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이학 석사학위 논문
Go 단백질의
알파 소단위체에 의한
신경돌기형성의 조절
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과 / 신경과학전공
오 휘 현
Go 단백질의
알파 소단위체에 의한
신경돌기형성의 조절
지도교수 서 해 영
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함
2016 년 02 월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과 / 신경과학전공
오 휘 현
오휘현의 이학 석사학위 논문을 인준함.
아 주 대 학 교 대 학 원
i - 국문 요약 –
Go 단백질의 알파 소단위체에 의한 신경돌기형성의 조절
Heterotrimeric G protein 은 많은 신경전달물질과 호르몬에 의해서 일어나는 신호전달을 중개한다. 모든 G 단백질들 중에서, Go 는 신경세포분화에 관여한다고 알려져 있지만 어떻게 중재하는지는 명확히 알려진 바가 없다.이전 연구에서 Goα 가 F11 세포에서 신경돌기진전(neurite outgrowth)을
조절한다는 것을 보았다. Goα 가 과발현되는 세포에서 신경돌기의 평균길이는 감소하였으나 세포당 신경돌기의 수는 반대로 증가하였고 이러한 양상은 cAMP-PKA-CREB 신호에 의해 매개되었다. 본 연구에서는 신경돌기형성 과정 동안 Go 의 기능획득과 기능상실변이를 F11 세포와 일차신경세포에서 각 각 조사하고 그 기작을 밝혀내는데 목적이 있다. 이를 위해 미세소관과 액틴과 같은 세포뼈대단백질(cytoskeletal protein)의 양상을 관찰하였다. Go 가 없는 조건의 배측피질 신경세포(dorsal cortical neuron)에서 짧은 돌출부(short protrusion) 또는 신경돌기(neurite)가 적게 나타났으며 형성 시기 또한 늦어졌다. 반면 F11 세포에서 Goα 를 과발현 시킨 후 시간의 흐름에 따라 관찰하였을 때, 신경분화 초기단계에서 Goα 가 신경돌기형성을 유도함을 보았다. 이러한 Goα 는 PKA 의 catalytic subunit(c)과 물리적으로 결합하며 이러한 결합이 세포 내 PKA-Cα 가 핵으로의 이동을 억제함을 확인하였다. 더불어 PKA-Cα 가 세포의 핵보다 세포질에서 과발현 되었을 때 형태학적으로 Goα 가 과발현 되었을 때와 비슷한 양상을 보임을 관찰함으로써 결론적으로 Goα 가 PKA-Cα 의 위치를 영향을 줌으로써 신경돌기형성에 기능을 한다는 것을 알 수 있다.
ii
차 례
국 문 요 약 ... ⅰ 차 례 ... ⅱ 그 림 차 례 ... ⅲ 표 차 례 ... ⅲ 사 용 기 호 ... ⅳ Ⅰ . 서 론 ...1 Ⅱ . 재 료 및 방 법 ... 10 1. F11 세포 ... ... 10 2. F11 세포의 배양 및 분화유도 ... 10 3. F11 세포에서 신경돌기형성의 측정 ... 10 4. 일차 신경세포 배양 ··· 12 5. Western 분석 ··· 12 6. 면역세포화학염색 ··· 13 Ⅲ . 결 과 ... 16 Ⅳ . 결 론 및 고 찰 ... 29 참 고 문 헌 ... 33 ABST R ACT ... 37iii
그 림 차 례
Fi g.1. 미 세 소 관 ( mi cr ot ubul e) 과 F -액 틴 (ac t i n) 의 구 조 ...3
Fi g.2. 일 차 섬 모 (Pri mar y ci l i a) 의 구 조 ...5
Fi g.3. G 단 백 질 의 기 능 적 순 환 ...7
Fi g.4 . IR ES -G oα -E GF P 벡 터 와 IR ES -Gi α -EGFP 벡 터 지 도 ... 11
Fi g.5. Goα 단 백 질 발 현 확 인 ... 19 Fi g.6. Goα 유 전 자 결 여 로 인 한 신 경 돌 기 형 성 의 지 연 ... 20 Fi g.7. Goα 유 전 자 유 무 와 분 화 시 간 에 따 른 일 차 섬 모 의 개 수 비 교 ... 21 Fi g.8. 분 화 단 계 초 기 , F11 신 경 아 세 포 종 에 서 Go α 의 과 발 현 에 의 한 신 경 돌 기 형 성 의 유 도 ... 25
Fi g.9. GT Pase do mai n 을 통 해 이 뤄 지 는 G oα 와 PK A -Cα 의 결 합 에 의 한 세 포 내 PK A -Cα 의 위 치 변 화 ... 26 Fi g.10. PKA-Cα 의 세포 내 발현 위치에 따른 F11 세포의 형태학적 변화 .... 27 Fi g.11. 신 경 세 포 의 신 경 돌 기 내 에 서 예 상 되 는 Goα -PK A C α 의 신 호 전 달 경 로 ... 28
표 차 례
Tabl e.1. 사 용 된 항 체 정 보 와 조 건 ... ... 14 Tabl e. 2. 사 용 된 시 약 정 보 ... 14 Tabl e 3. 생 쥐 의 유 전 형 을 확 인 하 기 위 한 Pr i mer 서 열 과 PC R 조 건 ... 15iv
약 어 (Abbreviation)
AK AP : A -ki nase anch ori ng pr ot ei n AC : Aden yl yl c ycl ase
Ar l 13b : ADP -r i bos yl a t i on f act or l i ke GT Pase 13B db -c AMP : di but yr yl c AMP
DMEM : D ubel cco ’s m odi f i ed eagl e ’s medi u m EPAC : Exchan ge f act or di rect l y act i vat ed b y c AMP FBS : F et al bo vi ne ser u m
GDP : Guanosi ne di ph osphat e GFP : Gr een f l uoresce nce prot ei n GPC R : G prot ei n –cou pl ed r ecept or GT P : Guanosi ne t r i ph osphat e
HBS S : Han ks ' Bal an c ed Sal t Sol ut i on IR ES : Int ernal ri boso me ent r y si t e
MAP2 : Mi crot ubul e a ssoci at i ng pr ot ei n 2
MARK 2 : M i crot ubul e aff i ni t y -r e gul at i n g ki nase 2 NES : Nucl ear ex port si gnal
NLS : Nucl ear l ocal i zat i on si gnal PBS : Phosphat e buffe red sal i ne
PK A : cAMP -de pende nt prot ei n ki nase RGS : Re gul at ors of G prot ei n si gnal i n g SDS : s odi u m dodec yl sul f at e
１
Ⅰ . 서 론
신경세포(Neuron)는 하나 또는 그 이상의 길고 얇은 돌기(Protrusion), 즉 신경돌기(Neurite)로 인하여 형태학적 특징을 보이게 된다. 신경세포의 많은 양상들, 예를 들면 성장(growth), 형태형성(morphogenesis) 그리고 기능적 분화(functional differentiation) 등이 넓게 연구 되고 있다. 놀랍게도 상대적으로 신경돌기 형성의 과정 중 제일 처음에 발생하는 사건, 신경계의 개시(Neurite initiation), 에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 신경계의 개시 과정 동안에 나란히 연결된 미세소관(microtubule)이 단단한 번들을 형성하고 액틴 필라멘트는 성장원뿔(Growth cone)을 만들기 위해 다시 재정비 된다. 이러한 세포골격의 재배열과 관련된 기작에 대해서는 아직 완전히 이해되지 못하고 있다(Dehmelt and Halpain, 2004). 신경세포골격을 이루는 주요한 세가지로는 F-액틴과 미세소관 그리고 신경미세섬유가 있다. 세포골격은 세포의 모양을 만들고 분획화(compartmentalization)하며 극성을 띄게 하는데 매우 주요한 역할을 하며 이러한 과정은 축삭(axon)과 수상돌기(dendrite)를 통해 시냅스 신호를 주고받는 성숙한 신경세포로 분화하는데 있어서 전반적으로 발생한다(Lowery and Van Vactor, 2009; Dent et al., 2011; Stiess and Bradke, 2011). 세포골격 단백질 중, F-액틴과 미세소관은 각 각 ATP 결합 G-액틴과 GTP 결합 α-β-튜불린(tubulin)으로 조합된 동적 중합체(dynamic polymer)이다. 중합체를 이룬 후 소단위체의 전환률에따라서 F-액틴과 미세소관의 고유한 안정성이나 동적인 움직임이
결정된다(Campellone and Welch, 2010).
특히 미세소관(microtubule)은 가장 기본적이며 가장 중요한 “신경돌기 지표” 이며 미세소관의 존재 여부에 따라서 filopodia 를 닮은 돌기나 수축 섬유 그리고 많은 형태학적 구조물로부터 신경돌기를 구분할 수 있다. 이러한 미세소관이
２
세포에서 가지는 기본적인 역할은 소포가 운송될 수 있는 길을 만드는 것이다. 이는 미세소관을 기초로 만들어진 세포막 수송이 성숙한 축삭(mature axon)의 진전에 주요한 제한 요소라는 사실로 알 수 있다. 미세소관이 자신의 역할을 수행하기 위해서는 ‘안정화’(stabilization)가 필요하다. 예를 들면, microtubule-associated protein 2 (MAP2)에 의해서 안정화된 미세소관은 평행하게 혹은
역평행으로 정렬되어 lamellipodia 에서 신경돌기 시작 지점으로 역할을
한다(Salmon et al., 2002). 또 다른 역할로써 미세소관은 중요한 신호 단백질과 상호작용하여 그들의 위치나 활성을 조절한다(Gundersen and Cook, 1999).
３
Fig.1. 미세소관(microtubule)과 F-액틴(actin)의 구조
α 튜뷸린과 β 튜뷸린이 이합체가 되고, 서로 결합하여 나선형을 이루면서 계속적으로 배열되어 속이 빈 관 모양의 미세소관을 형성하게 된다. GTP 가 결합된 α- β-튜뷸린은 (+)말단을 통해 중합체에 결합하고 GTP 가 GDP 로 바뀌면 반대로 (-) 말단으로부터 떨어져 나간다(왼쪽 그림). G 액틴이 이합체가 되고 삼합체가 되면서 중합체인 F-액틴이 만들어진다. 액틴도 미세소관과 마찬가지로 G-액틴에 ATP 가 결합하면 중합체의 (+) 말단에 결합하고 ATP 가 ADP 로 가수분해되면 (-) 말단에서 분리된다(Lowery and Van Vactor, 2009).
４
섬모(Cilia)는 이러한 미세소관을 기반으로 만들어진 대표적인 구조물로써 세포의 표면으로부터 뻗어 나온 형태를 가진다. 이 구조물은 크게 두 종류, 운동 섬유와 비운동섬유, 로 나누어 진다; 운동 섬유(motile cilia)는 이동이나 흐름을 만들어 이동하며, 비운동섬유(nonmotile cilia) 또는 일차섬유(primary cilia)는 수동적으로만 움직인다. 두 종류 모두 각 길이에 따라 아홉개의 평행한 미세소관 다발로 이루어져 있으며 운동섬유의 경우 움직임에 필요한 디네인(dynein)을 포함하고 있다. 비운동 섬유는 빛과 소리와 같은 특별한 감각 신호를 받는 곳인 광수용체나 내이 모 세포 등의 감각 세포에 특수화 되어 기능을 한다고 잘 알려져 왔다(Lee and Gleeson, 2010). 또한 섬유의 길이나 구조에 발생하는 결함은 ciliopathy 라 불리는 발달 장애와 관련이 깊다.
일차 섬유가 가지는 가장 큰 구조적인 특징으로는 막으로 둘러 쌓여 있는 탄성 섬유인 축사(axoneme)가 있으며 앞서 언급한 것처럼 기저체(basal body)의 아홉 트리플렛(triplet)을 기반으로 아홉쌍의 더블릿(doublet) 미세소관 (doublet microtubule)로 구성되어있다. 이러한 미세소관은 모두 (+)말단이 섬유의 끝에 위치하게 되며 전자현미경으로 관찰하였을 때 섬유의 말단에 고정된 모자모양의 캡(cap)이 존재한다. 이 밖에도 소포 유통 (vesicle trafficking)에 정류소와 같은 역할을 하는 섬모 주머니(ciliary pocket)와 섬모와 세포간의 경계선 기능을 하는 전이영역(transition zone)이 있다(Pusapati and Rohatgi, 2014)
신경세포에서 일차 섬모는 소뇌의 발달(cerebellar development)과 해마에서의 신경조직발생(Hippocampal neurogenesis) 그리고 특별히 축삭돌기의 유도(axonal guidance)에 영향을 준다. 예를 들면, ciliopathies 중에 하나인 Joubert syndrome (JB)을 가진 환자들에게서 주요한 구심성(afferent)과 원심성(efferent) 축삭로(axonal
tract)의 교차에 결함이 나타났다. 몇 몇 JB 환자들에서는 완전히
추체교차(pyramidal decussation)가 없어진 것을 발견할 수 있었으며 더불어 신경교차에 이상이 생기면 인지능력과 운동능력 또한 감소하였다(Friede and Boltshauser, 1978; Yachnis and Rorke, 1999; ten Donkelaar et al., 2000).
５
６
G 단백질은 호르몬이나 신경전달물질에 의해서 발생하는 신호를 전달하는 역할을 하며, 3 개의 소단위체(subunit) α,β 그리고 γ로 이루어져 있다. G 단백질 연결 수용체와 호르몬이나 신경전달 물질이 결합하게 되면, G 단백질의 α소단위체는 βγ 이합체로부터 유리된다. 이러한 과정에서 α소단위체는 guanosine diphosphate (GDP)가 결합되어 있는 비활성화 형태에서 guanosine triphosphate (GTP)가 결합된 활성 상태로 전환되었다가 활성을 마치면 다시 비활성화되는 일련의 조절순환과정을 거친다.
Go 단백질은 뇌(brain)에서 가장 풍부하게 발현하는 heterotrimeric G
protein 으로써(Sternweis and Robishaw, 1984) Gi/Go family 의 구성원으로 분류된다. 또한, Go 는 성장원뿔(growth cone)을 이루는 세포막의 주요한 요소중의 하나로(Strittmatter et al., 1990) 대뇌 세포막의 0.5%를 차지하는 단백질이다(Huff et al., 1985). Go 가 신경돌기진전(neurite outgrowth,NOG)과 관련 있다는 증거가 여러 가지가 있는데, Mastoparan, Gi/Go 억제제, 은 닭의 배아 신경세포에서 성장원뿔를 붕괴시키며 이는 또 다른 Gi/Go 억제제인 pertussis toxin 에 의해서도 동일하게 발생한다(Igarashi et al., 1993). Gi/Go 수용체와 결합하는 신경전달물질들은 몇 몇 신경 세포주에서 NOG 를 저해하지만(Haydon et al., 1984; Lankford et al., 1988; Rodrigues Pdos and Dowling, 1990) Go 는 NOG 에 상반된 영향을 준다. PC12 세포에서 Go 의 GTPase 활동에 자극을 받는 GAP43 이 NGF 처리 하에 NOG 를 유도한다(Yankner et al., 1990). 반면 세포 내의 항체인 anti-GAP43 의 운반은 신경아세포종의 NOG 를 억제시킨다(Shea and Benowitz, 1995). 최근에는 초파리의 신경근접합부(NMJ)에서 Go 가 세포막과 세포뼈대단백질 사이의 연결고리 역할을 하는 ankyrin 과 물리적으로 결합하면서 신경돌기진전 경로를 유지시킨다고 보고된 바 있다(Luchtenborg et al., 2014). 이와 같이 Go 가 신경돌기의 형성이나 진전에 대한 기능과 역할은 점점 밝혀지고 있으나 그 기작에 대해서는 아직 잘 알려지지 않았다.
７ Fig.3. G 단백질의 기능적 순환 G 단백질 활성의 순환을 도시화한 그림이다. 7-막관통 수용체에 작용물질(Agonist,Ag)결합하면 G 단백질로부터의 GTP 가 결합된 형태의 α 소단위체 분리가 촉진된다. GTP-Gα 와 Gβγ 이합체는 서로 분리되어 각 각의 기질(effector)을 조절한다. 다양한 기질과 G 단백질 신호 조절자(regulators of G protein signaling, RGS)에 의해서 GTP 가 GDP 로 바뀌는 가수분해가 가속화된다. 결과적으로 GDP-Gα 는 다시 Gβγ 이합체와 결합하게 된다(Wettschureck and Offermanns, 2005).
８
Protein kinase A(PKA)는 heterotetrameric enzyme 으로써 두 개의 동일한 regulatory subunit(R)과 두 개의 catalytic subunit(C)로 구성되어 있다. PKA 의 소단위체는 R 소단위체 같은 경우 RIα, RIβ, RIIα, 그리고 RIIβ 등 4 종류가 있고 C 소단위체는 Cα, Cβ, 그리고 Cγ 등 3 가지가 있다고 알려져 있다. 이러한 R 소단위체의 분류에 기초하여 type I 과 type II 로 구분되어진다(Scott, 1991).
PKA 는 휴지기 상태에서는 각각의 R 소단위체가 C 소단위체에 결합한 형태로 있으며 그 기능을 막는다(Zhong et al., 2009). R 소단위체에 cAMP 가 결합하게 되면, 단백질의 입체구조가 변화하게 되고 결국 C 소단위체는 R 소단위체는 대한 친화력 감소로 인하여 R 소단위체로부터 떨어져 나오게 된다. 이렇게 유리된 C 소단위체는 기질을 인산화 시키고 그 기질의 기능을 조절한다. 활성화된 C 소단위체의 기질로는 대표적으로 세포 내 핵 안에 존재하는 전사조절인자인 CREB 이 있으며 C 소단위체는 세포질에서 핵으로 전위(translocalization)되어 CREB 을 인산화 시킴으로써 특정 유전자의 발현을 유도하게 된다.
PKA 의 기능은 세포 내 cAMP 의 농도와 A kinase anchoring protein (AKAPs)의 발현에 의해 직접적으로 조절되는데 앞서 언급했듯이 cAMP 가 조절소단위에 결합하면 촉매소단위가 방출되고 이로 인하여 다양한 기질들의 활성이 조절되어진다.(Taylor et al., 1990). 또 다른 PKA 조절자인 AKAPs 는 RII 동형단백질과 상호작용하며 직접적으로 PKA 신호의 세포 내 위치에 영향을 준다(Colledge and Scott, 1999). 대표적인 AKAP 인 MAP2 의 인산화에 의존적으로
PKA RII 는 미세소관과 함께 세포내에서 위치하여 신경돌기신장(neurite
elongation)을 촉진시킨다(Huang et al., 2013). 또한, PKA 는 MARK2 의 인산화에 관여하여 미세소관의 안정성과 신경돌기 진전을 조절한다. C 소단위체도 R 소단위체와 마찬가지로 세포 내 위치에 따라 그 기능을 한다. C 소단위체가 활성을 갖게 되면 원형질막으로부터 신경돌기 말단으로 이동하게 되고 이러한 위치 변화로 인해 같은 신경돌기에 특정적으로 존재하는 Rac1 을 활성화하여 세포의 형태에 영향을 준다(Goto et al., 2011).
９ 본 실험에서는 첫 번째로 Goα 유전자가 결여된 생쥐 배아의 피질 세포를 시간대 별로 관찰하였다. 같은 조건에서 같은 시간 배양하였음에도 신경돌기가 뻗어나가는 정도의 차이를 보였으며 따라서 Gano+/+ 신경세포보다 Gnao-/-에서 신경돌기형성이 일어나는 시기가 늦어짐을 알 수 있었다. 두 번째로 F11 세포에서 Goα 를 과발현 했을 시에는 다른 대조군과 비교하여 신경돌기의 길이는 짧아지나 한 세포가 가진 신경돌기의 수는 유효하게 증가하였다. 또한, F1 세포에서 Goα 와 PKA-Cα 의 GTPase 를 통한 물리적 결합이 Cα 가 세포질에서 핵 안으로의 전위를 제한하였고 이러한 세포 내 Cα 의 분포에 따라서 신경돌기의 길이가 변화하였다. Cα 가 세포질에 과발현 되면 핵에 과발현 되었을 경우보다 신경돌기의 길이가 짧아졌으며 이는 Goα 를 과발현 한 세포에서도 마찬가지로 관찰되었다. 결론적으로 Goα 와 PKA-Cα 로 이어지는 신호기작이 신경돌기의 형성을 조절함을 확인하였다.
１０
Ⅱ . 재 료 및 방 법
1. F11 세포F11 세포는 쥐의 뒤뿌리신경절세포(dorsal root ganglion)와 Dr. M .Fishman (Harvard university, Cambridge, MA, USA)로부터 얻은 생쥐의 신경아세포종 세포주를 융합하여 얻은 세포주 (hybrid cell line)이다. cAMP 에 의해서 신경세포로 분화되는 특징을 갖는 세포이다.
2. F11 세포의 배양 및 분화유도
F11 세포는 37°C, 5% CO2 조건에서 10% FBS, 100 units/ml penicillin 그리고
100μg/ml streptomycin 이 포함된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 에서 배양하였으며, 이틀에 한번씩 HBSS (Hank’s balanced salt solution)으로 씻어낸 후 0.25% trypsin-EDTA 용액을 사용하여 세포를 배양용기의 바닥으로부터 분리시킨 다음 계대배양하였다.
F11 세포를 분화시키기 위하여 우선 배양 배지를 제거한 후에 HBSS 로 한 번 씻어주었다. 그 후 0.5% FBS, 100 units/ml penicillin , 100μg/ml streptomycin 그리고 30μM Forskolin 이 포함된 분화 배지를 처리하였다. 이틀에 한 번씩 처리해준 분화 배지의 절반의 양을 제거하고 그와 동량의 배지를 더 넣어 주었다.
3. F11 세포에서 신경돌기형성의 측정
IRES-EGFP, Goα- IRES-EGFP 그리고 Giα-IRES-EGFP 를 각 각 F11 세포에 형질전환시킨 후, 4 일 동안 GFP 를 발현하는 세포들만 선택하여 형광사진을 얻었다. 각 시기의 형광사진을 가지고 세포의 신경돌기 길이를 Metamorph software 를 이용하여 분석하였다.
１１
１２ 4. 일차 신경세포 배양 16.5 일 되는 생쥐 배아의 전뇌 배측 피질을 분리하여 HBSS 로 두 번 씻어준 뒤 상온에서 300xg 로 2 분 원심분리하였다. 상측액을 제거하고 Accumax 를 pellet 에 양에 따라 적정량 처리한뒤 37°C, 5% CO2 조건에서 5 분간 처리하였다. 조직을 완전히 풀어준 후 다시 상온에서 300xg 로 2 분 원심분리하였다. 상측액을 최대한 제거한 뒤 Plating media (MEM based, 45% Glucose, 1mM sodium pyruvate, 1% pen/strep, 2mM Glutamax, 10% FBS) 에서 풀어주고 전날 16h 동안 PDL 로 코팅한
커버글라스(12mm)에 3X104
cell 씩 분주하였다. 1-2 시간 후 세포가 완전히 커버글라스에 붙으면 HBSS 로 한 번 씻어준 후 Neurobasal media (Neurobasal media based, 0.5mM Glutamax and B27 supplement,)로 배지를 바꾸어 주었다.
5. Western 분석
생쥐에서 분리한 전뇌 혹은 중간뇌의 용해물에 PBXT (1mM EDTA, 1XPBS, 5mM Mgcl2, 1% Triton X-100)를 처리하여 pellet 을 잘 풀어준다. 4°C rotator 에서 1 시간 동안 단백질이 추출될 수 있도록 충분히 반응 시키고 4°C, 12000 rpm 에서 10 분간 원심분리한다. 얻은 상측액으로 bradford assay 를 하여 얻은 단백질의 농도를 측정하였다. 원하는 단백질 분리를 위해 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 이용하였다. 단백질은 sample buffer 를 첨가하고, 끓인 후, electrophoresis buffer(183.3mM glycine, 119mM Tris, 0.2% SDS) 에서 전기영동하였다. 80V 로 stacking gel 까지 내리고 120V 로 원하는 지점까지 전기영동을 실시한 후 gel 상의 단백질을 membrane 으로 옮기기 위해 12 volt 에서 100 분간 semi-dryer transfer (25mM Tris-base, 192mM glycine)하였다. 5% skim-milk 로 비특이적 결합을 제거한 후 membrane 을 일차항체로 상온에서 1-2 시간 반응 시킨후 0.2% TPBS (0.2% Tween20 를 포함하는 PBS 용액) 로 10 분씩 3 번 씻어준 후, membrane 을 이차항체와 상온에서 1 시간동안 반응시킨 후 마찬가지로 0.2% TPBS 로 10 분씩 3 번 씻어주었다. 이차항체에 결합된 기질의 활성을 Super Signal substrate 를 사용하여 필름에 감광시켰다.
１３ 6. 면역세포화학염색 피질신경세포 혹은 F11 세포를 각 각 면역세포화학염색을 하기 위해서 세포를 24-well 의 커버글라스 위에 옮겨 배양하였다. 특히 F11 세포의 경우 형질주입 후 커버글라스위로 세포를 옮겼다. 먼저 커버글라스를 0.1 mg/ml 의 poly-D-lysine 용액으로 코팅 한 후, HBSS 로 2 번 씻기고 세포를 분주하였다. 커버슬라스 위에서 필요한 시간만큼의 배양이 끝나면 4% paraformaldehyde 용액으로 10 분간 고정시킨 후 1XPBS 로 두 번 세척하였다. 10% BSA, 1% normal goat serum 을 1 시간 처리하여 항체의 비특이적 반응을 제거한 후 1 차항체를 적절한 비율로 1XPBS 에 희석하여 항체의 종류에 따라 4°C 에서 16 시간 혹은 상온에서 2-3 시간 반응시켰다. 이 후 TPBS 로 5 분간 3 번 세척한 다음 이차 항체를 1:500 으로 PBS 에 희석하여 상온에서 1 시간동안 반응시키고 마찬가지로 hoechst (1:10000)를 상온에서 10 분간 처리해주었다. 이를 현광현미경이나 공초점 현미경으로 관찰하였다.
１４ Table 1. 사용된 항체의 정보와 조건
Table 2. 사용된 시약 정보
Antibodies Source Company Catalog No. Use Goα Rabbit Santa cruz SC-387 IB (1:100) Tuj1 Mouse Bio legend 801201 IF (1:300) PKA-Cα Mouse BD 610981 IF (1:200) FLAG Mouse sigma F-1804 IF (1:200) Alexa Fluor 488 Phalloidin Molecular Probes A-12379 IF (1:40) HRP conjugated anti-rabbit Goat Invitrogen G-21234 IB (1:1000)
Alexa 488 anti-mouse Goat Life technologies A-11001 IF (1:500) Alexa 568 anti-mouse Goat Invitrogen A-11004 IF (1:500) Alexa 568 anti-rabbit Goat Invitrogen A-11011 IF (1:500)
Antibodies Company Catalog No. DMEM Welgene LM001-05
FBS Hyclone SH30919-03 Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Pen/Strep Gibco 15140-122 MEM/EBSS Hyclone SH30024-01 Neurobasal medium Gibco 21103-049
Sodium pyruvate sigma S8636 Glutamax Gibco 35050-061 Glucose (45%) sigma G8796 B27 supplement Gibco 17504-044
１５
Table 3. 생쥐의 유전형을 확인하기 위한 Primer서열과 PCR 조건
Primer Sequence Size
Wild Type Hetero type Mutant type Go129
Pol12R1 5’-TGT GCT CTA GTA GCT TTA CGG AGC-3’
224 bp 224 bp 275 bp 275 bp Int6R1 5’-ACC TGG CCT CCC TTG GGA ATA CAG-3’
Ex6F1 5’-CAG CGA TCT GAA CGC AAG AAG TGG-3’
Temperature Time Cycles
Go129 94 oC 5 min 30 Cycles 94 oC 30 sec 64 oC 30 sec 72 oC 45 sec 72 oC 2 min 4 oC Forever
１６
Ⅲ . 결 과
A. 발달 시기에 따른 뇌조직에서의 Go 의 발현 정도 확인
Go 가 신경돌기발생에 어떠한 역할을 하는지 알기 위하여 크게 두 가지 방법으로 실험을 진행하였는데, Go 의 loss of function 과 gain of function 을 일차신경세포와 F11 세포 각 각에서 관찰 하였다. 또한, 이전 논문에서 βγ 이합체가 아닌 α 소단위체가 신경돌기진전을 관여함을 보았기 때문에(Ghil et al., 2000) 본 연구에서도 α 소단위체에 초점을 맞춰 실험을 진행 하였다. 사용할 생쥐의 시기를 정하는데 있어서 Goα 의 발현 양상과 그 정도, 야생형(Gnao+/+)과 돌연변이(Gnao-/-) 간의 차이가 중요 결정요인이기 때문에 이를 먼저 보았다(Fig.5). 배아 시기부터 완전히 다 자랐을 때까지 각 시기의 쥐의 대뇌를 분리하여 Goα 의 발현 정도를 비교 하였더니 시간이 지날수록 발현 정도가 증가하였다(Fig.5 A,B). Goα 가 배아 16.5 일부터 확연히 발현을 시작하고 무엇보다 Go 돌연변이의 경우 태어나는 것 자체가 어려우므로 E16.5 의 배아를 사용하여 실험하기로 결정하였다. 따라서 이 시기의 Gnao+/+과 Gnao-/-의 Go 단백질 발현 정도를 비교하였더니 돌연변이에서는 전혀 Goα 가 발현되지 않았고(Fig,5C), 이는 같은 시기의 피질 신경세포에서도 마찬가지였다(Fig.4D).
B. Loss of function of Goα : Goα 유전자가 결여된 조건에서의 신경돌기형성
초기의 신경세포는 신경돌기를 가지기 전 lamellipodia 라는 액틴 필라멘트로만 이루어진 봉오리 형태의 구조물을 가지고 있다. 점차 액틴 필라멘트가 분획화되어 작아지며 이를 따라 미세소관이 정렬되면서 비로소 신경돌기가 형성된다. 따라서 신경돌기가 만들어 지는 과정을 가시화 할 수 있는 지표로 보통 미세소관과 액틴이 사용되어 지고 있다(Dehmelt and Halpain, 2004).
Goα 가 존재 하지 않을 때 신경돌기형성이 어떻게 되는지를 알아보기 위하여 E16.5 의 야생형과 돌연변이 각 각의 피질 신경세포를 배양하여 시기별로
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미세소관과 액틴의 변화 양상을 관찰하였다(Fig6). 각 시점에서 액틴은 Gnao+/+과 Gnao-/- 사이에 차이를 보이지 않았지만 미세소관이면서 신경세포의 지표인 βIII-tubulin 의 경우 뻗어 나가는 정도와 그 시기가 야생형 보다 Goα 가 없는 환경에서 늦어짐을 보였다(Fig.6A). 이를 정량적으로 분석하기 위하여 세포체(cell body)의 길이를 기준으로 세 가지로 분류하였다(Fig.6B). 첫 번째로 neurites 는
세포체의 지름보다 긴 돌기를 말하고(Fig.6B-3), protrusion 은 세포체의
반지름보다는 길지만 지름보다는 짧은 돌기를 가리킨다(Fig.5B-2). 마지막으로 indeterminates 는 neurites 와 protrusion 둘 다 아닌 정의 할 수 없는 신경세포를 지칭한다(Fig.6-1). 여러 시기의 신경세포 중에서도 미세소관의 가장 차이가 두드러지게 보이는 분화 후 15h 의 세포를 위의 3 가지 기준을 토대로
분류하였다(Fig.6C). 각 기준의 비율을 비교하였을 때, Gnao-/- 피질
신경세포에서는 Gnao+/+에 비하여 neurite 나 protrusion 이 아닌 indeterminate 의 비율이 현저하게 높았다. 이러한 결과를 바탕으로 같은 시간 동안 같은
조건이라도 Goα 가 있지 않을 시에는 신경세포의 분화, 정확히 말해
신경세포형성이 더디게 일어남을 알 수 있다. 반면에 신경세포에
축삭돌기(axon)와 수상돌기(dendrite) 모두 생성되어 어느 정도 성숙한 신경세포가 되었을 때는 형태학적으로 Gnao+/+와 Gnao-/- 차이를 보이지 않았다(Fig.6D). 따라서 Goα 가 없을 때 신경돌기가 완전히 만들어 지지 않는 것이 아니라 그 생성속도가 더디게 일어나는 것임을 다시 한번 확인할 수 있다. 종합적으로, Goα 가 신경돌기형성에 영향을 미치는데 이는 신경세포의 분화과정에서 초기에 일어나는 일이며 시간이 지날수록 Goα 의 역할이 축소된다고 볼 수 있다. C. Goα 유전자 유무에 따른 신경 세포가 가지는 일차 섬모 관찰 외부 혹은 내부의 신호를 수용하는 능력의 차이가 신경돌기형성과 관련이 있는지 알아보기 위하여 감각신호를 받아들이는 데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 일차섬모를 관찰하였다. 일차섬모를 탐지하기 위해서 Arl13b 항체를 사용하였다. Arl13b 는 ADP-ribosylation factor family 중에 하나로 세포막
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유통(membrane trafficking)과 세포 골격 역학 (cytoskeletal dynamics)을 조절한다고 가장 잘 알려진 섬모 단백질이며, 더불어서 위와 같은 역할을 함으로써 섬모가 구조를 형성하는데 필요하다고 알려져 있다(D'Souza-Schorey and Chavrier, 2006; Zhou et al., 2006).
위의 실험에서 가장 세포의 모양의 차이가 많이 보였던 분화 후 15 시간된 피질 신경 세포에서 일차 섬모를 관찰하였다(Fig.7A). Goα 유전자 유무와 상관없이 두 신경세포 모두에서 일차섬모를 발견할 수 있었다(White arrow). 분화과정에 따라서 전체적으로 차이가 있는지 보기 위해 각 시점 별로 섬모의 개수를 세어 보았더니(Fig.7B) 모든 시점에서 Gnao+/+ 가 Gnao-/- 보다 섬모를 가진 세포 수의 비율이 더 많았지만 유효한 차이는 아니었다. 따라서 Goα 의 결여로 인하여 나타나는 신경돌기의 형성의 변화와 섬모와의 개수와는 상관이 없음을 확인할 수 있었다. 이 외에도 두 개의 섬모를 가진 세포를 관찰 하였고, 섬모 방향성이나 길이 또한 측정하여 보았으나 마찬가지로 Gnao+/+와 Gnao-/- 간의 차이는 발견할 수 없었다 (data no shown).
１９ Fig. 5. Goα 단백질 발현 확인
(A-B) 대뇌에서의 Goα 단백질의 발현 정도가 발달과정에 따라서 점차적으로 증가한다. (A) 시기별로 western blot 으로 그 양상을 확인하였고 (B) 이를 Goα/Actin 비율로 나타내었다. (C-D) Goα 가 결여된 생쥐에서는 Goα 가 전혀 발현하지 않는다. (C)임신한지 16.5 일이 되는 Go129 의 배아의 중간뇌에서 얻어낸 세포 용해물을 가지고 실시한 western blot 결과이다. (D)같은 시기의 Gnao+/+와 Gnao-/-, 각 각의 배아의 피질에서 얻은 신경세포(15h)에서 Phalloidin(Green)과 Goα(Red)를 검출하였다(Scale bar=20μm).
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Fig.6. Goα 유전자가 결여로 인한 신경돌기형성의 지연
(A) E16.5 의 Gnao+/+와 Gnao-/- 배아의 배측피질 신경세포에서 분화를 유도하고 각 시점에서 microtubule(βIII-tubulin)과 F-actin(Phalloidin)의 발현양상을 분석하였다(Scale bar=20μm). (B) 세포분류기준; indeterminate : 신경돌기가 아직 생성되지 않은 세포를 말한다(1); protrusion: 세포체의 반지름보다는 길지만 지름보다는 짧은 신경돌기를 말한다(2); neurite: 적어도 세포체의 지름보다 긴 신경돌기를 가리킨다. (C) 분화 후 15h 의 신경세포를 (B)에 따라서 구분하여 분류하였다. (D) Gnao+/+신경세포와 Gnao-/-신경세포에서 미세소관(βIII-tubulin)을 분화 후 4d 째 관찰 및 비교했다.
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Fig.7. Goα 유전자 유무와 분화시간에 따른 일차섬모의 개수 비교
(A) 15 시간 동안 분화시킨 16.5 일되는 Gnao+/+와 Gnao-/- 배아의 배측피질 신경세포의 대표적인 형광사진이다. βIII-tubulin (Red)는 신경돌기를 Arl13b (Green)는 일차섬모를 각 각 표지하는 항체로 사용하였으며 화살표(white arrow)는 일차섬모의 위치를 가리킨다(Scale bar = 5μm). (B) 분화 후 15h, 24h, 48h 그리고 72h 되는 Gano+/+와 Gano-/- 각 각의 피질신경세포에서 한 세포가 가지는 일차섬모의 개수를 비교하였다.
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D. Gain of function of Goα : Goα 의 과발현 조건에서 신경돌기형성
이전 논문에서 db-cAMP 만을 처리하였을 때 신경돌기진전이 유도되며, Goα 단백질을 과발현하는 F11 세포의 경우 대조군에 비하여 신경돌기의 수는 증가하지만 반면에 길이는 감소하는 것을 보았다(Ghil et al., 2000). 이러한 Goα 에 의한 변화가 언제 발생하는지 확인하기 위하여 이전 논문과 동일하게 F11 세포에 공벡터와 Goα, 그리고 같은 family 인 Giα 를 과발현 시킨 후 Forskolin 처리하에 1 일 후부터 4 일 후까지 신경돌기가 시간의 흐름에 따라서 어떻게 나타나는지 관찰하였다(Fig.8A). 사용한 벡터의 경우 IRES 로 인하여 대상단백질의 발현과 동시에 EGFP 도 발현하기 때문에 세포의 모양을 관찰하기에 용이하도록 하였다. 시간 흐름에 따른 신경돌기 변화를 보면 Goα 가 과발현하는 세포의 경우 대조군과 다르게 이틀째 또는 삼일째에서 각 각 신경돌기의 수는 증가하였고(Fig.8B) 그 길이는 유효하게 감소하였다(Fig.8C). 이러한 결과는 Goα 에 의하여 F11 세포의 신경돌기 형성이 유도됨을 보여준다. 흥미로운 점은 Goα 를 과발현 시킨 후 4 일 째 되었을 때는 신경돌기의 길이와 수가 대조군과 비슷해 지는데 이는 앞서 결과와 마찬가지로 Goα 가 신경돌기의형성에 영향을 주는 시점이 제한되어 있음을 의미한다. E. Goα 로 인한 신경돌기의 변화에 관여하는 신호전달기작 : 세포 내 PKA-Cα 위치 조절 신경전달물질이나 호르몬이 G 단백질 연결 수용체에 결합하여 G 단백질이 활성을 띠게 되면 Gβγ 이합체로부터 Gα 가 떨어져 나와 Adenylyl cyclase(AC)의 작용에 기여한다. G 단백질 종류에 따라서 다르게 역할을 하는데 Gi 는 ATP 를 cAMP 로 바꾸는 AC 의 촉매작용을 억제 시키지만 같은 family 인 Go 의 경우 그렇지 않다고 알려져 있다(Toro et al., 1987). cAMP 의 대표적인 표적단백질로는 Epac 과 PKA 가 있는데, 이 중 PKA-Cα 가 Goα 의 C-말단의 GTPase domain 을 통해 Goα 와 물리적으로 결합하며 또한, Goα 와 PKA 의 결합이 PKA 의 세포 내 위치를 달리한다고 보고된 바 있다(Ghil et al., 2006). 더불어 PC12D 세포에서
db-２３
cAMP 에 의해 유도되는 신경돌기진전 과정에서 점차 PKA-Cα 의 위치가
세포질에서 신경돌기 말단으로 이동한다고 알려져 있다. 이를 토대로 F11 세포에서 Goα 로 인해 PKA-Cα 의 이동의 변화를 관찰하여 Goα 가 신경돌기형성을 유도하는 기작을 설명하고자 하였다. 이러한 기작이 Goα 와 PKA-Cα 와의 결합에 의존적으로 일어나는 일임을 증명하기 위하여 flag-tagged Goα 와 Giα 와 GTPase domain 을 변형시킨 키메라 단백질(chimeric protein), Goα/Giα 와 Giα/Goα 을 사용하였다(Fig.9A)(Ghil et al., 2006). 먼저 각 발현벡터를 F11 세포에 과발현 시키고 adenylyl cyclase 활성제인 forskolin 을 30 분 동안 처리해 주었다. Goα 가 결핍되어 있는 조건에서는 대부분의 내인성(endogeneous) Cα(green)는 핵(Blue) 안으로 이동 하였다. 중요한 점은 Goα(Red)를 같이 발현시키면 Cα 가 핵으로 이동하는 정도가 줄어들지만 반면에 Giα 는 그렇지 않았다. 마찬가지로 Goα 의 Cα-결합 domain 을 포함한 Giα/Goα 의 발현은 Cα 가 핵으로 전위되는 것을 막았지만 Cα-결합 domain 을 가지고 있지 않은 Goα/Giα 의 발현은 그러한 현상을 보이지 않았다(Fig.9B). 이와 같이 Goα 에 의해서 달라지는 세포 내 PKA-Cα 의 위치에 따라서 신경세포의 모양이 어떻게 변화하는지 알아보았다. PKA-Cα 가 핵 에서만 발현되는 신호를 가진 발현 벡터(GPKA Cα -NLS)와 핵이 아닌 그 밖에서 발현되도록 하는 신호를 가진 발현 벡터(GPAK Cα-NES), 그리고 아무 신호도 가지고 있지 않은 보통의 GPKA-Cα 를 각 각 F11 세포에 과발현 시킴으로써 Cα 발현 위치에 차이를 두었다. 또한, 여기에 더하여 Goα 가 같이 과발현 될 시에는 세포형태가 어떻게 바뀌는지도 함께 관찰하였다. Cα(Green)가 핵에서만 과발현 될 시, 핵이 아닌 곳에서 Cα 가 과발현 되는 세포와 비교하여 신경돌기의 길이(Blue)가 긴 양상을 보였지만 Goα(Red)를 같이 형질전환 시킨 세포는 후자와 비슷하게 신경돌기의 길이가 짧아졌다. 흥미로운 점은 정상적인 GPKA-Cα 와 Goα 를 같이 형질전환 시켰을 때도 마찬가지로 신경돌기의 길이가 짧은 형태를 보인다는 것이다(Fig.10). 이와 같은 결과는 PKA-Cα 가 강하게 발현되는 세포 내
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위치에 따라서, 다시 말해 PKA-Cα 가 핵이 아닌 세포질에 발현하는 양이 많아지면 신경돌기의 길이가 짧아지며 이는 Goα 의해서도 일어나는 현상임을 의미한다. 종합하자면 Goα 가 PKA-Cα 의 세포 내 위치를 조절함으로써 신경돌기형성을 유도하게 된다.
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Fig.8. 분화단계 초기, F11 신경아세포종에서 Goα 의 과발현에 의한
신경돌기형성의 유도
(A) F11 세포에 Goα 와 Giα 를 형질전환 시킨 후 4 일동안 30μM forskolin 조건에서 분화를 유도하였다(scale bar=20μm). (B) Goα 의 과발현에 의해서 한 세포가 가지고 있는 신경돌기의 수가 증가하였다. (C) 신경돌기의 총 길이를 신경돌기 수로 나눈 평균값은 Goα 를 과발현하는 세포에서 감소하였다.(Data are the mean ± SEM, *p < 0.001)
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Fig.9. GTPase domain 을 통해 이뤄지는 Goα 와 PKA-Cα 의 결합에 의한 세포 내 PKA-Cα 의 위치 변화
(A) N 말단에 Flag-tag 가 있는 Goα 와 Giα 그리고 키메라 단백질들의 도식화한 그림이다(Ghil et al., 2006). (B) 다양한 Flag-tagged Gα 를 F11 세포에 형질주입시킨 뒤, 30μM forskolin 을 30 분동안 처리하였다. 세포의 핵을 분명히 보기 위해 핵 주위를 중심으로 confocal image 를 얻었다; FLAG-Gα (Red), Cα (Green),
nucleus(Blue). Goα 의 GTPase domain 이 과발현 된 F11 세포에서 핵으로
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Fig.10. PKA-Cα 의 세포 내 발현 위치에 따른 F11 세포의 형태학적 변화
F11 세포에 여러 GFP-tagged PKA-Cα 발현벡터 또는 flag-tagged Goα 를 같이 형질주입 하였다. 이틀 뒤, 다음과 같이 confocal image 를 얻었다; βIII-tubulin(Blue), GPKA-cat(Green), Flag tagged Goα (Red). GPKA-cat 명칭; NLS: nuclear localization signal, NES: nuclear export signal; Thanks to(Bok et al., 2003)(Scale bar=100 μm).
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Fig.11. 신경세포의 신경돌기 내에서 예상되는 Goα-PKA Cα 의 신호전달경로
G 단백질 연결 수용체와 결합되어 있던 Go 단백질이 활성화되어 Gβγ 이합체에서 Goα 가 떨어져 나오게 되면 분리된 Goα 중, 몇몇의 PKA-Cα 와 결합하면서 Cα 가 핵 안으로의 이동하는 것을 막는다. 이로인하여 세포질에 머무르는 Cα 의 양과 시간이 늘어나고 따라서 Cα 가 표적으로 하는 단백질의 인산화도 증가 하게 된다. 그 중 MAPs 과 관련된 특정 단백질이 활성을 갖게되어 미세소관과 직접적으로 결합하는 MAPs 또한 인산화 됨으로 결국에는 미세소관 다발의 안정화 되면서 신경돌기형성이 유도된다.
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Ⅳ . 결 론 및 고 찰
본 논문에서는 피질 신경세포와 F11 세포에서 각 각 Go 단백질의 loss of function 과 gain of function 에 대하여 설명하였고 또한, Go 와 PKA 와의 관계를 관찰 함으로써 그 기작을 밝히고자 하였다.
피질 신경세포(cortical neuron)는 여러 형태학적 단계를 거치게 되는데 (Dotti et al., 1988) 먼저는 F-액틴이 풍부한 lamellipodia 와 filopodia 가 뻗어나는 것으로 시작하게 된다(Dehmelt et al., 2003). 24 시간 이내에, 신경세포는 여러 신경돌기를 정교하게 생성하고 이러한 과정은 동적인 F-액틴과 미세소관 둘 다 필요로 하게 된다. 초기에 넓게 자리잡고 있던 lamellipodia 는 시간이 지나면서 분획화된다. 이렇게 작아지고 조각난 lamllipodia 대신에 미세소관이 나란히 정렬되며 점차적으로 세포체로부터 이동하여 뻗어나가(migrate away) 새로운 신경 돌기 (neurite shaft)가 형성된다(Tang and Goldberg, 2000; Yu et al., 2001; Dehmelt et al., 2003). 이렇듯 최근의 연구들에서 액틴과 미세소관 둘 다 다양한 세포의 형태를 결정하는데 있어서, 특히 처음 신경돌기의 시작(neurite initiation)에 중요한 조절자로써 역할을 한다고 제안한다(Dehmelt and Halpain, 2004).
본 연구에서는 신경세포에서 미세소관과 F-액틴의 양상을 관찰 하였을 때,
Goα 가 없는 조건의 피질 신경세포의 형태가 야생형과 다르게 나타났다.
세포체로부터 뻗어나간 신경돌기의 수나 그 길이가 적고 짧았다(Fig.5A). 이를 비교하기 위해 세가지 기준 (neurite, protrusion and inditerminate)을 따라서 분화 후 15 시간 된 피질 신경세포를 분류하였더니 Gnao-/-에서 inditerminate 의 비율이
Gano+/+보다 월등히 높았지만 반면에 neurite 나 protrusion 의 비율은
낮았다(Fig.5C). 이는 Goα 가 없는 환경에서 신경세포들의 분화가 더디게 일어남을 의미한다. 더불어서 분화 4 일 후에는 Gnao+/+와 Gnao-/- 간의 신경돌기의 형태 차이가 관찰되지 않음을 통해서(Fig.5D) 이러한 Goα 가
３０ 신경돌기에 미치는 영향이 분화단계 중에서도 특정 초기 단계에 나타난다고 생각할 수 있다. 기존 연구에서 F11 세포에 Goα 를 과발현 시키고 0.5mM db-cAMP 를 처리한 조건에서 시간에 따라 세포의 형태 변화를 관찰 하였을 때 대조군과 비교하여 신경돌기의 길이는 짧아지나 가지 수는 증가하는 것을 보았다(Ghil et al., 2000).
본 실험에서도 F11 세포에 IRES-GFP, Goα-IRES-GFP 그리고 Giα-IRES-GFP 각 각의 발현벡터를 과발현 시킨뒤 4 일동안 배양하며 관찰 하였다(Fig.7A). 형질전환 후 2- 3 일 차에 Goα 를 과발현시킨 세포의 신경돌기가 다른 발현벡터를 과발현 시켜준 세포보다 이전 논문의 내용와 마찬가지로 길이는 짧아지고 그 수는 증가하는 양상을 보였다(Fig. 7B-C). 흥미로운 점은 과발현 후 4 일 차에는 이러한 차이가 보이지 않는데, 이는 피질 신경세포에서의 결과와 동일하게 Goα 의 역할이 세포의 분화과정에서 특정 시기에 제한되어 있음을 의미한다.
PKA 의 R 소단위체 (regulatory subunit)은 4 가지 동형 단백질 (RIα, RIβ, RIIα, RIIβ)로 나누어지는데 이러한 R 소단위체 의 분류에 기초하여 PKA 가 type I 과 type II 로 구분되어진다. 이 중 신경세포에서는 type II PKA 가 우세하게 나타난다(Scott, 1991)
특정 PKA 신호는 PKA 의 분포(compartmentalization)에 기여하며 PKA 의 세포 내 위치에 중요하다. AKAP 와 type II PKA 가 대표적인 예 이다. AKAPs 은 두가지의 binding domain 을 가지고 있는데 이중 하나는 type II PKA 와 결합하고 다른 하나는 세포골격 단백질 또는 세포 내 scaffold 와 결합함으로써 type II PKA 가 신경돌기내에서 머뮬며 그 역할을 수행할 수 있도록 가교역할을 한다 (Wong and Scott, 2004). 신경세포에서는 microtubule-associated protein 2 (MAP2)가 대표적인 AKAP 이며 수상돌기(dendrite)에서 MAP2 가 결여 되었을 때 다양한 PKA 소단위체가 감소한다고 알려졌다(Harada et al., 2002).
PKA 는 신경세포에서 넒게 분포되어 있는 다양한 기작들을 통해서 여러 중요한 역할을 한다. PKA 에 의하여 Ena/VASP 가 인산화 되면서 nestrin 으로 인한
３１
신경원추의 filopodia 형성이 유도된다(Lebrand et al., 2004). 또한 PKA 에 의해 synapsin 이 인산화 되면 신경돌기 진전이 증가한다. 이에 더하여, PKA-cAMP 신호는 LKB 와 GSK-3β 의 인산화를 통해 축삭 분화를 촉진시킨며(Barnes et al., 2007; Shelly et al., 2007; Shelly et al., 2011). 앞서 설명한바와 같이 type II PKA 가
MAP2 의 인산화에 영향을 주어 미세소관과 결합함으로써 신경돌기진전을
유도한다(Huang et al., 2013). R 소단위체 뿐 아니라 C 소단위체도 신경돌기의 형성에 기여함을 여러 논문에서 보았다. 예를들면 C 소단위체는 신경세포의 분화가 진행되면서 세포체부터 신경돌기의 말단 쪽으로 점점 이동하여 신경돌기형성의 매개체로써 기능을 하며(Goto et al., 2011) 또한, microtubule
affinity-regulating kinase2 (MARK2)와 tau 의 인산화를 조절하여 미세소관의 동적
안정성(dynamic stability)과 신경돌기를 유도한다(Deng et al., 2015)
이전에 우리는 Goα 와 PKA 의 C 소단위체인 Cα 가 Goα 의 GTPase domain 을 통하여 물리적으로 결합하여 COS7 cell 에서 PKA-Cα 가 핵안으로 이동하는 것을 방해하는 것을 보았다(Ghil et al., 2006). 본 논문에서는 이를 신경아세포종인 F11 세포에서 재현하다. 핵안으로 이동할 수 있는 충분한 신호를 주었음에도 불구하고 Goα 또는 Goα 의 GTPase domain 을 가진 키메라 단백질(Giα/Goα)을 과발현 시킨 세포에서 PKA-Cα 가 여전히 세포질에 남아있었다(Fig. 8B). F11 세포에서 PKA-Cα 가 세포질에 과발현 시키면 핵에 과발현된 경우와 대조적으로 신경돌기가 짧아졌다. 반면 세포 내 특정 위치에 상관없이 PKA-Cα 로 형질전환 시켰을 경우 세포의 신경돌기 보다 Goα 를 같이 형질전환 시킨 세포의 신경돌기가 더 짧았다(Fig.9). 따라서 PKA-Cα 가 핵이 아닌 세포질에서 과발현 되었을 때 나타나는 신경돌기의 변화는 Goα 의 영향 하에 일어나는 일임을 알 수 있다 최근에 Drosophila 의 신경 세포에서 Go 가 Wnt-Frizzle 신호, 구체적으로 sgg, futsch 그리고 세포골격 단백질과 세포막 사이의 adaptor 역할을 하는 Ankyrin 을
３２ 통해 미세소관을 조절한다고 알려졌다(Luchtenborg et al., 2014). 이러한 연구들과 결과를 토대로 Goα 가 어떻게 신경돌기형성에 영향을 주는지 그 기작을 가정해 볼 수 있다. Goα 가 PKA-Cα 와 물리적으로 결합함을 통해서 핵이 아닌 세포질에 머무를 수 있도록 붙잡으면 그만큼 PKA-Cα 가 다양한 기질을 인산화 시킬 수 있는 기회가 더 많아 지게 된다. 이러한 기질 중, 예를들면 MAP2 또는 MARK2 와 같은 미세소관을 조절하는 단백질이 인산화되어 더욱 활발하게 그 역할을 함으로써 그 하위 신호에 있는 단백질들도 영향을 받게된다. 최종적으로 미세소관과 액틴과 같은 주요하게 신경돌기를 이루는 세포골격단백질들이 조절됨으로써 Goα 가 신경돌기형성에 중요한 역할을 할 것으로 보여진다. 본 논문에서는 세포내에서 Goα 가 PKA 에 대해 APKPs 과 마찬가지로 scaffold 단백질로써 기능을 할 수 있는 가능성을 시사하고 있다 (Fig. 11). 본 논문에서는 Goα 는 신경세포의 분화 특히 신경돌기형성을 조절하는 데 있어서 중요한 기능을 하며, 이러한 역할의 시작은 PKA-Cα 와 직접적으로 결합하여 핵으로 전위를 억제함으로써 일어남을 보였다. 또한 Goα 와 PKA-Cα 의 결합으로 인하여 세포의 분화의 시기 또는 형태, 즉 신경돌기의 길이와 수의 변화가 동반되는 것도 관찰하였다. .
３３
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The alpha subunit of a heterotrimeric GTP binding Go protein (Goα) regulates neurite formation.
Heterotrimeric G-proteins mediate signal transduction triggered by numerous neurotransmitters and hormones. Among all G-proteins, Go, a member of the Gi/o family, is the most abundant G protein in brain. Several studies including the one from our laboratory have suggest that Go may regulate neurite formation. The mechanism of how Go modulates neuronal differentiation has not been clearly defined. In this study, we investigated the gain- and loss-of-function of Goα in the process of neuritogenesis. Neurite extension was reduced to mostly remain as short protrusions in cortical neurons which were isolated from the Goα knock-out embryos, indicating that the formation of neurites was impaired in the absence of Goα. By compassion, overexpression of Goα increased the number of neurites at the expense of neurite outgrowth in F11 neuronal cell line. The data suggested that Goα may play an important role in neuritogenesis, in particular by inducing the formation/initiation of neurites in early neuronal differentiation. We next investigated the downstream signaling of Goα-dependent regulation of neurite formation. We first verified that Goα interacts with the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase A (PKA-C) via GTPase domain and inhibits nuclear translocation of PKA-C. We found that the cytosolic PKA-Cα is essential for neurite formation but not for neurite extension. A PKA-C mutant with the ability of nuclear translocation (GPKA Cα-NLS) could not promote neurite formation. Accordingly, a Goα mutant with the interacting ability with C being lost could not promote neurite formation. Taken together, Goα may play an important role in neurite formation occurring during embryonic development as well as cAMP-dependent neurite formation during learning and memory.
Key words : Go proteins, neuritogenesis, cAMP-dependent protein kinase(PKA)
