대한소화기학회지 2000;35:219 - 225
11)
접수: 1999년 5월 20일, 승인: 1999년 7월 28일
연락처: 노임환, 330-714, 충청남도 천안시 안서동 29, 단국대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (0417) 550-3917, Fax: (0417) 554-1438
악성 및 양성 담관협착질환에서 담관쇄모세포진검사와 담즙에 대한 K - ras 돌연변이검사의 진단적 효과
단국대학교 의과대학 내과학교실, 외과학교실,* 소화기연구센터†
박상현・노임환・이명인・김석배・허재형 탁우택・유 권・김정택*・이학성†・이종화†
B r u s h Cy t o lo g y a n d K-r a s Mu t a t i o n An a ly s i s o f t h e B i le fo r t h e D i a g n o s i s o f Ma l i g n a n t a n d B e n i g n B i li a r y S t r i c t u r e D i s e a s e s
Sang Hyun P ark, M.D., Im Hw an Roe , M.D., Myu ng In Le e , M.D., Suk Bae Kim, M.D., J a e Hy u n g H u h , M.D., Wo o Tai k Ta k , M.D., Kw o n Yu , M.D.,
J u n g Ta i k Ki m , M.D.,* H a k S u n g Le e †a n d J o n g H w a Le e †
Departments of Internal Medicine, Surgery* and Research Institute for Gastroenterology,†
Dankook University College of Medicine, Chunan, Korea
Background/Aims: In cases that clear distinction between benign and malignant stricture is difficul
on the basis of endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) findings, cytologic confirmation is usually needed. Recently, K-ras mutation analysis of the bile has been reported to improve the diagnosis of biliary stricture disease. We investigated the effects of brush cytology and K-ras mutation analysis of the bile for the diagnosis of biliary stricture disease. Methods: Brush cytology for the strictured bile duct and K-ras analysis of the bile were performed for 24 cases o bile duct adenocarcinomas histologically proven and 15 cases of benign strictures diagnosed by histology or a minimal follow-up of 6 months. Results: Brush cytology was positive in 66.7% of patients with bile duct cancer if 2 cases of atypia were considered as positive. The K-ras mutation was observed in 66.7% of patients with bile duct cancer and 6.7% of patients with benign strictures The diagnostic results obtained from both analyses were not different significantly from that obtained from brush cytology or K-ras analysis alone. Conclusions: K-ras mutation can be easily detected in the bile juice and mutant ras is concerned in pathogenesis of bile duct carcinoma. K-ras mutation analysis of the bile might be helpful to differential diagnosis of biliary stricture diseases. (Kor JGastroenterol 2000;35:219 - 225)
Key Words: Brush cytology, K-ras mutation, Biliary stricture diseases
220 대한소화기학회지 : 제 35 권 제 2 호 2000
서 론
내시경적 역행성 담췌관조영술(endoscopic retro- grade cholangiopancreatography; ERCP)검사는 담췌 관질환의 진단에 가장 정확한 방법으로 인정되고 있 으나1 담췌관협착질환의 경우 악성과 양성을 감별하 기 어려운 경우들이 있다. 이에 대한 보조적인 진단 방법으로 담관협착질환에서는 담관쇄모세포진검사 혹은 내시경적 침 흡인 세포진검사 등이 이용되어 왔다.2 그러나 담관쇄모세포진검사의 경우에서도 검 사자의 수기 숙련도에 따라서 30-65% 정도의 다양 한 성적이 보고3-11되고 있다. 최근 분자생물학적인 검사의 발전으로 각종 소화기관암의 진단을 위한 암 유전자(oncogene)의 검출이 가능하게 되었으며 이중 K-ras 암유전자 돌연변이 분석이 소화기관암의 진단 에 활발히 활용되고 있다. K-ras 암유전자 돌연변이 는 인체 암종 중 20-40%에서 관여하고 있고,8 대장 암에서는 40% 정도,9 췌장암에서는 80-90% 정도로 관여하는 것으로10-12 알려져 있다. 그러나 담관은 췌 장과 발생학적으로 같은 전장(foregut)에서 기원하고 있음에도 불구하고 담관암에 대한 K-ras 돌연변이의 존재 유무 혹은 양성률에는 보고자마다 매우 큰 차 이가 있다.13-17 최근에는 담관암의 조직이 아닌 담즙 에서 K-ras 돌연변이의 검출을 시도하고 있으며,7,18 그 성적이 담관암의 조직을 이용한 K-ras 돌연변이 의 검출률과 크게 다르지 않아, 수술 후 절제 담관암 조직이 아닌 수술 전에 쉽게 얻을 수 있는 담즙에서 의 돌연변이성 K-ras의 분석으로 담관암의 진단적 성적을 높일 수 있는 가능성에 관심이 모아지고 있 다. 저자들은 악성 및 양성 담관협착질환에서 담관 쇄모세포진검사와 담즙으로부터 K-ras 돌연변이 유 전자검사의 진단적 효과를 평가하였다.
대상 및 방법
1. 대 상
1994년 5월부터 1998년 6월까지 수술을 통해 담 관선암으로 확진된 24예의 담관암과 최소 6개월 이 상의 추적관찰, 혹은 수술에 의해 확인된 15예의 양
성 담관 협착을 대상으로 하였다. 대상 환자 모두는 ERCP에서 담관 협착이 있는 경우였다. 24예의 담관 암의 평균 연령은 61.4±10.5세였고, 남녀 비는 14대 10이었다. 양성 담관협착질환 15예의 평균 연령은 54.5±17.1세였고, 남녀 비는 10대 5였다. 원인 질환 으로는 담관담석증에 의한 담관 협착이 7예, 만성 췌장염에 의한 담관 협착이 8예였다.
2. 방 법
1) 담관 협착부의 쇄모세포진검사
39예의 대상 환자들은 담관 협착의 진단을 위해 ERCP를 시행하여 담관 협착의 양상을 확인하였고 투시하에서 담관 협착 부위에 대한 담관쇄모세포진 검사를 시행하였다. 쇄모세포진검사(Wilson Cook, Winston-Salem, NC, USA)는 협착 부위를 완전히 통 과한 후에 협착 중심부까지 내려 반복적으로 솔질하 였다. 채취된 검체는 곧 슬라이드에 도말 후 알콜에 고정하였으며 Papanicolaou 염색을 하여 세포검사를 판독하였다. 세포진검사의 판독은 환자의 질환에 대 한 정보가 없는 병리학자에 의해 판정되었으며 선암 세포가 존재하는 경우 악성, 암세포가 없는 경우 양 성, 암세포는 아니나 비정형 세포가 존재하는 경우 를 atypia로 판정하였다.
2) 담즙 채취
담관쇄모세포진검사 후에 감황 목적으로 내시경 하 비담도배액술을 시행하였으며 2-3일이 지난 후 농축된 담즙이 없어지고 담즙 색깔이 더 옅어졌을 때 비담도 배액관을 통하여 담즙을 5 ml 이상 채취 하였다. 채취된 담즙은 K-ras 유전자 분석을 위한 DNA를 추출하기 위해 -70℃에서 실험시까지 보관 하였다.
3) 담즙에서의 DN A 추출19
채취된 담즙 3 ml를 14,000 rpm에서 5분간 원심 분리하였고 상층액을 버린 후 침전된 용액에 20 mM Tris HCl (pH 7.2), 1 mM EDTA, 0.45% SDS 0.45% NP-40과 proteinase K 100 μg/ml를 넣은 다음 55℃에서 2시간 항온 처리하였다. 같은 양의 phenol chloroform으로 2회 처리하여 DNA를 추출하였다.
박상현 외 9인. 담관협착에서 담관쇄모세포진검사와 K-ras 221
이후 chloroform으로 1회 더 추출 한 다음 DNA를 acid ethanol에서 침전시키고 TE buffer (10 mM Tris: 1 mM EDTA)에서 용해시켰다.
4) K - ras 유전자의 연쇄중합반응 및 제한효소 반응(poly mera s e ch ain reaction - r es tr ic t ion f r a g m a n t len g t h poly m or ph is m ; P C R- RF LP )법14
K-ras codon 12의 돌연변이성을 조사하기 위한 PCR 반응용액의 조성으로는 10×PCR buffer 5 μl, 25 mM MgCl2 3 μl, 10 mM dNTP 혼합액 1 μl, 100 μM primer 각각 2.5 μl, Taq polymerase (Promega USA) 2.5 unit 및 멸균된 3차 증류수를 40 μl가 되도 록 첨가시켰다. 여기에 template DNA를 10 μl 추가하 여 총 50 μl의 반응용액이 되도록 하였다. 반응에 사 용된 primers의 종류와 염기서열은 sense primer로 A- ACTGAATATAACTTGTGGTAGTTGGACCT을 두 번의 PCR 반응에 사용하였다. 첫 번째 반응의 antisense primer로 B-TCAAAGAATGGTCCTGGA- CC를, 두 번째 반응의 antisense primer로 C-TAA- TATGTCGACTAAAACAGATTTACCTC를 사용하 였다. 첫 번째 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분, 94℃
1분, 55℃ 1분, 73℃ 30초씩 30회 반응 후 73℃에서 7분간 반응시켰다. K-ras primer의 첫 번째 PCR 산 물은 157 bp였으며 첫 PCR 산물 10 μl를 제한 효소 Mva1 (Boeringer-Manheim, Germany) 20 unit를 첨 가하여 37℃에서 6시간 반응시켰다. Mva1 제한효소 는 정상적인 ras의 codon 12 염기인 GGT를 인지하 여 잘라지게 되며 정상형 ras가 제한효소의 처리로 114 bp로 나타나고 변이형 ras는 codon 12의 돌연변 이가 존재하므로 제한효소의 작용을 받지 못하여 143 bp로 나타난다. 첫 번째 Mva1 효소 반응 후의 산물 10 μl를 두 번째 PCR의 template DNA로 이용 하였다. 두 번째 PCR 반응 조건은 40회 반응시킨 것 을 제외하고는 첫 번째와 동일하게 하였다. 이후 다 시 Mva1 효소 20 unit를 처리한 후 37℃에서 6시간 반응시켜 10% polyacrylamide gel 상에서 전기영동 후 밴드를 확인하였다. 두 번째 Mva1 제한효소 처리 로 정상형 ras는 codon 12에서 잘려져서 106 bp로, 변이형 ras는 Mva1의 작용을 받지 않아 135 bp로 확
인되었다. K-ras 점 돌연변이 유전자 검출을 위한 PCR-RFLP법에서 돌연변이 유전자 양성 대조군으 로는 대장암세포주 SW 480을, 음성 대조군으로는 대장암세포주 HT 29를 사용하였다.
5) 진단 성적의 산출 및 통계 분석
담관쇄모세포진검사와 담즙 K-ras 돌연변이 유전 자검사의 진단 성적을 비교하기 위하여 예민도, 특 이도, 양성 예측도, 음성 예측도 및 진단 정확도를 구하였다. 진단 성적에 대한 통계적 검정은 chi- square test를 이용하였으며 p값이 0.05 미만인 경우 의미 있다고 판정하였다.
결 과
1. 담관암과 양성 담관협착질환에서의 쇄모세포진 검사의 결과
24예의 담관암에 대한 쇄모세포진검사 결과 악성 은 14예(58.5%), atypia 2예(8.3%), 양성은 8예 (33.3%)였다. 양성 담관 협착 15예에서는 모든 예에 서 양성으로 진단되었다. Atypia를 악성으로 인정하 는 경우 담관암에 대한 쇄모세포진검사의 악성 진단 율은 16예인 66.7%였다(Table 1).
2. 담관암과 양성 담관협착질환에서의 돌연변이 K - ras 검출률
39예의 악성 및 양성 담관협착질환에 대해 정상 형 K-ras는 모두 검출되었다. 돌연변이성 K-ras의 검출은 24예의 담관암 중 16예(66.7%)에서 관찰되 었고 양성 담관 협착 15예 중 1예(6.7%)에서 양성이 었다(Table 2, Fig. 1).
3. 담관암의 진단에서의 돌연변이 K - ras 와 쇄모세포진검사의 진단 성적
돌연변이 K-ras의 진단 성적을 보면, 예민도 66.7%, 특이도 93.3%, 양성 예측도 94.1%, 음성 예 측도 63.6%, 그리고 진단 정확성은 76.9%였으며, 쇄 모세포진검사의 경우는 atypia를 악성으로 간주하는 경우, 예민도 66.7%, 특이도 100%, 양성 예측도 100%, 음성 예측도 65.2%, 그리고 진단 정확성은
222 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 35, No. 2, 2000
79.5%였다. 또한 돌연변이 K-ras와 쇄모세포진검사 를 병합 시행한 경우는 예민도 83.3%, 특이도 93.3%, 양성 예측도 95.2%, 음성 예측도 77.8%, 그 리고 진단 정확성은 87.2%로 K-ras 검사나 쇄모세 포진검사를 단독으로 시행한 경우에 비하여 통계적 으로 유의한 차이는 보이지 않았다.
고 찰
진단이 쉽지 않은 담관협착질환을 감별하기 위한 조직학적 검사 방법으로 일반적으로 사용되고 있는
담관쇄모세포진검사는 세포진검사의 판정 결과 악 성 세포 외에 atypia(비정형 세포)가 잘 관찰되는데 atypia를 악성으로 인정하였을 경우 쇄모세포진검사 의 진단 예민도는 50% 정도이고 atypia를 악성으로 인정하지 않았을 경우 40% 이하로 보고20하고 있다.
저자들의 경우 atypia를 악성으로 인정하는 경우 진 단 예민도는 66.7%, 진단 정확도 79.5%로, atypia를 악성으로 인정하지 않는 경우 예민도 58.3%에 비하 여 높은 성적을 보였다. 또한 본 예에서는 세포진검 사에서 atypia였던 2예 모두 담관암으로 atypia는 대 부분 암 환자임을 나타내었다. 한편, K-ras 돌연변이 Table 1. Results of Brush Cytology in Bile Duct Carcinoma and Benign Biliary Stricture
Diagnosis
Brush cytology
Sensitivity Malignant Benign
Bile duct carcinoma (n=24) Benign biliary stricture (n=15)
16 0
8 15
66.7%
0%
Table 2. Results of K-ras Analysis in Bile Duct Carcinoma and Benign Biliary Stricture
Diagnosis Wild ras Mutant ras Sensitivity Bile duct carcinoma (n=24)
Benign biliary stricture (n=15)
24 15
16 1
66.7%
6.7%
Fig. 1. Detection of codon 12 K-ras mutation after amplification with the PFLP-PCR technique and digestion with Mva1. Lane 1, 20bp DNA ladder; Lane 2, mutant control (SW 480); Lane 3, wild type control (HT 29); Lane 5-7, wild type K-ras at 106 bp in the bile samples from the patients with benign bile duct stricture; Lane 8-10, mutant K-ras at 135 bp in the bile samples from the patients with bile duct carcinoma.
Park, et al. Brush Cytology and K-ras in the Biliary Stricture 223
유전자는 췌장암의 대부분에서 검출됨은 잘 알려진 바10-12 있으며 췌장암과는 달리 담관암에서는 점 돌 연변이의 존재 유무 혹은 빈도에서 매우 혼란스러운 연구 보고들13-17이 있어 왔다. 발생학적으로는 담관 이 췌장과 같은 전장(foregut)에서 기원하지만 담관 암에 대한 K-ras 암유전자의 돌연변이 분석 결과는 연구자마다 다르다. 즉, 연쇄중합반응(polymerase chain reaction; PCR) 후 직접염기분석법(direct se- quencing)을 사용하여 간외담관암조직에서의 K-ras 점 돌연변이가 10% 미만으로 적고 담낭암조직에서 는 발견되지 않았다는 보고13가 있는 반면, 간외담관 암의 100%에서 K-ras 점 돌연변이가 있다는 보고14 도 있으며 2단계 PCR 후 dideoxy sequencing법에 의 해 대부분의 간외 담관암에서 점 돌연변이를 볼 수 있다는 보고17도 있다.
이와 같이 담관암에서의 K-ras 점 돌연변이 유전 자 검출률이 다른 이유는 연구자마다 검색에 사용한 검사 방법의 예민도의 차이가 있는 것으로 생각된 다. 또한 담관암의 담즙에서의 K-ras의 점 돌연변이 에 관한 연구7,21는 매우 최근에 시작되었다. 그 이유 로는 담즙은 담관암조직에 비해 담관암세포가 매우 적어 암유전자 돌연변이를 확인하기 어렵다는 문제 점과 담즙의 점성이나 구성 성분이 조직과는 달리 DNA를 추출하는 데 어려움이 있었기 때문이다. 그 러나 최근 담즙 안에 있는 극소수의 암유전자를 내 포하는 세포들에 대해서도 예민하게 검색할 수 있는 연쇄중합법의 발전과 담즙 내에서의 DNA를 추출하 는 방법들이 안정화되면서14,17 손쉽게 얻을 수 있는 담즙에서의 K-ras 암유전자 분석이 되기 시작하고 있다. 이는 과거 수술 후 절제 조직에 의존하였던 검 체에서 수술 전 검사 과정에서 얻을 수 있는 담즙에 대해 K-ras 유전자 분석을 시행할 수 있는 것으로 담 관암에 대한 K-ras 점 돌연변이의 발암 과정에의 관 여 여부 및 양성 담관 협착과의 감별을 위한 보조적인 진단 수기로 사용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
외국의 한 보고에서는 췌장암에서 K-ras 돌연변 이 유전자 검출이 쇄모세포진검사보다 더 우수한 진 단 정확성을 가지고 있어 K-ras 유전자 분석의 경우 90%의 진단 정확도를, 쇄모세포진검사의 경우 58%
의 정확도를 보고22하고 있어 K-ras 유전자 분석이
췌장암의 우수한 보조적인 진단 방법으로서의 가능 성을 주장하였다. 그러나 담관암에서는 K-ras 돌연 변이 유전자가 췌장암에 비해 더 낮게 검출되고 있 으며 쇄모세포진검사의 예민도보다도 더 낮아 진단 에 크게 유용성이 없다고 주장하는 보고7도 있다.
본 연구에서 담관쇄모세포진검사와 K-ras 돌연변 이 유전자 검출을 비교한 결과에서는 두 검사 모두 진단 예민도가 66.7%로 동일하였고 진단 정확도도 각각 79.5%, 76.9%로 거의 동일하였으며 쇄모세포 진검사와 K-ras 유전자검사를 병합하여도 진단 예민 도 83.3%, 진단 정확도 87.2%로 단독 검사에 비하여 다소 높으나 통계적 유의성은 없었다. 따라서 담관 협착질환에서 쇄모세포진검사 혹은 K-ras 유전자검 사의 단독 검사나 두 검사를 병합하는 경우의 진단 적 가치는 거의 유사하므로 두 가지 검사를 병합하 는 것이 권장되지는 못하는 것으로 조사되었다. 이 와 같은 결과는 외국의 보고7와 유사하였는데 이 보 고에서는 담관암에 대한 담즙 K-ras 유전자 돌연변 이검사의 진단적 예민도가 25%, 진단 정확도는 35%
였고 쇄모세포진검사의 예민도는 42%, 진단 정확도 43%로 보고하였고 K-ras 유전자검사와 쇄모세포진 검사를 병합할 경우 예민도 55%, 정확도 56%로 예 민도가 더 향상되기는 하였으나 통계적 유의성이 없 다고 보고하였다. 또한 이들은 췌장 질환의 경우, 췌 액의 K-ras 돌연변이 유전자검사와 췌관쇄모세포진 검사를 병합하면 더 우수한 진단 성적을 보여 담관 질환과는 차이가 있음을 보고7하였다. 그러나 다른 보고20에서는 101예의 담관쇄모세포진검사와 42예의 췌관쇄모세포진검사의 진단 성적을 비교한 결과, 진 단적 정확성은 거의 유사하였다. 그러므로 이와 같은 진단 성적의 차이는 쇄모세포진검사를 시행하는 내시 경의의 기술에 따라 달라진다고 해석할 수 있다.
본 연구에서 담관암의 담즙에서 K-ras 돌연변이 유전자가 66.7%로 검출된 것은 K-ras가 담관암의 발생에도 중요하게 관여됨을 나타낸 것이며 K-ras 유전자 분석 방법 중 예민한 방법을 잘 선택한다면 담즙에서도 K-ras 돌연변이 유전자가 충분히 안정되 게 검출될 수 있음을 시사한 것이다. K-ras 유전자 돌연변이는 양성 담관 협착 1예에서도 관찰되었는 데 이는 K-ras 돌연변이가 상피세포가 암성 변화를
224 대한소화기학회지 : 제 35 권 제 2 호 2000
하지 않더라도 과형성 혹은 이형성 등에서도 검출 될 수 있음을 의미하였다.
이것은 췌장염의 췌액에서도 K-ras 돌연변이가 어렵지 않게 검출되고 있기 때문에 과거의 췌장암의 동물실험 모델에서 보인 K-ras 돌연변이 양성률과 관련지어 생각할 수 있다. 즉 췌장암 실험 모델에서 각 단계별 병변의 K-ras codon 12 돌연변이율은 과 형성(hyperplasia) 26%, 유두상 과형성(papillary hy- perplasia) 46%, 선암(adenocarcinoma) 80%였고, 이 미 과형성 시기에 K-ras 점 돌연변이가 발현되어 이 형성 정도가 높아짐에 따라 변이의 빈도가 증가되는 것을 보여주었다.23,24 이와 같이 K-ras codon 12 점 돌연변이는 발암 초기에서 고빈도로 발견되므로 전 암병변 혹은 조기암의 진단에 응용이 가능하다는 것25 이 시사되어 최근 임상적으로 크게 관심이 집중되고 있다. 그러나 K-ras 돌연변이가 관찰된 양성 담관 협 착 1예는 담즙 채취 후 K-ras 유전자 분석 시기부터 현재까지 2년이 경과하였으나 담관암으로 이행된 증거는 없었다.
결론적으로 담관쇄모세포진검사와 마찬가지로 담 즙에서의 K-ras 돌연변이 유전자검사는 악성 및 양 성 담관협착질환에 대한 감별을 위해 도움이 될 수 있다. 또한, K-ras 점 돌연변이는 담관암의 담즙에서 쉽게 검출 될 수 있으며 담관암의 병인에 관여하는 것으로 생각된다.
요 약
목적: 담관협착질환의 악성 및 양성 여부를 감별 하기위한 보조적인 방법으로 내시경적 역행성 담췌 관조영술검사 도중 협착 부위의 담관에서 쇄모 세포 진검사 등을 시행하고 있으며 최근 담즙에서 K-ras 의 점 돌연변이 유전자를 검출함으로써 담관질환 진 단 향상을 시도하고 있다. 본 연구에서는 담관 협착 질환에서 담즙에서의 K-ras 돌연변이 유전자 및 담 관쇄모세포진검사를 시행하여 양성과 악성 담관 협 착의 감별에 대한 진단적 효과를 평가하고자 하였 다. 대상 및 방법: 1994년 5월부터 1998년 6월까지 수술 혹은 조직검사를 통해 확인된 24예의 담관암과 담관조영술 및 추적관찰, 혹은 수술에 의해 확인된
15예의 양성 담관 협착(담관담석증 7예, 만성췌장염 8예)을 대상으로 하였다. 대상 환자에서 내시경적 담도조영술을 시행하여 협착 담관 부위에 대해 쇄모 세포진검사를 하였고, 비-담도 배액관 혹은 경피경 간 배액관을 통해 2-3일이 지난 뒤에 담즙을 채취하 여 PCR-RFLP 방법에 의해 K-ras 돌연변이를 조사 하였다. 결과: 쇄모세포진검사의 악성 검사 양성률 은 atypia 2예를 악성으로 간주하는 경우, 66.7%
(16/24)였다. 담관암에 대한 담즙 K-ras 돌연변이 양 성률은 66.7% (16/24)였고, 양성 담관협착질환에서 는 15예 중 1예(6.7%)에서만 K-ras 돌연변이를 보였 다. 또한 담즙 K-ras 돌연변이와 쇄모세포진 검사를 함께 사용한 경우엔 예민도에서 83.3%, 그리고 정확 도에서 87.2%로 향상되었지만 K-ras 또는 쇄모세포 진 단독 검사보다 유의한 차이를 보이지는 않았다.
결론: 담즙에서의 K-ras 돌연변이 유전자 검사는 담 관쇄모세포진검사와 같이 악성 및 양성 담관협착질 환에 대한 감별을 위해 도움이 될 수 있다. 또한, K-ras 점 돌연변이는 담관암의 담즙에서 쉽게 검출 될 수 있으며 담관암의 병인에 관여하는 것으로 생 각된다.
색인단어: 쇄모세포진검사, K-ras 돌연변이, 담관 협착질환
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