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J. Mushrooms 2018 September, 16(3): 213-217 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2018.16.3. 213 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author
E-mail : limitcho@korea.kr, herbin3@rda.go.kr Tel : +82-43-871-5731, +82-43-871-5782 Received August 30, 2018
Revised September 14, 2018 Accepted September 28, 2018
PC12 신경세포주에서 녹각영지버섯 주정 추출물의 산화 스트레스 개선 효과
김형돈 · 이은영 · 박정용 · 서경혜 · 이강효 · 최재훈 · 한재구 · 조재한* · 이승은*
농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부
Protective effect of ethanolic extract of antler-shaped
Ganoderma lingzhi against oxidative stress in PC12 neuronal cell line
Hyung Don Kim, Eun Young Lee, Jeong-Yong Park, Kyung Hye Seo, Kang-Hyo Lee, Jehun Choi, Jae-Gu Han, Jae-Han Cho*, and Seung Eun Lee*
Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseong, Chungbuk 27709, Korea.
ABSTRACT:
This study was carried out to identify medicinal mushrooms with protective effects against oxidative stress in PC12 neuronal cell line, followed by evaluation of their antioxidant property. Extracts of medicinal mushrooms, including Ganoderma lucidum extract (GLE), antler-shaped Ganoderma lingzhi extract (AGLE), Hericium erinaceus extract (HEE), and Sanghuangporus baumii extract (SBE), were screened for cytotoxicity using MTT assay. None of the extracts up to 10 µg/ml concentration affected cell viability. These extracts were further checked for their protective effect against oxidative stress-induced reactive oxygen species (ROS) production. Exposure to 50 µM H
2O
2induced ROS generation in PC12 cells, which was inhibited only by treatment with AGLE. In addition, inhibition of H
2O
2-induced ROS generation by AGLE was found to be in a dose-dependent manner (2.5, 5, and 10 µg/ml). Microscopic examination of DCF fluorescence for detection of ROS showed a similar pattern.
Further, antioxidant activity of AGLE was determined by ABTS radical cation assay, and its IC
50was found to be 46.90±0.31 µg/ml.
Taken together, these results suggest that AGLE may help to alleviate oxidative stress in PC12 neuronal cells.
KEYWORDS: Antler-shaped Ganoderma lingzhi, Neuronal cell, Oxidative stress
서 론
영지, 노루궁뎅이, 상황 버섯은 대표적인 약용 버섯으로
지금까지 다양한 약리 효과가 보고되었다. 영지버섯은 항 암, 고혈압, 당뇨, 뇌졸중 및 심장병 등 각종 성인병에 효 과가 있는 것으로 알려져 있고(Cho et al., 2015) 노루궁 뎅이버섯은 항암, 면역활성, 항염증, 당뇨 등의, 상황버섯 은 항암, 면역활성, 항염증, 항산화 등의 효과가 알려져 있다(Kang et al., 2017; Park et al., 2018). 그리고 공통 적으로 알려진 약리 효과 중 하나는 항치매 효과인데(Cho et al., 2015; Jo et al., 2012; Park et al., 2018), 활성 기 전에 관한 연구는 많이 보고되어 있지 않은 상황이다.
알츠하이머병, 파킨슨병 등 신경퇴행성질환은 산화자극, 글루탐산에 의한 흥분성 독성, 비정상 단백질들의 축적, 칼슘에 의해 매개되는 독성, 유전적 결함, 자가면역이상 등의 여러 가지 기전들이 관여하는 것으로 알려져 있다 (Coyle et al., 1993; Oh et al., 2006; Victor et al., 2001).
그 중 주된 원인 중 하나는 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 축적에 의한 산화적 스트레스인데, ROS는
세포가 에너지를 얻기 위해 유산소 호흡을 할 때 필연적 으로 발생되며, superoxide radical, hydrogen peroxide, hydroxyl radical 등이 있는 것으로 알려져 있다. 이들은 반응성이 매우 크기 때문에 세포막 분해, 단백질 분해, 지 방 산화, DNA 손상 및 합성 억제 등을 유발시켜 세포 손 상을 준다(Coyle et al., 1993; Han et al., 2011; Lee et al., 2005; Satoh et al., 1998; Smith et al., 1991).
영지, 노루궁뎅이, 상황 버섯의 항산화 활성에 관한 연 구는 이전부터 꾸준히 이루어지고 있으나(Kim et al., 2013; Kim et al., 2008; Oh et al., 2005), 대부분 라디칼 소거능에 관한 연구였으며, 신경세포에서 산화 자극에 대 한 버섯의 보호 효과와 관련한 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 연구에서는 신경세포에서 산화 스트레스를 개 선하는 약용 버섯을 탐색하였으며, 선발된 버섯 시료에 대해서 화학 실험, 세포 실험을 통해 in vitro 항산화 활성 을 측정하여 선발 시료의 항치매 식의약 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다.
재료 및 방법
공시균주
실험에 사용된 영지(Ganoderma lucidum), 녹각영지 (Ganoderma lingzhi), 노루궁뎅이(Hericium erinaceus), 상황(Sanghuangporus baumii) 버섯 자실체는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과에 보존되어 있는 KMCC (Korea Mushroom Culture Collection) 균주를 사용하였 으며 충북 음성군에 위치한 버섯과 종합재배동에서 재배하 였다(영지버섯: KMCC 02891, ASI(Agricultural Sciences Institute) 7071; 녹각영지버섯: KMCC 02957, ASI 7137;
노루궁뎅이버섯: KMCC 03996, ASI 48028; 상황버섯:
KMCC 03668, ASI 26030). 영지, 녹각영지, 상황 버섯의 재배는 참나무 원목에 표준재배법으로 재배하였으며, 노 루궁뎅이 버섯은 봉지재배법으로 재배하였다. 각각의 버 섯 자실체는 수확하여 열풍 건조 후(45oC 2시간 + 60oC 10시간) 분쇄한 시료를 얻었다.
버섯 추출물 제조
영지, 녹각영지, 노루궁뎅이, 상황 버섯 자실체를 열풍 건조시켜 분쇄한 후 얻은 각각의 건조 시료에 20배(v/w) 의 추출용매(70% 주정)를 가하여 24시간씩 3반복 추출한 후 흡입 여과하였고, 여과액을 회전감압 농축한 후, 각각 의 시료를 1 mg/ml의 농도로 DMSO에 녹여 영지 (Ganoderma lucidum Extract, GLE), 녹각영지(Antler- shape Ganoderma lingzhi Extract, AGLE), 노루궁뎅이 (Hericium erinaceus Extract, HEE), 상황(Sanghuangporus baumii Extract, SBE) 버섯 추출물로 만들어 실험에 사용 하였다.
세포주 배양
본 연구에 사용한 랫드 신경세포주(neuronal cell line) PC12는 American Type Culture Collection(ATCC;
Rockvile, MD, USA)에서 구입하였다. 세포주는 10%
Fetal Bovine Serum(FBS; HyClone, Logan, UT, USA)과 100 units/ml penicillin과 100 µg/ml streptomycin이 포함 된 Dulbecco’s-modified Eagle’s medium(DMEM, high glucose; HyClone, Logan, UT, USA) 배양액으로 배양 하였으며, 37oC, 5% CO2 조건(MCO-2OAIC, Sanyo, Moriguchi, Osaka, Japan)을 유지하였다.
세포 생존율 측정
랫드 신경세포주 PC12에서 시료에 의한 세포생존율 변 화를 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법을 이용하였다.
96-well plate에 37oC, 5% CO2 조건에서 배양한 세포를 1×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 세포를 배양기에서 24시간 동안 안정화시킨 후 버섯 추출물(2.5, 5, 10 µg/
ml) 및 추출물 용매(vehicle, DMSO 1%)를 처리하였다.
24시간 37oC, 5% CO2 조건에서 더 배양하고 MTT 시약 을 0.5 mg/ml로 3시간 처리하였다. 배지를 버리고, 생성 된 formazan을 DMSO로 녹여 microplate reader(Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
활성산소 (reactive oxygen species, ROS) 생성량 측정 PC12 세포의 활성산소 생성량을 측정하기 위하여 2‘,7’- dichlorohydrofluorescein diacetate(DCF-DA; Sigma-aldrich, MO, USA) assay를 하였다. PC12 세포를 96-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하여 5% CO2, 37oC incubator에서 24시간 동안 세포를 안정화시켰다. 버섯 추 출물 및 추출물 용매(vehicle, DMSO 1%)를 각각 전처리 하고 24시간 배양 후 H2O2 50 µM을 30분간 처리하였다.
배지를 버리고 10% Fetal Bovine Serum이 포함된 DMEM media에 20 µM로 DCF-DA를 첨가하여 5%
CO2, 37oC 조건에서 30분간 처리한 후, PBS로 3회 washing하고 microplate reader(Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 형광도(exitation 485 nm/emission 535 nm)를 측정하였다.
2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능 측정
ABTS 라디칼 소거능 측정은 Yoon 등(2016)의 방법을 변형하여 사용하였다. 7 mM ABTS 수용액과 2.4 mM potassium persulphate를 혼합하고 암실상태에서 실온에 4 시간 이상 반응시킴으로써 ABTS 양이온(ABTS+) 용액을 만들었다. 준비된 ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도의 값 이 0.8-0.9가 되도록 희석하였다. 농도 별로 제조한 시료
액 25 µl에 ABTS 양이온 용액 225 µl를 혼합한 후 30분 간 실온에서 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였 다. ABTS 라디칼 소거능은 시료 음성대조군에 대한 시료 군의 흡광도비(%)로 나타내었다.
radical-scavenging activity of ABTS(%) = [(A blank−A sample)/A blank] ×100
시료의 IC50(half maximal inhibitory concentration)은 ABTS의 농도를 50% 저해시키는데 필요한 시료의 농도 로 나타내었다.
형광현미경 관찰
PC12 세포의 활성산소 생성을 관찰하기 위하여 PC12 세포를 6-well plate에 2×105 cells/well의 농도로 분주하 고 5% CO2, 37oC incubator에서 24시간 동안 세포를 안 정화시켰다. 녹각영지버섯 추출물(10 µg/ml)과 추출물 용 매(vehicle, DMSO 1%)를 각각 전처리하고 24시간 배양 후 H2O2 50 µM을 30분간 처리하였다. 배지를 버리고 20 µM로 DCF-DA를 처리한 후, PBS로 3회 washing하고 형광현미경(Observer Z1, Carl Zeiss, Jena, Germany)으 로 관찰하였다.
통계처리
모든 실험은 3번 이상 반복 측정하여 평균 ± 표준편차로 표기하였으며, 처리간 유의성은 Statistical Package for Social Science 통계 패키지 프로그램(18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)으로 Student’s t-test로 검정하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
결과 및 고찰
신경세포주에서 여러 가지 약용 버섯 추출물의 처리농 도 결정
PC12 세포에서 여러 가지 약용 버섯 추출물의 처리농 도를 결정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. PC12 세 포에서 버섯 추출물을 농도별로 처리하고 세포 생존율을 확인해 본 결과, 영지(Ganoderma lucidum Extract, GLE), 녹각영지(Antler-shape Ganoderma lingzhi Extract, AGLE), 노루궁뎅이(Hericium erinaceus Extract, HEE), 상황(Sanghuangporus baumii Extract, SBE) 버섯 추출물 모두 2.5, 5, 10 µg/ml까지 추출물 용매(vehicle, DMSO 1%)만을 처리한 대조군과 세포생존율에서 큰 차이를 보 이지 않았다(Fig. 1). 이상의 결과로 10 µg/ml을 버섯 추 출물의 최대 처리농도로 설정하였다.
신경세포주에서 산화 스트레스 개선 약용 버섯 추출물 탐색
세포내 생성된 ROS는 비형광을 나타내는 DCF-DA를
산화시켜 형광물질인 DCF로 전환시키는데 이렇게 전환 된 형광물질의 양은 세포내 형성된 ROS의 양으로 간주 된다(Wang et al., 1999). 본 연구에서는 DCF-DA assay 를 통해 PC12 신경세포에서 산화 스트레스를 개선하는 약용 버섯 추출물을 탐색하였다. H2O2로 세포내 ROS 생 성을 유발하고, ROS 증가를 억제해주는 버섯 추출물을
Fig. 1. Effect of several medicinal mushroom extracts on cell
viability in PC12 cells. PC12 cell viability was measured by MTT assay. Data are representative of three independent experiments as means ± SD. C; Control(Vehicle), GLE;Ganoderma lucidum Extract(2.5, 5, 10
µg/ml), AGLE; Antler- shape Ganoderma lingzhi Extract(2.5, 5, 10µg/ml), HEE;Hericium erinaceus Extract(2.5, 5, 10
µg/ml), SBE; Sanghuangporusbaumii Extract(2.5, 5, 10 µg/ml).
Fig. 2. Effects of several medicinal mushroom extracts on
reactive oxygen species (ROS) generation in PC12 cells. ROS generation was monitored by measuring DCF fluorescence.The Data are representative of three independent experiments as means ± SD. Statistical differences(*, p < 0.05) compared to cell cultures stimulated with H2O2 in the absence of extracts are indicated. GLE; Ganoderma lucidum Extract, AGLE; Antler-shape Ganoderma lingzhi Extract, HEE; Hericium erinaceus Extract, SBE; Sanghuangporus
baumii Extract.
찾기 위해 처리구별로 DCF fluorescence 변화를 측정하 였다. H2O2 50 µM, 30분 처리의 산화 자극 조건은 PC12 세포 생존율에는 영향을 미치지 않으면서 ROS를 최대로 생성시키는 조건으로 예비실험을 통해 결정하였고, 버섯 추출물은 10 µg/ml로 24시간 동안 전처리하였다. 실험 결과 PC12 세포에서 H2O2 50 µM 단독 처리는 ROS 생 성을 4배 증가시켰으며, 4가지 버섯 추출물 중 유일하게 녹각영지버섯 추출물만이 ROS 생성을 억제시켰다. 따라 서 PC12 세포에서 녹각영지버섯 추출물은 산화 자극에 의한 ROS 생성에 억제 효과를 가지는 것으로 보여진다 (Fig. 2).
녹각영지버섯 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정 녹각영지버섯 추출물이 신경세포에서 ROS 생성 억제능 을 가지고 있는 것으로 보아 화학적인 항산화능도 우수할 것이라 판단하여 라디칼 소거능을 측정하였다. ABTS 라 디칼 소거능 측정은 ABTS가 산화 유도제인 potassium persulfate와 반응하여 청록색의 ABTS 양이온을 형성하 고 항산화 물질의 전자공여능으로 인한 탈색반응을 통해 항산화능을 측정하는 chemical assay이다(Seo et al., 2017; Adedapo et al., 2008). 녹각영지버섯의 ABTS 라 디칼 소거능을 측정해 본 결과 IC50값은 46.90±0.31 µg/
ml으로, 이는 positive control인 Ascorbic acid IC50값인 9.01±0.07µg/ml의 5배 정도이므로, 항산화 활성은 Ascorbic acid의 1/5 정도임을 알 수 있었다. Ascorbic acid는 단일 화합물임을 감안할 때 녹각영지버섯의 항산화 활성은 상 당히 우수하다고 판단된다.
신경세포주에서 녹각영지버섯의 산화 스트레스 개선 효과 PC12 신경세포에서 산화자극에 의한 ROS 생성에 녹각영 지버섯 추출물이 미치는 영향을 확인하기 위해 다시 한번 DCF-DA assay를 수행하였다. 녹각영지버섯 추출물(2.5, 5, 10µg/ml)과 추출물 용매(vehicle, DMSO 1%)를 24시 간 전처리하고 H2O2 50 µM을 30분간 처리한 후 DCF fluorescence 양을 측정하였다. 실험 결과, H2O2에 의해 유발 된 ROS 생성이 녹각영지버섯 추출물에 의해 농도의존적으 로 억제되었다(Fig. 3). 하지만 처리 농도가 커짐에 따라 억 제되는 수치의 변화가 작은 것으로 보아, 2.5 µg/ml이 충분 한 농도여서 그보다 높은 농도로 ROS 생성 억제 효과를 증 가시키기는 어렵다는 것을 알 수 있었다. 또한 ABTS 라디 칼 소거능의 IC50값(46.90 µg/ml)보다 낮은 농도에서 유의미 한 효과를 보이는 것으로 보아 녹각영지버섯 추출물은 PC12 신경세포의 여러 기전에 복합적으로 작용하여 낮은 농도에서도 효과적으로 산화 스트레스를 개선하는 것으로 판단된다. 같은 조건으로 처리하여 형광현미경으로 DCF fluorescence를 관찰해 본 결과, H2O2 50 µM에 의해 ROS 생 성이 증가하고, 녹각영지버섯 추출물(10 µg/ml)에 의해 감소 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
Fig. 3. Effects of antler-shape Ganoderma lucidum extract
(AGLE) on reactive oxygen species(ROS) generation in PC12 cells. ROS generation was monitored by measuring DCF fluorescence. The Data are representative of three independent experiments as means ± SD. Statistical differences(*, p < 0.05) compared to cell cultures stimulated with H2O2 in the absence of extracts are indicated. AGLE;Antler-shape Ganoderma lingzhi Extract.
Fig. 4. Effects of antler-shape Ganoderma lingzhi
extract(AGLE) on reactive oxygen species(ROS) generation in PC12 cells(fluorescence microscopy). ROS generation was monitored by examining DCF fluorescence under a fluorescence microscope(100×). AGLE; Antler-shapeGanoderma lingzhi Extract.
적 요
알츠하이머병, 파킨슨병 등 신경퇴행성질환은 ROS 축 적에 의한 산화 스트레스가 주된 원인 중 하나인 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 신경세포 내 ROS 생 성을 억제하는 약용 버섯 추출물을 탐색하여, 녹각영지버 섯 추출물을 선발하였다. 실험 결과, PC12 신경세포에서 H2O2 50 µM 처리에 의해 증가한 ROS 생성이 녹각영지 버섯 추출물에 의해 억제되었다. 녹각영지버섯 추출물은 우수한 ABTS 라디칼 소거능(IC50: 46.90 µg/ml)을 가지 고 있었으며, 신경세포에서 산화자극에 의한 ROS 생성을 농도의존적으로 억제하였다. 이러한 녹각영지버섯 추출물 의 ROS 생성 억제능은 형광현미경 관찰을 통해서도 확인 하였다. 본 연구의 실험 결과들은 녹각영지버섯의 항치매 기능성 소재로서의 가치를 보여주는 결과라고 할 수 있다.
감사의 말씀
본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ01193203) 의 지원에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.
REFERENCES
