실험적 외상성 뇌손상모델에서 외상 후 저체온과 MgSO
4의 효과
*인하대학교 의과대학 신경외과학교실, 해부병리학교실**
한성록·현동근·박종운·하영수·김준미**
= Abstract =
Effects of Posttraumatic MgSO
4Injection and Hypothermia an Animal Model of Traumatic Brain Injury((((TBI))))
Seong Rok Han, M.D., Dong Keun Hyun, M.D., Chong Oon Park, M.D., Young Soo Ha, M.D., Joon Mee Kim, M.D.**
Department of Neurosurgery & Anatomical Pathology,** College of Medicine, Inha University, Seongnam, Korea
bjective：Traumatic brain injury including diffuse axonal injury has been shown to result in a decrease in brain- free magnesium concentration, an endogenous inhibitor of calcium entry into neuron, that is associated with the development of neurological motor deficits.
The goal of this study is to establish the therapeutic window during which the therapy with MgSO4 and/or hypo- thermia improve damaged neurons by TUNEL stain.
Method：Moderate brain injury was induced in 64 adult Sprague-Dawley rats, weighing 350 to 450gm each, by using a simple weight-drop device(Marmarou model).
The animals were randomly assigned to four groups(sixteen rats each, a control group, a group treated with MgSO4, a group treated with hypothermia, and a group treated with MgSO4 and hypothermia) and the rats in each group were sacrificed and studied after 12 hrs, 24 hrs, 1 wk, and 2 wks after insult. In hypothermic group, these rats were subjected to hypothermia after injury, with their rectal temperatures maintained at 32℃ for 1 hour. After 1-hour period of hypothermia, rewarming to normothermic level was accomplished over 30-minute period. In the groups treated MgSO4, hypothermia and MgSO4 were subsequently treated with MgSO4（750μmoles/kg） infused intra-muscularly at 30 minutes after trauma.
Result：In all treated groups, a significant reduction in TUNEL positive cells was found in comparison with the control group each time(p<0.001). Between treatment groups, No differnce was seen 12hrs, 24hrs, and 1wk. However, hypothermic group treated with or without MgSO4 showed more significant reduction in apoptotic cells than group treated with MgSO4 2 weeks after trauma(p<0.05). However, hypothermic group treated with MgSO4 showed no sig- nificant reduction in apoptotic cells compared with hypothermic group(p>0.05).
Conclusion：These findings suggest that both hypothermia and MgSO4 significantly improve pathological changes.
Otherwise simultaneously MgSO4 and hypothermia treatment groups is failed to provide additional neuroprotection.
These results may be relevant to the design of future clinical trials of therapeutic hypothermia and MgSO4 for trau- matic brain injury.
KEY WORDS：Rat・Hypothermia・MgSO4・TUNEL stain・Apoptosis.
OOOO
*본 논문은 1999년도 인하대학교 학술연구비 지원에 의해 이루어졌음.
서 론
외상성 두부 손상시 신경학적 손상은 일차와 이차 손상 에 의한다고 알려져 있으며, 일차 손상은 외상시 발생하는 축삭의 파열과 손상이고 이차 손상은 어느 정도 시간이 경 과한 후에 발생하는 신경 전달물질의 방출, 이온 교환 그리 고 Lactic acidosis등 생화학적 혹은 생리학적 기전에 의해 서 발생한다10). 이차 손상은 환자의 예후를 더욱 악화시키는 역할을 하기 때문에 이를 예방하기 위한 다양한 치료와 연 구가 이루어지고 있고 마그네슘과 저체온법도 그들 중 하나 이다.
외상성 두부 손상 후 마그네슘 이온의 효과는 많은 동물 실험모델에서 연구되었고, 신경 보호효과가 있다는 많은 연 구가 있다9-13)20)22)
. 마그네슘 이온의 효과는 외상성 두부 손 상 뿐만 아니라 척수 허혈증25), 뇌지주막하 출혈24)등에도 효 과가 있으며 최근의 연구에서는 뇌 경색증의 신경 보호13)29) 및 뇌성 마비 환자27)에도 임상적 효과가 있다는 보고가 있다.
두부손상후 시행된 저체온법은 많은 동물실험 모델에서 뇌 부종, 뇌척수압, 그리고 사망률을 감소시켰고. 그 이유는 이 차적인 뇌손상을 감소시키는 것으로 추측하고 있으나, 정확 한 기전은 아직 알려지지 않고 있다2)7)14-16)23)26)
.
저자는 백서의 외상성 뇌손상 모델에서 저체온법과 마그 네슘 이온 투여, 그리고 저체온법과 마그네슘 이온 투여를 같이 시행했을 때의 축삭과 신경세포 손상에 대한 신경 보 호 효과와, 시간의 경과에 따른 영향을 면역조직화학적 염색 방법을 이용하여서 비교 검증 하고자 하였다. 본 연구에서는 Marmarou 등에 의해 소개된 중량-낙하형태의 미만성 뇌 손상 실험 모델을 사용하였다. 이 모델에 의한 뇌손상은 실 제 임상상황에서의 경험과 유사한 환경을 제공하였고, 손상 을 준 후의 자연사 및 조직 병리학적 변화 등도 인체와 매우 유사한 것으로 알려져 있다5)19).
본 연구에서는 각 군간의 신경보호 효과를 증명하기 위해 신경세포의 apoptosis 정도를 비교하였고, 이를 위한 조직 화학적 염색으로 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl- transferase-mediated biotin dUTP nick end labeling)염 색을 사용하였다2)28).
대상 및 방법
1. 실험모델
실험모델은 Marmarou 등5)19)에 의해 고안된 weight- drop 형태의 기구를 이용하였다. 일정한 무게의 추를 자유
낙하시키고, 이를 통과할 수 있는 투명한 아크릴관과 이를 지지하는 지지대, 쥐를 올려놓게 되는 아크릴 함 및 일정한 저항계수를 가지는 발포제로 구성되어 있고, 추는 1개당 50 gm으로 10개를 준비하여 50～500gm까지 무게를 변화시 킬 수 있도록 하였다. 중량과 높이를 여러 조합으로 구성함 으로써 충격량을 조절할 수 있도록 하였다. 백서의 두개골 골절을 방지하기 위하여 두개골에 헬멧을 부착시키는 데, 이 것은 스테인레스강으로 직경 10mm, 두께 3mm의 금속판 이며, 백서의 두개골에서 관상봉합과 삼각봉합 사이의 정중 부에 조직접착제로 단단히 부착시켰다. 모든 백서는 chloral hydrate를 복강내 주사(최초용량 90mg/kg, 유지용량 45 mg/kg)하여 마취한 후, 추를 자유 낙하시켜 두부에 외상을 가하였다. 외상기구에 의한 충격량은 사망율을 나타내지 않 은 최초의 충격량(severe traumatic dose의 50%)을 mo- derate traumatic dose(1m～450gm)로 산정하였다.
2. 실험 재료
300에서 350gm까지의 성체 Sprague-Dawley rat를 암 수 구별 없이 사용하였다. 총 64마리의 백서를 각 군당 16마 리씩 4군(A군；대조군, B군；MgSO4 치료군, C군；저체온 치료군, 그리고 D군；MgSO4와 저체온 동시 치료군)으로 나 누고 시간대별로 각 군당 4마리씩 4군(1군；12시간, 2군；
24시간, 3군；1주 그리고 4군；2주)으로 다시 나누었다.
3. 실험 방법
모든 백서에서 Moderate traumatic dose(1m～450gm) 로 외상을 가했다. 대조군과 MgSO4 치료군은 뇌손상을 준 후 직장 온도계를 사용하여 37℃로 유지하였다. MgSO4만 투여한 군은 외상 후 30분후에 MgSO4(750μmol/Kg)를 근주 하였다. 저체온만 실시한 군은 ice box를 사용하여서 직장 온도를 32℃로 1시간 동안 유지했고, 외상성 뇌 손상 후 바로 시행하였다. 모든 백서는 저체온법 후 약 30분 동안 에 걸쳐서 서서히 정상 체온으로 가온(rewarming)을 시행 하였다.
MgSO4 투여와 저체온법을 같이 시행한 그룹은 저체온 중 외상 후 30분째 MgSO4를 근주하였고, 나머지 과정은 저체 온법을 시행한 그룹과 동일하게 시행하였다.
모든 군에서 백서는 폐사되기 전까지 자유롭게 먹이와 수분을 취할 수 있도록 하였다. 각 군별로 정해진 시간대에 chloral hydrate를 복강내 주사하여 마취한 후 isotonic saline(100～200mmHg/15 seconds)과 FAM 용액(a mix- ture of 40% formaldehyde, glacial acetic acid, 100%
ethanol；1：1：8 by volume/20minutes)을 심장관류를 시켜 뇌를 고정한 후, 두부를 절단하여 즉시 뇌를 적출하였
다. 적출된 뇌는 24시간 동안 FAM용액에 저장하여서 다시 한 번 고정하였다. 고정된 조직은 대뇌겸(falx cerebri)을 중 심으로 2mm 두께로 sagittal block을 만들었다. 광학현미 경적 검사를 위하여 파라핀 고정을 하였고 rotatory mic- rotome을 사용하여 3μm 두께의 조직슬라이드를 만든 후 immunohistochemical stain을 하였다.
4. TUNEL 염색 방법
백서의 파라핀 포매조직으로 만들어진 뇌조직 슬라이드 들을 xylene, 100% ethanol, 95% ethanol, 90% etha- nol, 80% ethanol, 70% ethanol로 연속적으로 처리함으로 써 함수시켰다. 조직 절편들은 proteinase K(Dako사 제품, S3020)로 15분 동안 상온에서 처리하여 핵에서 단백질을 벗겨낸후, phosphate buffered saline(PBS)으로 4분씩 2번 연속적으로 세척하였다. endogenous peroxidase의 활 성화를 막기 위하여 상온에서 5분 동안 3% H2O2에 incu- bation하고 PBS로 5분씩 3번 세척하였다. Equilibration buffer로 실온에서 4～5분 동안 incubation한 후 슬라이드 를 턴 뒤, humidified atmosphere에서 90분 동안 37℃에 서 terminal deoxynucleotidyl transferase reaction mix- ture(0.3U/μl：Oncor사 제품)로 incubation한 후 다시 털 고, 냉장 보관된 Working strength stop/wash buffer (stop/wash buffer 1ml in dextrose water 34ml)을 사용 하기 10분전에 37℃로 가온한 후 슬라이드를 10분 동안 37℃에서 incubation 한 후 PBS로 5분간 3번 세척하였다.
Digoxigeninperoxidase로 실온에서 30분간 incubation한 후 PBS로 5분간 3번 세척하고, AEC kit(Vector Labo- ratories)로 5～6분간 염색한 후 수세하였다. methylgreen
으로 10분간 대조염색후 수세한 후 crystal mount로 봉입 하였다.
5. 통계학적 검증
본 실험에서 얻어진 측정치의 통계는 PC-SAS(ver 6.
12)를 이용하여 각 군간의 비교 방법으로써 ANOVA with multiple comparisons(Scheff’s method)를 사용했으며, 유의 수준은 0.05로 하였다.
결 과
1. Patterns and quantification of TUNEL histochemical studies
염색체와 세포질의 현저한 농축과 세포질 내에 농축된 염 색체 조각들을 가진 세포들로서 이러한 특징을 가진 것들만 고려하였다. 매 슬라이드마다 외상 받은 대뇌피질 부위에서 저배율으로 관찰하여 가장 활발하게 나타나는 각기 다른 다 섯 군데를 정하여 전체 세포숫자와 apoptotic cells의 수를 400배율 하에서 세었다. 계산된 apoptotic cells의 quan- titation은 관찰된 apoptotic cells를 전체 세포의 숫자로 나 누고, 100을 곱하여서 구한 apoptotic index(AI)로 나타내 었다2)30).
Apoptotic Index(AI)＝
The number of Apoptotic cells The total number of cells ×100
Apoptotic cells은 주로 외상 받은 대뇌반구에 걸쳐서 분 포하고 있으며. 주로 외상후 12시간 후에 가장 많은 apo-
Fig. 1. Photomicrographs(original magnification ×100) of TUNEL stain 12hours after insult. Treatment groups(B：MgSO4, C：hypothermia and D：MgSO4 and hy- pothermia) show significant reduction TUNEL positive cells comparison with control group(A)(P<0.001).
A AA
A BBBB CC CC
D DD D
ptotic cells를 볼 수 있었고(Fig. 1-4), Table 1에서처럼 대조군에 비해 모든 치료군이 전 시간대에서 유의하게 AI의 감소를 보였다(p<0.001). 치료군간의 AI를 비교하면 MgSO4
만 투여한 군에 비하여 저체온 치료군과 MgSO4 투여와 저 체온으로 치료한 군에서 유의한 감소가 치료후 2주째에서 만 관찰되었고(p<0.001), 그 외 치료후 12시간, 24시간, 1 주일째에서는 유의한 차이를 볼 수 없었다. 한편, 저체온 치 료군과 MgSO4투여와 저체온으로 치료한군 사이에서는 AI 의 차이는 없었다(p<0.001). 시간대 별로는 모든 군에서 시간이 경과함에 따라서 통계학적으로 유의하게 감소되었다 (p<0.001).
고 찰
중증의 외상성 뇌손상(Severe traumatic brain injury)은 매우 높은 유병율과 사망율을 보이며 특히 심한 신경학적 장 애를 보이는 경우가 많기 때문에 많은 관심과 이에 대한 연 구가 이루어지고 있다1). 그 중에서도 미만성 뇌 축삭 손상 (Diffuse axonal injury)은 직접적 타격에 의한 국소적인 병 변이 아니라 관성력과 감전력에 의해서 신경 세포와 백질부 의 축삭에 광범위한 병변을 일으키는 질환으로 알려져 있고, 효과적인 치료를 위한 많은 연구가 이루어지고 있다4).
1994년 Marmarou등은 쥐를 이용한 새로운 외상성 모델
Fig. 2. Photomicrographs(original magnification ×100) of TUNEL stain 24hours after trauma. Similar result are seen as figure 1.
Fig. 3. Photomicrographs(original magnification ×100) of TUNEL stain 1week after in- sult. TUNEL positive cell display a condensed cytoplasm, chromatin and mem- brane blebbing.
A A A
A BBBB CCCC
D D D D
A A A
A BBBB CCCC
D D D D
을 제안하였다. 이 실험 모델은 직접적인 경막 충격을 피하 여 뇌간부에 집중되는 손상이 없고, 손상 후 혈압 상승이 적 거나 일시적이어서 혈뇌관문(Blood-brain barrier)의 파괴 및 자동 조절능력의 저하 같은 이차적 손상이 없어서, 인체 에서의 자연사와 유사한 환경을 제공하여 외상성 뇌 손상의 실험 모델로 많이 이용되고 있다5)19).
뇌 신경세포 보호(Neuroprotection)의 효과를 알아보기 위해서 여러 가지 방법이 제안되고 있다. 예를 들면 백서의 실험 모델에서 운동 기능의 평가 방법으로 Rotarod test8)나 postural reflex test 혹은 forelimbplacing test 등이 이용 되어지고 있다3). 이에 저자는 조직학적으로 뇌 신경세포 보 호효과를 알기 위해서 신경세포의 apoptosis를 이용하였다2).
Apoptosis는 형태학적및 생화학적 특징으로 설명되어지 는 세포사(cell death)의 한 형태이다. 형태학적으로 세포는 찌그러들고, chromatin은 농축되어지며 apoptotic body를 형성하게 된다. 생화학적 특징으로는 다음의 세가지를 포함 한다；1) 특이성 단백질로서 세포사의 표현, 2) marcromol- ecule 형성의 의존성, 3) endonucleosomal DNA fragm-
entation에 의한 nucleosomal fragments 로의 변환이며, 이는 괴사(necrosis)와는 구분되어진다4)18). 괴사와 apop- tosis간의 개념에는 아직도 논란의 여지가 있다. 하지만 DNA 분석에서 apoptosis에서 Bax gene이 Bcl-2 gene보다 더 많이 보이며, 이것이 아마도 세포의 운명을 결정하는 것으로 생각된다28). 또한 apoptosis를 일으키는 가능성 있는 기전 으로 외상성 뇌손상후에 세포내 칼슘이온의 유입에 의해서 Ca2＋/Mg2＋dependent endonuclease가 활성화되어서 DNA 의 절단이 발생하고 이것이 apoptosis를 일으킨다는 주장 이 있다17).
외상성 뇌 손상의 연구에서 외상후 뇌 손상을 최소화하 기 위한 연구가 많이 이루어졌고, 그 중에서도 저체온법과 MgSO4에 대해서 많은 연구와 실험이 이루어지고 있다2)9-
11)13-16)20)22-24).
마그네슘 이온에 의한 신경 보호 기전은 정확히 알려져 있 지 않지만 몇가지의 가능성이 제안되었다. 그 중에서도 마 그네슘 이온은 칼슘 이온의 유입에 영향을 준다는 것이 주 목받고 있다. 마그네슘 이온은 칼슘 이온 channel의 길항 작 용을 하는 것으로 알려져 있다12). 외상성 혹은 허혈성 뇌 손 상 이후 칼슘 이온의 유입의 증가는 중추 신경계에서 세포사 를 일으키는 것으로 알려져 있고, 마그네슘 이온은 칼슘 이 온의 유입을 줄여서 세포사를 줄일 수 있다는 것이다22). 마 그네슘 이온은 NMDA(N-methyl-D-aspartate) channel 의 blocker로써 작용한다. NMDA channel blocker는 흥분 독소(Exitotoxin)의 분비를 제한하고 결국 2차성 신경 손상 을 줄이게 된다20)21). 그리고 Glutamate나 Aspartate 같은 흥분성 아미노산 및 신경 전달 물질은 외상성 혹은 허혈성
Table 1. Apoptotic index(AI) of each treatment group in TUNEL stain
12hrs 24hrs 1wks 2wks Control 50 ±0.7 38.6±4.0 29.8±0.6 17.6±1.7 MgSO4 35.6±2.6 24 ±3.4 20.6±2.2 11.4±0.2 Hypothermia 31 ±1.3 22.4±1.3 15 ±3.6 3.5±2.0 MgSO4＋
Hypothermia 35.4±3.1 23 ±1.1 19.2±3.7 5.4±1.6 Values are expresses as the means±SD, Abv.)hrs；hours, wk；week, wks；weeks
Fig. 4. Photomicrographs(original magnification ×100) of TUNEL stain 2weeks after trauma. These show hypothermic group treated with or without MgSO4(D or C) more significant reduction in apoptotic cells than group treated with MgSO4(B)(p<0.05). But, group D shows no significant reduction in apoptotic cells compared with group C(p>0.05).
A AA A
DDD D
BB
BB CC CC
뇌 손상환자에서 조직 손상에 많은 역할을 하는데, 기전은 불분명 하지만 Na＋과 Cl-의 초기 유입을 초래하여 급격한 세포의 부종을 유발시키고 Ca2+의 유입으로 지연성 조직손 상을 유발시킨다고 알려져 있다21). 마그네슘 이온은 흥분성 아미노산의 분비 및 신경 전달 물질을 조절하는데 중요한 역 할을 하는데, 위 두가지 기전을 억제시켜서 신경 보호 효과 를 유발시키게 된다는 것이다12)21). 또한 혈소판응집을 억제 시키고, 이것은 뇌경색 주위에 혈류의 우회 순환(collateral circulation)을 향상 시키고 혈관확장을 유발시켜서 뇌 허혈 증에 유용한 효과를 보인다13).
마그네슘 이온은 외상 후 적어도 4일까지 떨어지게 된다.
결국 마그네슘 이온의 보충은 외상성 뇌의 항상성 유지에 필 요하게 되고 이는 결과적으로 신경 보호 효과를 갖게 되는 것이다9). 마그네슘 이온의 주입 시기는 최근의 연구에 의하 면 24시간 이전에 투여할 경우, 의미 있는 신경 보호 효과가 있었고 그 이후에 투여할 경우는 효과가 떨어진다고 한다11).
동물과 인체 모델에서 저체온법의 신경 보호 효과에 대한 많은 연구가 있었고 외상성 뇌손상 후 상당한 신경 보호 효 과를 보이는데, 정확한 기전은 아직 알려져 있지 않지만, 외 상 후 손상받은 뇌 피질부위에서 생기는 glutamate와 asp- artate등의 흥분성 아미노산 생성의 신속한 증가를 더디게 하고7), 대사 작용을 느리게 혹은 정지시키는데 작용함으로써, 세포의 에너지 요구량을 감소시킨다. 결국 이것은 흥분성 아 미노산에 의해서 유발되는 많은 자극으로부터 세포의 취약 성을 감소시키게 되는 것이다23). 이 외에도 외상에 의해 증 가된 세포외의 NO 말기 생성물의 증가를 감소시켜서 신경 보 호 효과를 유발하고26), 최근에 자기 공명 분광법(Magnetic resonance spectroscopy)을 이용하여 분석한 결과 포도당 대사가 pentose phosphate pathway를 통해서 분획(frac- tion)의 단락(shunting)이 증가되고, 이 pathway의 상향 조 정(upregulation)은 세포 형태의 유지, 미토콘드리아의 막 투 과성의 안정, 그리고 유리 산소 손상(oxidative damage)을 감소시킨다15). 본 실험에서는 MgSO4와 저체온법을 동시에 실시할 경우에 신경 보호의 상승 효과가 있는 지 여부를 알 기 위해서 두 개의 조건을 동시에 시도하였다. 치료군간에는 12시간, 24시간 그리고 1주에는 신경 보호 효과의 차이를 보이지 않았다. 하지만, 2주째에 MgSO4 치료군은 저체온을 실시한군과 MgSO4와 저체온을 같이 실시한 군에 비해서 AI가 높았다. 이것으로, 시간이 지나면서 저체온법이 MgSO4
군에 비해 신경 보호의 효과가 더 있는 것으로 추정할수 있 지만, 저체온법에 MgSO4를 추가한 실험군과 저체온법만 치 료한 군간에는 AI의 차이가 없어서 저체온법에 MgSO4를 추 가한 것은 큰 효과가 없는 것으로 생각된다. 이 이유로 두 가
지 치료법이 주로 2차 신경 손상 기전에 작용을 하므로 서 로 상충되거나 비의존적인 기전에 작용하여 상승 효과가 나 타나지 않는 것으로 추정된다. 앞으로 각각의 기전에 대한 더 많은 연구와 실험이 필요하다고 생각된다.
결 론
외상성 뇌 손상 모델에서 MgSO4와 저체온법이 신경 보호 효과가 있다는 것을 신경 세포의 apoptosis를 볼 수 있는 TUNEL 염색을 통해서 확인하였으나, 저체온법과 MgSO4
근주를 같이 시행했을 때 2주 이전에는 신경 보호의 상승 효 과는 보이지 않았지만 2주 이후에는 MgSO4군에 비해 저체 온법을 실시한 군에 더 좋은 신경 보호의 효과를 보였다. 저 체온법과 MgSO4는 실제 임상적으로는 많이 시행되어 지고 있지는 못하다. 앞으로 실제 임상에 적용할 수 있도록 많은 연구와 노력이 필요로 할 것으로 생각된다.
•논문접수일：2000년 5월 22일
•심사완료일：2000년 8월 17일
•책임저자：하 영 수
461-194 경기도 성남시 수정구 태평4동 7336번지 인하대학교 의과대학 인하병원 신경외과학교실 전화：031) 720-5391(외래), 5861(의국) 전송：02) 744-8459
E-mail：[email protected]
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