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1. 개요

□ 연구목적

우리 주변에 카페인 음료를 찾기란 너무나도 쉬운 일이다. 많 은 사람들이 카페인 음료를 마시면 잠도 잘 오지 않아 일하기가 한층 더 수월해지고 기분이 좋아진다는 이유로 한번 마시면 지속적으로 마시게 된다.

하지만 우리는 아무런 생각 없이 마시는 이 카페인 음료가 과연 전혀 문제가 없을까? 본 연구는 그런 의문점에서부터 시작되었 다.

미국에서 다량의 각성 음료 섭취를 통해 3년간(2009~2012) 5명 이 죽고 2005~2009년동안 각성 음료 섭취와 연관된 응급실 인원 건수 는 그 전보다 10배 증가했다고 한다. 이에 따라 FDA에 각성 음료의 안정성 조사를 촉구하는 민원이 들어오고 있다고 한다. 이런 실례를 볼 때 caffeine이 무작정 문제가 없다 판단할 수만은 없다. 그러면 신체의 어떤 부분과 caffeine의 상관관계를 알아보아야 할까?

우리 몸은 다양한 요소에 의해서 조절, 반응한다. 그런 반응을 유도하는 요소 중 하나에는 호르몬 또한 포함되어 있다. 그렇다면, caffeine에 의해 심각한 사태가 발생한다면, 호르몬 또한 큰 영향을 받았을 것으로 예상된다. 불안기작 관련 호르몬 중 가장 대표적인 예시는 corticosterone이다. 하지만 모든 종류의 corticosterone을 측 정하기에는 어려움이 따르기에 그 수용체인 Mineraloco- rticoid Receptor (MR) 과 Glucocorticoid Receptor(GR)의 발현을 caffeine이 불안에 영향을 끼친다는 점(Dine

et al

, 2013)과 접목시켜 caffeine이 스트레스 관련 호르몬에 어떤 기작을 하는지를 탐구하고 그 문제점에 대해서 지적하려 한다.

□ 연구범위

Open-field test는 빛의 밝기가 30 lux인 환경에서 실행되

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었다. mouse의 outer zone 잔류 시간과 travel distance, velocity 등이 측정하였다. EPM test는 빛의 밝기는 100 lux, 측정 요소에 는 mouse가 open arms에서 머무르는 시간과 그 영역을 들어가 는 횟수가 있다.

2. 연구 수행 내용

□ 이론적 배경 및 선행 연구

○ Caffeine

Caffeine은 커피, 차, 청량음료, 초콜릿, 콜라너트, 특정 약 품 등에서 발견되는 쓴 물질이다. Caffeine은 몸에서 신진대사, 중추신경계의 자극을 포함한 여러 영향을 미친다. 이는 사람들을 깨어있는 상태로 만들고 에너지를 북돋는다. 적정 양의 caffeine 은 해롭지 않으나, 지나친 caffeine은 불안을 야기하고, 잠을 잘 자지 못하게 한다. 뿐만 아니라 복용을 정지하면 금단증세를 가 질 수 있다. Bhattacharya

et al

.은 카페인이 불안을 유발하며 지 속적으로 사용할 경우 그에 따라 내성이 생기며, 만성적인 카페 인 함유 음료를 마시는 사람들에게서 금단 증세를 나타낸다는 임상의 증거를 찾아냈다고 주장한다.(Bhattacharya

et al,

1997)

○ Mineralocorticoid Receptor (MR) 과 Glucocorticoid Receptor(GR) 많은 생장적, 생리적, 행동적 과정이 스테로이드 호르몬에 의해서 조절된다. 이 호르몬들은 유전자의 전사를 유도 하는 리 간드 결합 세포 내 수용체에 작용한다. 이 수용체의 구조는 크게 N-terminal domain, central region, carboxy-terminal domain 으 로 나누어진다.

N-terminal domain은 단백질에서 N-부분에서 시작되는 부 분으로 유전자 전사 조절에 관여한다. Central region은 수용체

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단백질의 중간부분으로 receptor-DNA 상호작용에 관여하며 carboxy-terminal domain은 수용체와 호르몬 간의 리간드 결합 영역으로 그 상호작용과 전사를 조절한다.

스테로이드계 호르몬 중 Corticosteroid hormones의 경우 Mineralocorticoid Receptor(MR, type I receptor)과 Glucocorticoid Receptor(GR, type II receptor), 이 두 가지 수용체에 의해 발현 되게 된다.

MR과 GR은 매우 유사한 구조를 가지고 있는 수용체로 각 각에 결합하는 호르몬이 매우 유사하다.

수용체-호르몬간 상호작용에 관여하는 Carboxy-terminal domain은 57%의 아미노산이 서로 일치하며 비슷한 그룹의 당질 코르티코이드와 결합한다. 하지만 이 때 MR이 GR에 비해서 친 화도가 10배정도 커서 잘 결합하는 반면에 결합하는 용량은 GR 이 MR에 비해 더 크다.

Receptor-DNA 상호작용에 관여하는 Central terminal domain은 MR과 GR에서 아미노산 배열이 94% 일치한다. 이 때 두 수용체가 매우 유사한 구조를 가지기 때문에 동일한 GRE와 결합한다. Central terminal에서 MR은 알도스테론과 콜티코스테 론과 비슷한 정도의 친화도를 가지지만, GR의 경우는 매우 큰 친화도를 나타낸다.

N-terminal region에서는 서로 간 아미노산 일치율이 15%

정도 밖에 되지 않으며 가장 명확한 차이가 나타난다. 이 차이에 관한 연구는 현재에도 계속되고 있다.

GR은 뇌 전체에 걸쳐서 발현되는 반면에 MR은 뇌 내에서 제한적인 구역에서 발현되게 된다. 하지만 MR은 부신 피질 전체 에 걸쳐서 높은 빈도로 발현된다.

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그림 2. Mouse forebrain에서 S labeled GR과 MR이 특정 cRNA와 결합한 결과.

MR은 설치류에서 preforntal cortex,the medial and central amygdala, lateral septum, 여러 thalamic nuclei, 몇몇 hypothalamic nuclei 등에서 발현되며 또한 CA1, CA2, CA3, 해마 의 dentate gyrus에서 가장 높은 빈도로 발현된다.

MR과 GR의 주로 MR의 활성화에 의해 발현 되는데, 당질 코르티코이드에 의해서 조절된다. MR은 알도스테론과 결합하여 나트륨 조절기능을 발현하기도 한다.

MR은 음성 피드백을 통해서 불안에 작용한다.

그림 3 불안에 따른 GR과 MR의 작용.

음성피드백을 통해서 불안에 작용한다.

자극이 없을 때 corticosteroid의 혈장 내 농도는 주기적으 로 변하게 된다. 순환 과정에서 낮은 농도일 때는 친화도가 높은

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MR과 우선적으로 결합하고 높은 농도일 때는 MR과 GR 두 가지 에 모두 결합한다.

기존 연구에서는 인체에서 MR-antagonist의 일종인 canrenoate를 처리할 경우 MR의 활성화는 그 corticosteroid의 순 환 주기에 관계하지 않고 HPA axis를 활성화 시키며, HPA axis의 활성화는 불안을 유발시킨다.

또한 rat에서 anti-mineralocorticoid와 anti-glucocorticoid를 각각 2.5mg/100g, 1.0mg/ 100g을 복강투여를 통해서 injection 한 결과 뇌내 GR의 anti-glucocorticoid 는 혈장 내 corticosterone 농 도에 영향을 끼치지 않았으며 glucocorticoid의 음성 피드백에 간 섭하며, MR에서 anti-mineralocorticoid 혈장 내 corticosterone의 농도를 높이며 스트레스에 따른 부신 피질에서의 corticosterone 분비를 증가시킨다. 이를 통해서 MR과 GR은 stress에 음성 피드 백을 한다는 결론을 내렸다.

□ 연구 방법

○ 실험동물 및 약물 처치

처음에는 수컷 SD rats(Orient bio)를 실험동물로 사용하여 각 군별로 2마리씩, 대조군을 포함해 총 네 군으로 나눠서 caffeine을 각 군별로 아래와 같은 양만큼 1회 injection하였다.

군 Control group

Experimen tal group1

Experimen tal group2

Experimen tal group3 Caffeine 투여

양 (mg/kg) 0 25 50 100

하지만 이 경우 결과가 유의성이 적게 나왔다. 이를 극복하기 위해 한 군당 개체수를 2마리에서 10마리로 늘리고, 많은 개체를 컨트롤할 수 있도록 실험동물을 ICR mouse로 바꿨다. 또한 injection

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과정이 스트레스가 클 것이므로 injection 과정에 대한 스트레스를 알아보고자 vehicle control group을 추가하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.

암컷 ICR mouse(Orient bio)를 실험동물로 사용하여, 각 군 별 10마리로 대조군을 포함해 네 군으로 나눠서 caffeine을 각 군별로 아래와 같은 양만큼 1회 투여한다.

군 Naive control

Vehicle control

Experimen tal group1

Experimen tal group2 Caffeine 투여

양 (mg/kg) 0 0 50 100

○ Behavior test

Caffeine 투여 30분 후 behavior test를 실시한다.

- Open-field test(OFT)(김현택 등, 2006)

OFT는 숨을 수 있는 공간이 없이 개방된 직육면체 모양 의 상자에 실험동물을 넣어서 보행량의 변화와 불안 정도를 알 아볼 수 있다. 본 연구에서는 아크릴 상자(40 cm x 40 cm x 60 cm)의 밑면을 3 x 3으로 나누어 4개의 꼭짓점에 위치한 4개의 영역을 outer zone이라 한다. 그리고 정 가운데에 위치한 1개의 영역을 inner zone이라 한다. 실험실을 30 lux의 빛 세기를 유지 하며 동영상 촬영을 진행하였다. 모든 촬영이 끝난 후 동영상을 Noldus의 Ethovision (ver. 8.0) 소프트웨어를 이용하여 mouse가 outer zone에 머무는 시간, OFT 장치 내에서 mouse가 이동한 거 리, 그리고 mouse의 속력을 분석하였다.

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그림 4. Open-field test(OFT) 실험장치 모습. 내부를 3 x 3으로 나누어 꼭짓점에 위치한 네 영역(파란색)을 outer zone이라 하고 가운데 위치한 영역(초록색)을 inner zone이라 한다. 본 연구에서는 5분간 mouse가 outer zone에 머문 시간과 OFT 내에서의 travel distance, velocity를 측정하였다.

- Elevated plus maze(EPM) test(File

et al

, 2005)

EPM test의 경우 mouse의 caffeine에 대한 반응을 초기화 시키고자 OFT 실행 2~3일 후에 실시하도록 한다. EPM test는 open arms(30 cm x 5 cm x 1cm), closed arms(30 cm x 5 cm x 15 cm), central platform(5 cm x 5 cm)으로 구성되어 있다. EPM 은 바닥에서 50 cm 떨어지게 설치한다. EPM 실험 시 mouse를 central platform에 놓되 머리가 open arms를 향하도록 하여 실 험을 진행하도록 한다. 100 lux 조건 하에 동영상 촬영을 진행하 고, 모든 동영상 촬영이 끝난 후 Noldus의 Ethovision(ver. 8.0)으 로 mouse가 open arms에 머문 시간과 mouse가 open arms에 드 나든 횟수를 분석하도록 한다.

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그림 5. Elevated plus maze(EPM). EPM은 두 개의 open arms와 두 개의 closed arms 그리고 중앙의 central platform으로 구성되 어 있다. 본 연구에서는 5분간 mouse가 open arms에서 머무는 시간과 open arms를 드나든 횟수를 측정하였다.

○ 통계 처리

각 group간의 비교는 Sigmaplot v.12.0 program을 사용하여 one-way ANOVA를 수행하고 유의할 경우 post hoc test로 사후 검정 하여 p <0.05이하일 경우 통계적 유의성을 부여하였다.

○ 혈액 분석 및 GR 및 MR 분석

혈액 분석 및 GR, MR의 분석을 위해 mouse를 sacrifice한 후 심장에서 혈액을 취하고 brain을 얻었다. Mouse의 brain은 각각 PCR 및 Immunohistochemistry(IHC)과정을 거쳐서 분석이 될 것이다. 그리 고 GR이나 MR의 특이적인 부분을 관측하기 위해 primer design하였 다. 혈액 분석은 연세대학교 에비슨연구센터에 가서 진행하였고, IHC 관측을 위해 mouse brain을 마이크로미터 단위로 자르는 것은 연세대 학교 임상의학연구센터에 의뢰하였다. IHC 관측을 위해 1차 항체(GR 또는 MR)와 2차 항체를 사용할 것이다.

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□ 연구 활동 및 과정

○ 월별 연구 추진 실적

당초 계획서에 제출한 연구 활동 초안은 다음과 같았다.

주요 활동 시기 비고

예비 실험 수행 4월~5월

세부 연구 수행 6월

현장연구를 통한 세부 연구 수행 및

중간보고서 제출 7~8월

실험데이터 해석 및 추가 연구 수행 9~11월

최종보고서 제출 12월

위 계획의 경우 구체적인 방향성이나 세부적인 사항이 계획되어 있지 않은 상태였기 때문에 일정은 대체적으로 지켜졌으나 세부적인 사항을 기록해야 할 필요성이 있다.

우리의 연구 진행 내용은 논문검색을 통한 선행연구,

세부사항에 관한 실험 이 두 가지로 나눌 수 있다. 이 때 실험은 불안 기작의 확인을 위한 Open Field test(OFT)와 Elevated Plus Maze(EPM) 이 두 가지가 주체로 진행되었다.

처음에 4~5월 사이에 진행되기로 계획했었던 예비실험 수행은 5/22, 5/29에 수행되었다. OFT의 경우 그 실험 방법이 간단하여 예비실험을 수행하지 않았지만, EPM은 실험장치 및 프로그램 세팅에 있어서 몇 가지 문제가 생겨서 그에 대한 수정을 위해 실험을 수행하게 되었다.

세부연구 수행은 당초 계획했던 6월의 경우 학교 일정과 겹치는 등, 진행이 불가피하게 되어 7월로 미뤄지게 되었다. 세부연구 수행은 7월 1일부터 7월 17일 사이에 진행되었다. 세부연구 내용은 앞에서 언급한 OFT와 EPM 두 가지 실험이 각각 1주일씩

실행되었으며 3일 동안 결과에 대한 분석과 반성이 이루어졌다.

각 실험을 수행하는 1주일 중 앞선 이틀 동안은 논문 검색을 통해 선행연구에 대한 조사를 바탕으로 우리가 설계한 실험 방법의 객관성을 확인하였고, 그에 따라서 caffeine 투여 후 행동실험까지의 시간 및 행동실험 수행 시간과 같은 세부사항을 조정하였다.

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3일째에는 예비실험 및 실험 기구 설치를 실시해서 실험 세부사항을 설정하였고 나머지 이틀 동안은 실험을 수행하고 결과를 분석하였다.

현재 연구는 행동실험과 혈액 분석이 완료 되어있으며 GR 및 MR의 PCR 분석과 IHC 분석을 위한 primer와 brain의 setting이 완료된 상태이다.

○ 연구비 사용 내역

비 목 세 목 산 출 내 역 금 액

직접비

연구장비·재료비 ․동물 및 재료비 2,350,000

연구 활동비

․전문가 자문 수당 200,000원x5회=1,000,000원

․참고도서 구입비 100,000원

․시험․분석․검사․임상시험 기술정보수집비 370,000원 1,470,000

연구과제추진비

․시내, 국내 출장비 50,000원

․사무용품, 비품구입비 50,000원

․회의비 200,000원

․간식비 50,000원

350,000

연구수당 ․책임지도교사 수당 200,000원x7개월=1,400,000원

․공동지도교사 수당 100,000원x7개월=700,000원 2,100,000

합 계 6,270,000

(단위 : 원)

3. 연구 결과 및 시사점

□ 연구 결과

○ Open-field test

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각 군별로 다른 쥐에 비해 특이한 행동을 보이는 mouse의 경우 실험할 때 통제 요인의 통제 오류로 분석했고 결과의 유의성을 높이기 위해서 각 군별로 최댓값과 최솟값을 가지는 개체를 제 외하고 분석했다.

- Time in outer zone

OFT에서 time in outer zone의 경우 밖에서 잔류하는 시간이 길어질수록 더욱 불안한 것으로 분석한다. 다음 그래프는 각 군 에서 (n=10) outer zone에 머무는 시간을 측정한 결과이다.

그림 6. 각 군별로 zone 1, 3, 7, 9에 머문 시간의 총 합 그래프. 측정은 몸의 중심이 확실하게 구역으로 들어왔을 때에만 실시했다.

OFT에서 time in outer zone을 측정한 결과 카페인 투여 군이 카페인을 투여하지 않은 군과 비교할 때 확실히 카페인 투여군 이 outer zone에 머무는 시간이 더 길다.

- Distance

OFT에서의 이동 거리는 불안을 측정하는 수단 중 하나이다. 많 은 거리의 이동은 더 높은 수준의 locomotion과 낮은 수준의 불

(12)

안을, 반대의 경우는 낮은 수준의 locomotion과 높은 수준의 불 안을 의미한다.

그림 7. OFT 실험 실시 7분 중 앞의 1분, 뒤의 1분을 제외한 5분동안 이동한 총 거리의 그래프. 측정은 mice의 중심이 이동하는 총 거리로 계산되었다.

분석 방법은 위에서와 마찬가지로 최대 개체와 최소개체를 제 외하고 분석하였다. 각 군별로 Naive에서 100mg/kg으로 갈수록 점차 이동 거리가 감소한다. 카페인 투여 100mg/kg에서 이동 거 리는 최소가 된다.

- Velocity

이동거리와 마찬가지로 속도 또한 이동 거리와 마찬가지로 locomotion을 측정하는, 즉, 불안 측정요소 중 하나이다. 속도가 빠른 경우 낮은 불안을, 속도가 느린 경우 높은 불안을 의미한 다.

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그림 8. OFT 내에서의 각 군별 mice의 평균 속도 그래프.

속도는 이동 거리와 같은 경향성을 보여준다. 같은 시간에 다른 이동거리를 이동하기 때문에 같은 경향성을 보여주는 것이 당연 하기 때문에 이 자료의 경우 이동 거리와 같은 의미를 가진다.

- Frequency

그림 9. OFT 내에서의 각 군별 mice의 영역 이 동 횟수. 각각의 zone에 들어갔다 나오는 횟수 를 총합한 그래프이다.

OFT에서 측정하는 다른 요소로는 각각의 구역을 오가는 횟수가 있다. 이 또한 보행성 활동량을 측정하는 방법 중 하나로 위에서 언급된 속도와 이동거리 두 요소와 같은 의미를 가진다. 마찬가

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지로 행동 실험에서 control group에서 100 mg/kg group으로 가 면 갈수록 점차 횟수가 줄어든다. 이는 카페인 투여에 따른 불안 의 증가로 분석할 수 있다.

○ Elevated plus maze test - Time in open arms

Open arms에서의 잔류시간이 길수록 적은 불안을 뜻한다. 이는 OFT에서의 outer zone 분석과 마찬가지로 불안할수록 구석으로 가려는 쥐의 성질 때문이다.

그림 10. 각 군별 closed arms에 머문 시간.

위 그림에서 살펴보면 카페인 open arms에 머무는 시간이 카페 인 비투여군에서 50 mg/kg군까지는 증가하고 100 mg/kg 투여군 에서는 다시 증가하는 것으로 나타났다.

- Entries into the open arms

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그림 11. Open arms 경계 통과 횟수.

Entries into the open arms의 경우에서도 또다시 50 mg/kg 근 처에서 peak가 있고 100 mg/kg로 가면 다시 감소하는 경향성이 나타난다.

LA test는 outer zone 잔류시간이 naive control group, vehicle control group, experimental group 1(caffeine 50 mg/kg), experimental group 2(caffeine 100 mg/kg) 순으로 증가하였고 마 찬가지로 travel distance와 velocity는 위 순서대로 감소하였다.

EPM test에서는 experimental group 1(caffeine 50 mg/kg)가 open arms에서 머무른 시간이 가장 짧았고 open arms를 드나든 횟수 가 가장 많았다. Naive control group, vehicle control group, experimental group 1 순의 경향성은 이해가 가지만 왜 experimental group 2에서 open arms에서 머문 시간이 다시 증 가하고 open arms를 드나든 횟수가 감소하는지는 해석하지 못하 였다.

○ 혈액 분석 결과

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  WBC(K/uL) NE(K/uL) LY(K/uL) MO(K/uL) EO(K/uL) BA(K/uL) PLT(K/uL)

1 1.18 0.3 0.78 0.09 0.01 0 1168

2 0.78 0.12 0.55 0.09 0.02 0.01 704

3 2.82 0.51 2.08 0.15 0.05 0.03 1183

4 0.64 0.17 0.38 0.07 0.01 0.01 1221

5 2.66 0.23 2.33 0.09 0 0 1073

6 0.58 0.09 0.43 0.06 0 0 1153

7 2.52 0.3 1.95 0.17 0.08 0.03 2152

8 0.7 0.14 0.5 0.05 0.01 0.01 1072

9 0.92 0.14 0.74 0.04 0 0 1020

평균 1.4222222 0.222222

2 1.0822222 0.09 0.02 0.01 1194

  NE(%) LY(%) MO(%) EO(%) BA(%)

1 25.2 66.16 7.21 1.16 0.28

2 15.33 70.24 11.49 2.24 0.69

3 18.16 73.69 5.47 1.66 1.02

4 26.5 58.87 11.26 2.22 1.16

5 8.65 87.63 3.46 0.13 0.13

6 15.44 74.23 9.59 0.73 0

7 11.81 77.21 6.56 3.06 1.36

8 19.62 71.5 6.65 1.41 0.83

9 14.88 80.03 4.71 0.2 0.18

평균 17.28778 73.28444 7.377778 1.423333 0.627778 표 7 Naive 군 각 게체에 대한 혈액 분석 표이다. WBC농도를 100%로 하여 계산했다.

(17)

  WBC(K/uL) NE(K/uL) LY(K/uL) MO(K/uL) EO(K/uL) BA(K/uL) PLT(K/uL)

1 1.46 0.25 1.1 0.11 0.01 0 1731

2 0.72 0.14 0.52 0.06 0 0 1592

3 1.34 0.2 1.01 0.07 0.05 0.01 1070

4 0.6 0.04 0.52 0.03 0 0 981

5 1.6 0.31 1.1 0.1 0.08 0.02 1490

6 0.94 0.08 0.8 0.06 0 0 1968

7 0.92 0.15 0.68 0.03 0.05 0.02 925

8 0.38 0.05 0.26 0.04 0.02 0.01 1138

9 1 0.09 0.84 0.06 0.01 0 1196

평균 0.9955556 0.145555

6 0.7588889 0.0622222 0.0244444 0.0066667 1343.4444

  NE(%) LY(%) MO(%) EO(%) BA(%)

1 16.95 75.08 7.25 0.49 0.23

2 18.86 72.17 8.51 0.46 0

3 14.88 75.51 5.12 3.65 0.83

4 6.78 87.37 5.62 0.22 0

5 19.17 68.58 6.31 4.87 1.08

6 8.42 84.87 6.04 0.33 0.33

7 16.59 73.88 2.99 4.92 1.64

8 13.87 68.43 11.44 4.91 1.35

9 8.94 84.35 5.96 0.75 0

평균 13.82889 76.69333 6.582222 2.288889 0.606667 표 9 Veh 군의 혈액 분석 결과이다. WBC의 농도를 100%로 하여 계산한 %농 도이다.

(18)

그림 12. caffeine 50mg/kg 투여군에 대한 혈액 분석 표

그림 13 caffeine 100mg/kg 투여군에 대한 혈액 분석 표

○ PCR 분석을 위한 primer design

그림 14 Glucocorticoid receptor primer design

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그림 15 Mineralocorticoid receptor primer design

그림 16 Actin receptor primer design

□ 시사점

4. 홍보 및 사후 활용

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5. 참고문헌

【연구성과 보고서 작성 시 유의 사항】

․폰트 휴먼명조, 15pt, 보고서 분량은 A4 20쪽 이내

․연구 과정을 충실하게 기술하되 간결하고 경제적으로 표현할 것

․불필요한 폰트, 디자인 서식, 이미지 등을 가급적 자제할 것

․사진, 그림 등을 적절히 배치하되, 이미지 해상도를 적절하게 조정하여 보고서 파일은 20MB를 초과하지 않도록 할 것

참조

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