한국방사선산업학회

서

론

최근 수많은 종류의 세균이나 바이러스에 의한 피해 가 우리의 생활 환경에서 빈번하게 발생하고 있다. 섬 유, 종이, 가전 제품, 생활 기기 등 인간이 직접적으로 접 촉하는 주위 환경에서 수많은 세균이나 바이러스가 발 견되는가 하면 이러한 미생물에 의한 질병 및 피해가 심각하다는 사실이 보고되기 시작하면서 이들의 효율적 인 제어방안에 대한 관심이 증가하고 있다. 따라서 인체 에 무해하고 따로 소독을 하지 않아도 미생물 감염으로 부터 인간을 보호할 수 있는 지속가능한 항균 위생 물 질 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 항균 물질에는 매우 다양한 종류가 있으나 인 체에 무해하고 휘발 또는 분해가 일어나지 않는 등 안 정성이 뛰어나 광범위하게 응용될 수 있다는 장점을 지 ─ ─ 73 ──

γ-ray

를 이용하여 합성한

PVP/PEG/Carrageenan/Silver acetate

하이드로겔의 항균효과

임윤묵∙윤 영∙권희정∙박종석∙노영창* 한국원자력연구원 방사선과학연구소 방사선공업환경연구부

Antibacterial Effect of

PVP/PEG/Carrageenan/Silver Acetate Hydrogels by

γ-ray

Youn-Mook Lim, Young Youn, Hui-Jeong Gwon, Jong-Seok Park and Young-Chang Nho*

Radiation Research Division for Industry & Environment, Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea

Abstract -- In recent day, there is much interest in the biocidal activity of silver since silver is known

to be safe and effective as disinifectant and biocidal material against coliforms and viruses. In this study, hydrogels containing silver acetate as antibacterial agent have been prepared using gamma rays irradiation. The hydrogels are composed of poly(vinyl pyrrolidone) (PVP), poly(ethylene gly-col) (PEG), carrageenan and silver acetate. The concentration of solution was 9 wt%. The ratio of PVP : PEG : carrageenan was 6 : 1 : 2. The concentration of the silver acetate were 0, 0.01, 0.03, 0.05 and 0.07% and Gamma irradiation dose was 25 kGy. The Gamma irradiation dose in hydrogels with 0.01% silver acetate were 20 kGy, 35 kGy, 50 kGy, 65 kGy, and 80 kGy. The results showed that 0.01% silver acetate concentration of hydrogels by 25 kGy irradiation dose showed the high-est antibacterial activity against E. coli and Staphylococcus aureus. Moreover, antibacterial activity of various Gamma irradiation dose in hydrogels treated 0.01% silver acetate showed highest 35 kGy irradiation dose against Staphylococcus aureus.

Key words : Antibacterial agnet, Silver acetate, Hydrogels, γγ-ray irradiation

* Corresponding authors: Young-Chang Nho, Tel. +82-63-570-3060, Fax. +82-63-570-3069, E-mail. [email protected]

닌 무기계 항균 물질이 최근 각광을 받고 있으며, 그 중 에서도 은(銀)에 대한 관심과 연구가 급증하고 있다(Kim et al. 2005). 은 (銀)은 금속중에서도 미량의 사용으로도 항균성이 우수하나 독성은 인체에 미치는 영양이 거의 없는 것으 로 알려져 있으며, 은 이온에 의한 미생물 불활성화 메 커니즘은 효소 (enzyme)의 -SH기와 은 이온이 반응함에 따라 S-Ag가 생성되어 미생물 불활성화가 일어나거나, 이 이온이 미생물의 세포질막 (cytoplasmic membrane)에 있는 K++ 이온을 방출시킴으로써 미생물을 불활성화시킨 다고 일반적으로 알려져 있으며, 미생물의 DNA에 존재 하는 염기와 반응함으로써 미생물의 세포분열을 방해한 다는 메커니즘 역시 제시되고 있다 (Robert et al. 1989; Russell et al. 1994). 또한, 하이드로겔은 생체의학 분야에서 천연 물질과 인공 물질로 생체 조직을 대신하는 연구가 활발히 진행 되면서 생체 의학적 응용면에서 이러한 목적에 적합한 물질 중 하나로 알려져 있다 (Szycher et al. 1992). 이러한 하이드로겔은 혈액, 체액 및 생체조직과 접촉했을 때 우 수한 생체 적합성을 갖는다. 그래서 상처 치료용 드레싱, 콘텍트 렌즈, 인공 연골이나 막으로 자주 사용된다(Silver et al. 1989). 하이드로겔은 수분을 함유할 수 있는 고분 자 재료로서 3차원 망상구조를 갖고 있다. 하이드로겔은 대개 두 개 이상의 조성으로 이루어지는데 그중 하나가 친수성 고분자이다. 친수성 고분자 사슬이 서로 결합하 여 3차원 망상구조를 만들어 물에 녹지 않게 된다. 이러 한 하이드로겔은 원래의 형태를 유지하면서 평형상태에 이를 때까지 물에서 팽윤하게 된다. 이렇게 하이드로겔이 팽윤하는 이유는 고분자 사슬의 -OH, -CONH-, _SO3H 기 능기와 물 사이의 수화, 삼투압 현상, 모세관 현상이 작 용하기 때문이다. 또한 이 하이드로겔이 물에 용해하지 않는 이유는 정전기적 작용과 친유성 작용의 특성이기 도 하지만 대개는 고분자 사슬 사이에 공유결합 구조 때문이다 (Rosiak et al. 1994). 본 연구에서는, PVP/PEG/carrageenan/silver acetate를 이용하여 상처 치료용 하이드로겔을 제조하여, silver ace-tate 농도에 따른 하이드로겔의 항균효과와 다양한 선량 의 방사선 조사에 따른 하이드로겔의 항균효과 변화를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

1. 재 료 하이드로겔 제조에 사용된 PVP는 분자량 1.3×106_인 것을 Aldrich사 (WI, USA)에서 구입하였고, PEG는 분자 량 400인 것을 Yakuri Pure Chemicals사 (Osaka, Japan)에 서 구입하였다. Carrageenan은 MSC (Korea)에서 구입하 였고, silver acetate는 Aldrich사 (WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. 사용된 모든 시약류는 정제과정 없이 사용 되었다. 2. 하이드로겔 제조 하이드로겔의 제조방법은 PVP/PEG/carrageenan의 비 율은 6 : 1 : 2로 하여 80�C에서 물 중탕으로 3~4시간 정 도 흔들면서 용해시켰다. 이 수용액에 silver acetate를 각 각 0.01, 0.03, 0.05, 0.07% 첨가하여 혼합용액을 페트리 디쉬에 부어 방사선을 25 kGy를 조사하여 하이드로겔을 Table 1. List of bacterial strains used for antibacterial activity test

Bacterial strains No.

Escherichia coli KCTC 2441

Staphylococcus aureus KCTC 1927

Fig. 1. Antibacterial activitise of hydrogels containing various silver acetate concentration in 25 kGy irradiation dose (left: E. coli, right:

제조하였으며, 방사선량에 따른 항균활성 측정을 위해 silver acetate 0.01 M을 첨가한 고분자 용액을 페트리 디 쉬에 부어 방사선을 20, 35, 50, 65, 80 kGy로 조사하여 하이드로겔을 제조하였다. 고형분의 농도는 9 wt%로 고 정하였다. 3. 실험균주 및 배지 항균활성 측정을 위해 사용한 균주는 KCTC (Korean Collention for Type Culture)에서 구입하여 50% glycerol stock으로 -60�C deep-freezer에 보관하였다. 실험 전 균 주 0.1 ml을 액체배지 10 ml에 접종하여 24시간 35�C에 서 배양하였고, 이 배양액에서 0.1 ml를 새로운 배지 10 ml에 접종하여 18시간 동안 2차 배양하여 활성화시킨 후 실험에 사용하였다. 이 때 사용한 활성배지로는 Nutri-ent Broth (Difco, NB), 각 균주에 대한 선택배지로는 E. coli는 Nutrient Agar (Difco, NA), Staphylcpccus aureus는 PEES (Oxoid)를 사용하였다.

4. 항균활성 측정

항균활성 측정에는 paper disc방법과 colony 계수 측정 법을 이용하였다. 먼저, paper disc방법은 Nutrient Broth (NB)에서 배양한 각 균주를 멸균한 각각의 선택배지가

분주 된 페트리 디쉬에 균일하게 섞은 후, 실온에서 굳 혔다. 굳은 배지 위에 하이드로겔 (직경 9 mm×두께 2 mm)을 올려놓고, 이것을 35�C 배양기에 넣어 24시간 배 양시켰다. 그 후에, disc 주변에 생성된 clear zone (mm)의 크기를 측정하여 항균 활성 정도를 측정하였다. 또한, colony 계수 측정법은 각 균과 하이드로겔 (직경 9 mm×두께 2 mm)이 첨가 된 배양액 1 ml을 0.1% pep-ton수 9 ml에 단계적으로 희석한 다음, 희석액 1 ml을 접 종하여 35�C배양기에서 평판 배양한 수 형성된 colony 수를 계측하였다.

결과 및 논의

1. Silver acetate 농도가 항균성에 미치는 영향 하이드로겔의 방사선 조사량을 25 kGy로 일정하게 하 고, silver acetate의 농도를 0.01, 0.03, 0.05, 0.07%로 달리 하여 항균성을 실험한 결과를 Table 2와 Fig. 1, 2에 각 각 나타내었다.

E. coli의 경우는 0.01%의 silver acetate 첨가군에 가장 항균성이 좋은 것을 알 수 있었고, Staphylococcus aureus 의 경우는 역시 0.01%와 0.03%의 silver acetate 첨가군 에서 가장 항균성이 좋은 것을 알 수 있었다. 하지만 Staphylococcus aureus경우는 E. coli와 달리 모든 silver Table 2. Antimicrobal activities of PVP/PEG/Carrageenan

hydro-gels in addition of silver acetate against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

Strains Clear zone on plate (mm) Con 0.01% 0.03% 0.05% 0.07%

Escherichia coli - 15 - - -Staphylococcus aureus - 32 33 28 28

n==10

Fig. 2. Change of viable cell population of E. coli with silver ace-tate concentration. 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 0.5 1 2 4 6 Time (hr) Viable count (log CFU ml -1) Control 0.01 0.03 0.05 0.07

Fig. 3. Change of viable cell population of Staphylococcus aureus with silver acetate conentration.

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 4 6 Time (hr) Viable count (log CFU ml -1) Control 0.01 0.03 0.05 0.07

Table 3. Antimicrobal activities of PVP/PEG/Carrageenan hydro-gels in addition of silver acetate against Escherichia coli and Staphylococcus aureus vs. irradiation dose

Strains Clear zone on plate (mm)

0 kGy 20 kGy 35 kGy 50 kGy 65 kGy 80 kGy

Escherichia coli 25 - 10 15 6 10

Staphylococcus aureus 28 33 32 28 24 29

acetate 첨가군에서 높은 항균성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 2. 방사선 조사선량이 항균성에 미치는 영향 하이드로겔의 silver acetate의 농도를 0.01%로 일정하 게 하고, 방사선 조사량을 0, 20, 35, 50, 65, 80 kGy로 달 리하여 항균성을 실험한 결과를 Table 3과 Fig. 3, 4에 각각 나타내었다. E. coli의 경우는 방사선 조사량에 상관없이 방사선 조 사를 하지 않은 군에서의 항균성이 가장 좋은 것을 알 수 있었고, Staphylococcus aureus의 경우는 방사선 조사 를 하지 않은 군에 비해 방사선 조사를 한 경우 항균성이 좋은 것을 알 수 있었고, clear zone 측정에서는 20 kGy와

35 kGy에서 가장 큰 clear zone 나타내어 항균성이 특히 좋을 것을 알 수 있었다.

결

론

본 연구에서는 상처 치료용으로 제조된 하이드로겔에 항균성을 증가시키기 위한 방법으로 항균성이 우수하나 독성은 인체에 무해한 것으로 알려진 은 (銀)을 첨가하 여 적당량의 방사선 조사를 통하여 하이드로겔의 상처 치료 효과를 극대화시키고자 항균활성을 조사하여 다음 과 같은 결과를 얻었다.

Silver acetate의 농도별 항균성 측정에서는 E. coli의 경우는 silver acetate의 농도 0.01%의 첨가군에서 가장 Fig. 4. Antibacterial activitise of hydrogels containing 0.01% silver acetate in variouse Gamma irradiation dose (left: E. coli, right:

Staphylococcus aureus).

Fig. 5. Change of viable cell population of E. coli with the irradia-tion does of silver acetate.

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 4 6 Time (hr) Viable count (log CFU ml -1) Control 0 M 2.0 M 3.5 M 5.0 M 6.5 M 8.0 M

Fig. 6. Change of viable cell population of Staphylococcus aureus with the irradiation does of silver acetate.

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 4 6 Time (hr) Viable count (log CFU ml -1) Control 0 M 2.0 M 3.5 M 5.0 M 6.5 M 8.0 M

항균성이 좋은 것을 알 수 있었고, Staphylococcus aureus 의 경우는 0.01%와 0.03%의 silver acetate 첨가군에 가 장 항균성이 좋은 것을 알 수 있었다. 또한, 방사선 조사량에 따른 항균성 측정에서는 Sta-phylococcus aureus에서는 방사선 조사를 한 경우, 그렇 지 않은 경우보다 항균성이 좋은 것을 알 수 있었고, 특 히 20 kGy와 35 kGy 방사선 조사량에서 좋은 항균성을 나타내었다.

사

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이 논문은 교육과학기술부의 재원으로 시행하는 한국 과학재단의 원자력기술개발사업으로 지원받았습니다.

참 고 문 헌

Kim JY, Kim SE, Kim JE, Lee JC and Yoon JY. 2005. The

biocidal activity of nano-sized silver particles comparing with silver ion. J. of KSEE. 27(7):771-776.

Robert BT and Charles PG. 1989. The molecular mechanisms of copper and silver ion disinfection of bacteria and viruses.

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Rosiak JM. 1994. Radiation formation of hydrogels for drug delivery. J. Controlled Reaease 31:9-19.

Russell AD and Hugo WB. 1994. Antimicrobial activity and action of silver. Prog. Med. Chem. 31:351-370.

Silver FH and Doillon CH. 1989. Biocompatibility. Interac-tions of Biological and Implantable Materials, VCH Publ. Inc. New York.

Szycher M, James S and Lee JD. 1992. Modern wound dressing (A systematic approach to wound healing). J. Biomaterials

Appl. 7:142-213.

Manuscript Received: March 7, 2010 Revision Accepted: March 10, 2010