed differentiation) 2.3 저분자 화합물 (Small molecules) 2.4 In vivo reprogramming 2.5 유전체 편집 (Genome editing) 2.6 Organoids 3. 결론 4. 참고문헌 BRIC View 동향리포트

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1. 서론

재생의학(regenerative medicine)의 개념에 대해 미국립보건원(National Institutes of Health, NIH) 웹사이트에서는 그리스 신화에 나오는 프로메테우스를 예로 들어 설명하고 있다. 즉 신의 노여움을 사 독수리에게 간을 쪼이는 벌을 받지만 매일 간이 재생되어 생명을 유지할 수 있었다는 이야기다. 이러한 신화 속의 이야기가 현실에서도 이루어 질 수 있도록 하기 위해 많은 과학계 및 의료계 종사자들이 노력을 기울이고 있다. 사람의 몸은 200여 종 이상의 서로 다른 조직 세포들로 이루어져 있으며, 구성 세포의 수는 모두 60조에서 100조 개 정도라고 한다. 이러한 세포들이 제 기능을 나타내지 못하거나 소실된 경우 이를 대체하거나 재생시켜서 본래의 기능을 나타낼 수 있도록 복원시키는 의학 분야가 재생의학이다. 그리고 재생의학의 핵심에는 줄기세포를 이용한 생물 의학적 치료가 있다. 줄기세포란 미분화 상태의 세포로 자기와 같은 특성을 갖는 세포로 자가증식(self-renewal)이 가능하고, 두 종류의 이상의 서로 다른 세포 종류로 분화(differentiation)할 수 있는 특성을 갖는다. 1990년대 후반 인간배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)의 확립 이후 본격적으로 시작된 줄기세포 분야 연구는 2000년대 중반 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 제작이라는 획기적인 업적 이래 비약적인 발전을 이루고 있다. 또한 최근 인간체세포복제배아줄기세포(human somatic-cell nuclear transfer ESCs, hSCNT-ESCs) 수립에 성공함으로써 줄기세포 분야 연구는 한층 더 활발해지고 있다. 줄기세포 분야 연구 유형을 살펴보면 종류가 다른 각 만능줄기세포의 분자적, 기능적 특성 분석 및 각각의 비교 연구, 역분화 유도 프로토콜 및 기전 연구, 특이적 조직 세포로의 분화 프로토콜 개발 및 최적화 연구, 발생학적 기전 분석 연구, 환자유래 질병특이적 유도만능줄기세포주 수립 및 질병모델 구축, 후성유전학 및 분화전능성 유지 기전 연구 등이 있다[1]. 이와 같이 다양한 줄기세포 연구 분야 중 이 보고서에서는 만능줄기세포(배아줄기세포와 유도만능줄기세포)를 특이적 조직 세포로 분화 유도하는 방법의 종류와 특징 그리고 최적화와 관련된 연구를 중심으로 최근 동향을 살펴보고자 한다.

2. 본론

2.1 줄기세포의 종류 줄기세포는 분화능력(potency), 기원(origin), 제작방법 등에 따라 몇 가지로 구분된다. 줄기세포의 분화능력 중 분화전능성(totipotency)은 개체를 이루는 모든 종류의 세포 즉 배아(embryonic) 또는 태반과 같은 배외(extraembryonic)세포로 분화할 수 있으며 궁극적으로는 개체로까지 발생이 가능하다. 분화전능성은 정자와 난자가 합쳐진 수정란부터 상실배(morula)의 세포까지 유지된다. 분화만능성(pluripotency)은 삼배엽 즉 외배엽, 중배엽, 내배엽 유래의 세포나 조직으로 분화가 가능하지만 배외세포로 분화할 수 없으며 따라서 개체로 발생할 수 없다.

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분화다능성(multipotency)은 여러 종류의 세포로 분화할 수 있으나 조직 또는 기능상 관련된 제한적인 세포 종류로만 분화가 가능하다.

배아줄기세포는 포배(blastocyst)의 안쪽에 있는 속세포덩이(inner cell mass)로부터 유래된 완벽에 가까운 미분화 상태의 세포들로 무한 증식이 가능하고 분화만능성을 갖고 있어, 현재 여러 종류의 만능줄기세포들의 표준으로 여겨진다[2]. 배아줄기세포는 수정란을 포배까지 배양접시에서 발생시킨 후 얻기 때문에 인간배아줄기세포의 경우 배아를 파괴해야 한다는 윤리적인 문제가 있다. 이에 대한 대안으로 제시된 체세포복제배아줄기세포는 체세포핵치환 즉, 핵을 제거한 난자에 체세포 핵을 주입하여 얻어지는 수정란을 포배까지 발생시켜 얻는다. 2013년 인간체세포복제배아줄기세포를 얻는데 성공했으나[3] 여전히 인간 난자를 이용한다는 점에서 윤리적인 제약이 있다. 유도만능줄기세포는 이미 분화가 끝난 세포에 배아줄기세포 특성을 유지하는 데 필요한 유전자들을 도입하거나 내부유전자 발현을 증진시켜 배아줄기세포와 유사한 세포로 되돌리는 것으로(reprogramming 또는 dedifferentiation) 역분화줄기세포라고 불리기도 한다[4]. 인간유도만능줄기세포의 경우[5] 연구 윤리적인 제한사항은 없으나, 외부 유전자 도입으로 인한 유전체 불안정성 및 종양 형성, 불완전한 역분화로 인해 원래 세포의 기억이 남아있는 등 질적인 부분에서 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 다양한 방법들이 시도되었고 이에 따라 개선된 세포주(cell lines)들이 확립되고 있다 [6-10].

성체줄기세포(adult stem cells)은 신체 각 조직의 분화된 세포들 사이에 존재하는 줄기세포로 분화다능성을 갖고 해당 조직을 이루는 세포 종류로만 분화한다. 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells)나 신경줄기세포(neural stem cells)등이 대표적이다.

2.2 유도분화 (Directed differentiation) 발생생물학 분야에서 오랫동안 축적된 지식을 세포배양상에서 재현하여 줄기세포를 원하는 종류의 세포로 분화시키는 과정이다. 즉 발생 시기별로 줄기세포의 분화를 조절하는 분자 요소들에 대한 지식을 바탕으로 다양한 첨단 과학기술을 접목하여 보다 효율적인 프로토콜 개발이 주요 과제이다[11]. 미분화 상태의 줄기세포가 분화할수록 줄기세포의 특성을 잃고 분화된 세포 고유의 특성을 점차 갖추어 가게 되는데, 이 과정에서 다양한 신호물질들 예를 들면 형태형성인자(morphogen)와 성장인자(growth factor)들이 발생 단계에 따라 순차적으로 그리고 복합적으로 작용하게 된다[12]. 이러한 인자들을 배양중인 줄기세포 배양액에 첨가함으로써 분화를 유도하게 된다.

만능줄기세포 분화의 첫 번째 갈림길은 삼배엽 중 하나의 배엽으로 결정되는 것이다. 만능줄기세포를 혈청이나 기타 유발원(inducer)이 없이 배양하면 신경외배엽(neural ectoderm)으로 발생하는데, 이 현상은 만능줄기세포에 내정(default)된 분화 프로그램으로 생각된다[13]. 기존의 embryoid-body 형성이나 공급자세포(feeder cells)와의 공생배양(co-culture)법은 시간이 오래 걸리고 정확한 세포배양 조건을 알기 어렵기 때문에 dual-SMAD inhibition과 같은 유도분화 방식이 널리 이용되고 있다. 이 방법은 내배엽 분화에 필수적인 TGF-β/Activin/Nodal 경로와 중배엽 분화를

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조절하는 BMP 경로의 두 신호전달경로를 저해함으로써 만능줄기세포를 신경외배엽으로 분화시킨다[14]. 이렇게 생겨난 신경상피선조세포(neuroepithelial progenitors)는 위치정보(positional information 또는 regionalization cues)에 따라 여러 가지 종류의 신경세포로 분화가 유도된다. Sonic Hedge-Hog (SHH), Wnt, retinoic acid (RA), FGF 등을 다양한 농도로 복합적 그리고 순차적으로 세포 배양액에 처리하면 여러 신경세포 종류 즉 대뇌겉질의 glutamate성 신경세포, GABA성 신경세포, 중뇌 도파민성 신경세포 또는 척수운동신경세포 등으로 각각 분화된다[15-18].

중배엽으로의 분화에 중요하게 작용하는 신호 물질로는 Wnt/beta-catenin, TGF-β family, BMPs 등이 알려져 있다. 이들 신호전달경로를 활성화시켜 만능줄기세포를 중배엽으로 분화시킨 후 이들 신호물질의 기능을 저해하여(biphasic-modulation) cardiac mesoderm으로 분화 유도하거나[19], Wnt, Activin/Nodal, BMP와 같은 인자들을 복합적으로 처리하여 조혈중배엽(hematopoietic mesoderm)으로 분화시킨다[20].

내배엽의 경우 Activin/Nodal과 같은 인자들을 이용해 만능줄기세포에서 진정내배엽(definitive endoderm)으로 일차적인 분화를 유도한 후[21], 이 내배엽성 세포에 FGF10, SHH inhibitor, RA와 같은 다양한 인자들을 복합적 그리고 순차적으로 처리하여 이자베타세포와 유사한 세포(pancreatic beta-like cells)로 분화를 유도한다[22, 23]. 한편 진정내배엽에 Wnt, BMP, FGF 등의 활성제와 억제제를 순차적으로 처리하면 폐세포로 분화시킬 수 있다[24]. 이 단락에서는 몇 가지 세포로의 분화유도를 예로 들었지만 이 외에도 더 다양한 세포로 분화시키는 기술들이 계속 연구되고 있고, 좀 더 효율적으로, 더 짧은 시간 안에, 생체 내 세포와 더 유사한 세포로 분화시킬 수 있는 개선된 방법론들이 지속적으로 발표되고 있다. 2.3 저분자 화합물 (Small molecules) 기존에 알려진 형태형성인자나 성장인자 만으로 만능줄기세포를 다양한 종류의 세포로 분화를 유도하기에는 한계가 있어, 이를 극복하기 위한 수단으로 저분자 화합물을 이용하는 사례가 최근에 많이 보고되고 있다. 저분자 화합물은 세포의 신호전달경로에 작용하여 분열, 분화, 사멸 등의 과정을 조절하는데 Wnt, SHH, TGF-β, GSK3와 같은 신호전달경로의 억제제 역할을 하는 화합물들이 잘 알려져 있다[25]. 다양한 저분자 화합물을 복합적으로 이용하는 경우 기존의 유도분화 방법에 비해 유도 기간, 효율, 특이성, 세포배양 과정의 제어, 비용 등의 측면에서 장점이 있다[26]. 항암제 개발 등의 목적으로 이미 구축된 저분자 화합물 library에서 줄기세포의 분화를 조절할 수 있는 기능이 있는 화합물을 선별(screening)하는데, 최근에는 high throughput 방식을 통한 보다 체계적(systematically)이고 복합적(combinatorial)인 접근법이 제시되고 있다[27]. 최근 연구를 보면 성장인자를 사용하지 않고 저분자 화합물을 이용해 만능줄기세포를 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cells)로 분화시키거나[28], 기존의 프로토콜에 다양한 종류의 저분자 화합물을 복합적으로 추가하여 이자베타세포로 분화시킨다[29]. 특히 후자의 경우 마커 발현뿐만 아니라 포도당 응답성(glucose responsiveness), 인슐린 분비 과정 등 기능적인 면에서 기존의 줄기세포유래베타세포보다 우수하고 또한 대량으로 얻을 수 있다고 한다.

줄기세포를 이용한 특이적 세포 분화에 대한 연구 동향 이철 Page 5 / 9 2.4 In vivo reprogramming 재생의학의 한 분야인 세포치료(cell therapy)는 손상 또는 손실된 세포를 교체하는 것이 그 기본 개념이다. 그러나 다양한 시도와 가능성에도 불구하고 골수이식을 제외하고는 아직까지 일반화된 치료 방법으로 확립되지 못한 실정이다. In vivo reprogramming은 체내에 남아있는 세포의 분열을 자극하거나 세포의 운명(cell fate)을 전환하여 조직 자체의 재생 능력을 촉진하는 방식으로 직접교차분화(transdifferentiation)로도 불린다. 이 방법의 가장 큰 장점은 세포를 이식하는 과정에서의 여러 가지 어려움 예를 들면 이식수술이나 면역거부반응 등을 피할 수 있다는 것이다. 지금까지 실험적으로 시도된 일반적인 기법은 원하는 종류의 세포로 분화 또는 직접교차분화 시킬 수 있는 전사인자 유전자를 타깃 세포에 형질도입(transduction)하는 것이다.

심근섬유화(myocardial fibrosis)의 원인이 되는 섬유모세포(fibroblasts)를 감염시키는 재조합 바이러스 벡터에 심근세포 분화 전사인자 유전자(Gata4, Mef2c, Tbx5)를 포장한 뒤 심장근육 손상을 유발시킨 생쥐의 심장에 주입하여 섬유모세포를 유도심근세포(induced cardiomyocytes)로 전환하였다. 유도심근세포는 실제 심근세포와 유사한 특성을 보였고 심장근육 손상을 유도한 생쥐의 증상 호전에 도움을 주었다[30, 31]. 같은 방식으로 간세포 분화 전사인자 유전자(FOXA3, GATA4, HNF1A, HNF4A)를 이용해 근섬유모세포(myofibroblasts)를 유도간세포(induced hepatocytes)로 전환함으로써 간손상을 막을 수 있는 가능성을 보여주었다[32]. 비장의 알파세포나 외분비세포들을 베타세포로 직접교차분화 시키는 연구와 뇌의 별아교세포(astrocytes)를 신경세포로 전환시킨 보고도 있다[33, 34]. 그러나 in vivo reprogramming의 가장 큰 단점은 교차분화 방법으로 바이러스 벡터를 이용하는 경우가 많은데, 그에 따르는 부작용에 대한 염려가 크다는 것이다. 따라서 약물선별(drug screening)을 통해 얻어진 저분자 화합물을 이용하는 것이 대안으로 제시되었다. 한 예로 희소돌기아교전구세포(oligodendrocyte precursor cells)를 저분자 화합물로 자극해 말이집재생(remyelination)을 촉진하는 연구가 진행된 바 있다[35]. 그 외에 in vivo 연구에 필연적으로 동반되는 어려움들 즉 임상 연구에 대한 제약 (아직까지 in vivo reprogramming은 실험 동물 모델에서만 가능), 교차분화 된 세포에 대한 특성 분석의 한계, 교차분화 된 세포와 주변 환경(host environment)과의 상호작용에 대한 이해 등은 앞으로 해결해야 할 과제이다[33].

2.5 유전체 편집 (Genome editing)

Zinc Finger Protein (ZFP)과 Transcription Activator-like Effector (TALE)의 유용함은 실질적으로 어떤 DNA 염기 서열이던 인식 가능한 결합 도메인을 제작할 수 있다는 점이다. 이러한 DNA-결합 도메인에 핵산분해효소, 전사활성자, 전사억제자, 재DNA-결합효소, 위치이동효소와 같은 여러 가지 효과기(또는 작동체, effector)와 연결하여 맞춤형 유전체 편집이 가능하다[36]. 또한 최근에는 ZFP나 TALE 보다 더 쉽고 간편한 방법으로 유전체 편집이 가능한 CRISPR-Cas9 시스템이 각광받고 있다. 이러한 유전체 편집 기술은 그 쓰임새가 매우 다양한데, 줄기세포의 분화를 유도하는 데 이용될 수 있다[37]. 즉 분화에 중요한 전사인자 유전자의 발현을 촉진하거나, 분화전능성을 유지하는 데

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필수적인 전사인자 유전자의 발현을 억제함으로써 분화를 유도하는 것인데, 실제로 인간배아줄기세포를 이용한 개념증명(proof of concept) 연구가 보고된 바 있다[38].

2.6 Organoids

Organoids는 일차조직(primary tissue) 또는 만능줄기세포로부터 유래한 in vitro 3차원 세포 클러스터로 자가증식과 자가조직화(self organization)가 가능하고, 유래된 원래의 조직과 유사한 기능을 갖는다[39]. 만능줄기세포를 배엽 상태로 1차 분화 시킨 후, 부착세포배양 또는 부유세포배양하지 않고 Matrigel과 같은 3차원 지지 골격(scaffold)과 분열 및 분화에 필요한 생화학적 단서(cues)를 제공하면 조직 특이적 organoids를 스스로 만든다. 눈술잔(optic cup), 창자(intestine), 간, 콩팥, 뇌 등의 organoids가 보고된 바 있는데[40-44] 특히 다른 기관에 비해 그 해부학적, 조직학적 구조가 복잡하고 여러 종류의 세포로 구성된 뇌도 organoids로 분화가 가능하다는 것은 매우 흥미로운 일이다. Organoids는 새로운 모델시스템으로 매우 유용하게 쓰일 수 있는데, 기존 동물모델의 경우 인간의 in vivo 조건을 본 뜬 것이지만 종간 차이가 있고, 인간 세포 배양 모델의 경우 세포-세포 사이 또는 세포-세포외기질 사이의 관계를 배제한 경우이다. 이러한 점에서 organoids는 기존 모델시스템의 한계를 극복할 수 있는 장점이 있다[45]. 최근 지카 바이러스 감염과 소두증 태아와의 상관관계가 밝혀졌다[46]. 이에 대한 병리 기전을 인간 뇌 organoids를 이용해 밝힌 연구에 따르면 지카 바이러스는 신경전구세포를 감염시킨 후 Toll-like receptor 3을 통해 세포사멸을 일으키고 신경세포 생성을 억제하여 소두증을 일으키는 것으로 보인다[47]. Organoids 형성에 Matrigel과 같은 지지 골격이 필수적이라는 점은 줄기세포의 배양 시 세포 외부 환경의 물리화학적인 특성 또한 중요한 요소라는 점을 시사한다. 따라서 graphene과 같은 신소재가 세포 배양의 지지 골격 역할을 할 때 줄기세포의 분화에 영향을 주는 새로운 요인으로서의 가능성이 탐구되고 있다[48].

3. 결론

지난 10년간 줄기세포 연구 분야에서 대단한 성과가 있었고, 특히 앞에서 살펴본 바와 같이 줄기세포의 분화와 관련해서 다양한 기술적 시도를 통해 많은 진전이 있었다. 이러한 발전 결과는 체내 발생 중 분화 과정에서 일어나는 여러 현상들에 대해 분자 수준에서의 이해를 도울 뿐만 아니라 재생의학 관점에서 새로운 가능성을 제시해 준다. 그러나 많은 줄기세포 분화 연구의 목표가 임상에서 활용 가능한 세포나 조직의 생산이라는 점에서, 줄기세포 분화 연구 분야에도 앞으로 해결해야 할 과제들이 많이 남아있다. 먼저 유도분화 기간과 관련된 사안이다. 현재 널리 쓰이는 줄기세포의 유도분화 배양 방식으로는 분화된 세포의 기능을 평가하고 질병모델을 구축하기에 시간이 너무 오래 걸린다. 특히 아교세포(glia cells)와 같이 뇌 발생과정 중 나중에 분화되는 세포의 경우 시간이 더 오래 걸린다. 따라서 원하는 종류의 세포로 분화되는데 소요되는 시간을 더욱 단축할 수 있는 프로토콜이

줄기세포를 이용한 특이적 세포 분화에 대한 연구 동향 이철 Page 7 / 9 개발되어야 할 것이다[12]. 다음으로 고려되어야 할 사안은 분화된 세포의 품질(quality)과 관련된 문제이다. 현재의 방식으로 줄기세포를 유도분화하는 경우 필연적으로 여러 종류의 세포, 즉 운명이나 분화된 정도가 서로 다른 세포들이 혼합된 형태로 배양된다. 특히 미분화된 세포가 체내에 이식될 경우 종양 형성의 위험이 있으므로 따라서 원하는 종류의 세포만 선별적으로 분리해 낼 수 있는 기술이 강구되어야 할 것이다[49]. 또한 줄기세포 유래 분화된 세포가 정말 원하는 세포 종류인지(identity) 정확하게 확인할 수 있는 기분(criteria)의 확립이 필요하다. 현재 일반적으로 시행되는 기준은 예를 들어, 세포특이적 마커의 발현을 확인하고 이자베타세포의 포도당 응답성과 같은 세포 고유의 기능을 몇 가지 평가하여 판단하고 있다. 그러나 아직까지 많은 논문에서 줄기세포유래 분화세포를 ~유사세포(-like cells)라고 명명하는 것으로 보아 완벽하게 원하는 종류의 세포로 분화되었는지 확신하지 못하는 경우가 많음을 짐작할 수 있다. 약 20여 년 전에 인간배아줄기세포주가 처음으로 확립되었고, 불과 10여 년 전에 인간유도만능줄기세포가 처음으로 만들어졌다. 최근 진행되고 있는 활발한 줄기세포 분야 연구 추세로 미루어 볼 때 앞으로 10년 후에는 과연 어떤 연구 성과들이 이루어져 있을지 자못 기대된다.

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