Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Antioxidant Compounds from Onion Peels Using Response Surface Methodology

반응표면분석법을 이용한 양파껍질 항산화 성분의 초음파 추출 조건 최적화

허희진¹․이하나¹․김영화²․정헌상¹․이준수¹

1충북대학교 식품생명･축산과학부

2경성대학교 식품응용공학부

Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Antioxidant Compounds from Onion Peels Using Response Surface Methodology

Huijin Heo

, Hana Lee

, Younghwa Kim

, Heon Sang Jeong

, and Junsoo Lee

1

Division of Food and Animal Sciences, Chungbuk National University

2

School of Food Biotechnology and Nutrition, Kyungsung University

ABSTRACT Onion peels are a rich source of antioxidant compounds that have beneficial effects on human health.

This study was conducted to optimize the ultrasound-assisted extraction (UAE) conditions for the extraction of phenolics from onion peels using response surface methodology (RSM). The optimized conditions were compared with maceration extraction (MAE) methods. A Box-Behnken design was employed to develop the following three extracting parameters:

ethanol concentration (X

: 40∼80%), extraction time (X

: 10∼50 min), ultrasonic power (X

: 150∼250 W). The optimum extraction conditions of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (38.1 mg Trolox equivalent/g dw) and 2,2-azi- no-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (77.8 mg Trolox equivalent/g dw) radical scavenging activities and total phenolic content (76.0 mg gallic acid equivalent/g dw) were obtained at X

=56.8%, X

=36.4 min, and X

=200.8 W.

The predicted results matched well with the experimental results obtained using the optimal extraction conditions, which validated the RSM model with a good correlation. Finally, UAE showed greater extraction efficiency than MAE.

Key words: optimization, ultrasound-assisted extraction, onion peel, response surface methodology, antioxidant

Received 8 February 2019; Accepted 26 March 2019

Corresponding author: Junsoo Lee, Division of Food and Animal Sciences, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-43-261-2566 Author information: Huijin Heo (Graduate student), Hana Lee (Graduate student), Younghwa Kim (Professor), Heon Sang Jeong (Professor), Junsoo Lee (Professor)

서 론

양파는 우리나라를 비롯하여 전 세계적으로 다양한 요리 에 사용되고 있는 식품재료이다(Nishimura 등, 2016). 양파 껍질은 양파의 주요 부산물로서 유럽, 스페인, 네덜란드 그 리고 영국에서 매년 50만 톤 이상이 생산되고 있다(Cam- pone 등, 2018; Lee 등, 2017). 국내에서는 양파가 2018년 기준 약 152만 톤 생산되었다. 양파에는 gallic acid, ferulic acid, protocatechuic acid, kaempferol과 같은 다양한 phenolic compounds가 함유되어 있다(Kim 등, 2013). 양 파껍질에는 양파보다 quercetin 등과 같은 기능성 성분의 함량이 더 높다고 보고되고 있다(Lee 등, 2017). 양파껍질 의 이러한 화합물들은 항천식, 항골다공증, 항암, 항폐질환, 항심혈관질환 등의 효과가 크다고 알려져 있다(Boots 등,

2008; Lee 등, 2013; Park 등, 2015). 가식 부위보다도 높 은 생리활성을 가지는 양파껍질은 기능성 식품자원으로서 활용가치가 우수하다고 강조되고 있다(Bang과 Cho, 1998;

Lee 등, 2014). Song 등(2013)은 양파껍질 추출물을 이용 한 기능성 발효유가 높은 항산화 활성을 가지며 품질변화에 도 비교적 안정적이라고 보고하였다.

기능성 원료를 추출하는 방법으로 용매 추출법, 침용 추 출법, Soxhlet 추출법, 열수 추출법, 초임계 추출법 등 다양 한 추출방법이 적용되어 왔다(Kim 등, 2018; Nipornram 등, 2018). 최근 초음파 추출법(ultrasound-assisted ex- traction, UAE)은 다양한 식물성 소재에서 페놀화합물의 추 출효율을 향상하는 데 사용되어왔다(Vuong 등, 2015). 기 존의 추출방법과 비교했을 때 UAE는 추출 공정을 단순화 시켜 추출 속도를 높이고 효율적이며 용매를 절약할 수 있다 는 이점을 가진다(Sharmila 등, 2016; Mason 등, 2011; Tao 등, 2014). 초음파는 cavitation bubble을 발생시켜 bubble 이 붕괴되면서 식물세포벽을 파괴시켜 식물세포 내부의 유 기화합물의 방출을 증가시킨다고 알려져 있다(Rostagno 등, 2003). UAE는 다양한 식물체에 적용되어 왔으며, 그 예로 호박껍질로부터 루틴 추출(Song 등, 2018), 올리브 찌 꺼기(Goldsmith 등, 2018), 병아리콩(Hayta와 İşçimen,

Table 1. Box-Behnken design (BBD) matrices and responses for experimental values

Variables Responses

Ethanol concentration (%)

X1

Extraction time (min)

X2

Ultrasonic power (W)

X3

DPPH radical scavenging activity

(TE¹⁾ mg/g dw²⁾)

ABTS radical scavenging activity

(TE mg/g dw)

Total polyphenolic content (TPC) (GAE³⁾ mg/g dw)

Quercetin content (mg/g dw) 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

40 (−1) 80 (1) 40 (−1) 80 (1) 40 (−1) 80 (1) 40 (−1) 80 (1) 60 (0) 60 (0) 60 (0) 60 (0) 60 (0) 60 (0) 60 (0)

10 (−1) 10 (−1) 50 (1) 50 (1) 30 (0) 30 (0) 30 (0) 30 (0) 50 (1) 50 (1) 10 (−1) 50 (1) 30 (0) 30 (0) 30 (0)

200 (0) 200 (0) 200 (0) 200 (0) 150 (−1) 150 (−1) 250 (1) 250 (1) 150 (−1) 150 (−1) 250 (1) 250 (1) 200 (0) 200 (0) 200 (0)

33.1 22.4 33.9 26.1 36.0 26.8 38.1 25.6 34.6 35.4 33.8 36.1 36.7 37.2 36.6

73.8 60.5 76.2 67.5 73.6 66.3 77.6 66.9 71.8 71.8 71.2 74.1 77.5 76.4 77.8

70.9 54.6 76.3 67.7 74.2 60.3 73.1 61.4 63.9 70.3 71.7 74.9 71.7 74.6 75.0

2.1 2.0 2.6 2.3 2.6 2.2 2.6 2.4 2.3 2.3 2.0 2.1 2.0 2.1 2.1

1)TE means Trolox equivalents.

2)dw means dry weight.

3)GAE means gallic acid equivalents.

The working temperature fixed at 50°C.

2017)으로부터 항산화 물질의 추출, 붉은 수수로부터 폴리 페놀 화합물 추출(Luo 등, 2018) 최적화에 대한 연구가 보 고되어 있다. 하지만 UAE가 양파껍질에 있어서 항산화 및 페놀 화합물에 미치는 영향에 대한 연구는 부족한 실정이다.

본 연구의 목적은 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하여 양파껍질로부터 항산화 성분과 항산화력이 우수한 추출물 제조를 위해 초음파 추출 조건을 최적화하고자 하였다. 추출 조건으로 에탄올 농도, 추출시간 및 초음파 세기를 독립변수로 선택하였다. 최적화 된 조건에서의 양파껍질 추출물을 일반적인 침용 추출물과 비교하여 항산화 성분과 항산화력을 평가하였다.

재료 및 방법

재료 및 시약

본 연구에 사용한 양파는 대형마트(Cheongju, Korea)에 서 구입하였다. 양파껍질을 분리하여 이물질을 증류수로 수 세하여 50°C에서 열풍건조 하였다. 분말형태로 분쇄한 후 -20°C에서 보관하여 분석용 시료로 사용하였다. 1,1-Di- phenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis-3-eth- ylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), Trolox, gal- lic acid, Folin-Ciocalteu reagent, sodium carbonate (Na₂CO₃)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

초음파 추출 및 침용 추출

양파껍질 분말 0.5 g을 취하여 40 mL의 에탄올을 첨가한 후 50°C 초음파기기(WUC-D10H, DAIHAN Scientific,

Wonju, Korea)를 이용하여 추출하였다. 이후 Whatman No.

2(Whatman International, Kent, UK) 여과지로 양파껍질 추출물을 여과한 후 50 mL로 정용하였다. 침용 추출은 도출 된 최적 조건에서 초음파를 제외하고 동일한 조건에서 교반 하여 수행하였다. 양파껍질 분말을 0.5 g 취하여 40 mL의 에탄올을 첨가한 후 50°C 수욕상에서 120 rpm의 속도로 추출하였다. 이후 동일한 여과 후 50 mL로 정용하였다.

실험설계

반응표면분석법(RSM)을 Box-Behnken design(BBD) 에 따라 3가지 독립변수(X₁: 에탄올 농도, X₂: 추출시간, X₃: 초음파 세기)를 설정하였다. 3개의 독립변수의 범위를 설정 하고 -1, 0, 1 총 3단계로 부호화하였다. BBD에 따라 총 15구간을 설정하여 추출실험을 진행하였다(Table 1). 종속 변수로는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 과 quercetin 함량을 측정하였다.

항산화 활성 측정

항산화 실험으로 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 측정 하였다. DPPH 라디칼 소거능은 Kim 등(2002)의 방법을 응 용하여 0.2 mM의 DPPH 용액 1 mL와 희석된 추출물 50 µL를 첨가한 후 암소에 30분 방치하였다. 520 nm에서 흡광 도를 측정하였고 표준물질로 Trolox를 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 응용하여 라디칼이 형성된 ABTS 용액 1 mL와 희석된 추출물 50 µL를 첨가한 후 암소에 60분 방치하였다. 735 nm에서 흡광도를 측정하 였고 표준물질로 Trolox를 사용하였다.

Table 2. Regression coefficients of the second-order polynomial

Co- efficient¹⁾

DPPH radical scavenging

activity

ABTS radical scavenging

activity TPC Quercetin β0

β1

β2

β3

β11

β22

β33

β12

β13

β23

−3.243 1.556^***

0.209^*

−0.031

−0.014^***

−0.006^***

0.0002 0.002^*

−0.0008^**

0.0004

11.539 1.163^***

0.255 0.318^*

−0.011^***

−0.008^***

−0.00007^* 0.003

−0.0009 0.0007

16.255 0.831 0.305 0.317

−0.012^**

−0.004

−0.0007 0.005 0.0006

−0.0008

7.374^**

−0.081^**

0.015

−0.029 0.0006^**

−0.0001 0.00006

−0.0001 0.00005 0.00003

1)β0 represents intercept and β1, β2, and β3 represent amount of ethanol concentration, extraction time, and ultrasonic power, respectively.

Significant at ^***

P<0.01,

P<0.05,

P<0.1.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 비색법에 따라 정량하 였다(Singleton 등, 1999). 희석한 추출물 100 µL에 2%

Na₂CO₃ 용액 2 mL를 가하고 50% Folin-Ciocalteu’s re- agent 100 µL를 가해주었다. 5분 방치 후 반응액을 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 0.1% gallic acid 를 사용하였다.

HPLC를 통한 quercetin 분석

Quercetin의 분석은 50 mL로 정용한 양파껍질 추출물을 0.45 μm PVDF membrane filter(Whatman, Clifton, NJ, USA)로 여과하여 HPLC로 분석하였다. 분석에 이용된 HPLC 칼럼은 Luna C18 column(250×4.6 mm, 5 µm, Phenome- nex, Torrance, CA, USA)을 이용하였다. 이동상 A의 용매 조성은 water : ortho-phosphoric acid(99.5:0.5, v/v)이고 이동상 B의 용매조성은 acetonitrile : water : ortho-phos- phoric acid(50:49.5:0.5, v/v)이다. 분석하는 0, 5, 23, 28, 35분 동안 이동상 B의 비율을 0%, 10%, 82%, 10%, 10%의 비율로 흘려주었다. 유속은 1.0 mL/min이고 UV 파장은 255 nm를 이용하였다.

통계처리

반응표면분석은 독립변수 X_i와 X_j에 대한 종속변수 Y(항 산화력, 총 폴리페놀 함량 및 quercetin 함량)는 다음과 같 은 2차 회귀식으로 나타내었으며, β0는 상수이고, βi, βii, βij는 회귀계수이다.

 __{  }









통계처리는 SAS ver. 9.4(SAS Institute, Cary, NC, USA) 소프트웨어를 사용하였다. 반응표면도는 Minitab ver.

14.12(Minitab Inc., State College, PA, USA)를 사용하였다.

모델의 적합성을 회귀계수(R²)를 분석하여 평가하였다. 데이 터 간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA의 Duncan’s multiple range test를 통해

P

결과 및 고찰

모델의 적합성

본 연구에서는 양파껍질로부터 항산화력, 총 폴리페놀 함 량 및 quercetin의 최적 추출 조건을 설정하기 위해 에탄올 농도(40∼80%), 추출시간(10∼50분), 초음파 세기(150∼

250 W)를 독립변수로 설정하였다. Box-Behnken design 에 의해 설계된 15구간의 추출 조건에서 얻어진 종속변수의 결과는 Table 1과 같다. 추출 조건에 따른 최댓값은 각각 DPPH 라디칼 소거능 38.1 TE mg/g, ABTS 라디칼 소거능 77.8 TE mg/g, 총 폴리페놀 함량 76.3 GAE mg/g 및 quer- cetin 함량 2.6 mg/g으로 나타났다. 4가지 종속변수 모두 에탄올 농도 80%, 추출시간 10분, 초음파 세기 200 W에서

최솟값을 보였다.

2차 회귀식에 대한 상수 및 회귀계수는 Table 2에 나타내 었다. 회귀분석 결과를 바탕으로 종속변수인 항산화력, 총 폴리페놀 함량 및 quercetin의 모델식이 적합한지 평가하였 다(Table 3). 종속변수로서 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함 량의 모델이 유의적이었고 R²은 0.9 이상으로 유의성을 보 였다. 적합성 결여 검정(lack of fit)은 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 및 총 폴리페놀 함량에 대해

P

P

0.1)인 결과를 보여 반응표면모형이 적합하지 않았다.

추출 조건이 항산화 성분 및 활성에 미치는 영향

P

P

P

0.05 및

P

최적 추출 조건의 검증 및 추출법 비교

양파껍질로부터 다양한 활성성분을 보다 효율적으로 추

Table 3. Analysis of variance for extraction variables as linear, quadratic term and interactions on response variables

DPPH radical

scavenging activity ABTS radical

scavenging activity TPC Quercetin

Sum of

square F value Sum of

square F value Sum of

square F value Sum of

square F value Model

Linear Quadratic Cross product Lack of fit R²

9 3 3 3 3

349.55^***

209.31^***

134.86^***

5.39^* 1.65

0.9947

104.59 187.89 121.06 4.84 5.32

344.16^***

223.87^***

110.01^***

10.28 8.33 0.9734

20.30 39.61 19.46 1.82 5.11

549.94^**

436.70^***

94.65^* 18.59 29.18 0.9391

8.57 20.41 4.42 0.87 3.00

0.54 0.24 0.28 0.02 0.13^* 0.8019

2.25 2.95 3.52 0.28 12.75

R²＝coefficient of determination.

Significant at ^***

P<0.01,

P<0.05,

P<0.1.

Table 4. Analysis of variance showing significance of the variables on responses

Sum of square DPPH radical

scavenging activity ABTS radical

scavenging activity TPC Quercetin Ethanol concentration

Time Power

4 4 4

324.87^***

29.49^***

4.1

280.61^***

66.61^**

20.68

415.37^***

127.02^* 35.57

0.34 0.12 0.11 Significant at ^***

P<0.01,

P<0.05,

P<0.1.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

(G) (H) (I)

Fig. 1. Response surface plots for DPPH radical scavenging activity (A∼C), ABTS radical scavenging activity (D∼F), and total

출하기 위한 최적 추출 조건은 에탄올 농도 56.8%, 추출시 간 36.4분, 초음파 세기 200.8 W였다. Table 5는 최적 추출 조건에서 얻어진 예측치와 그 조건에서 실제 실험에 의해

얻은 실측치를 비교하였다. 최적 추출 조건에서 예측된 값은 DPPH 라디칼 소거능 38.082 TE mg/g dw, ABTS 라디칼 소거능 77.818 TE mg/g dw 및 TPC 76.027 GAE mg/g

Table 5. DPPH and ABTS radical scavenging activities, and TPC of onion peel extract by optimization condition of UAE

Responses Predicted value Experimental value MAE

DPPH radical scavenging activity (TE mg/g dw) ABTS radical scavenging activity (TE mg/g dw) TPC (GAE mg/g dw)

38.082^a 77.818^a 76.027^a

38.367^a 76.592^a 73.543^a

35.331^b 65.901^b 51.268^b Predicted values were calculated from optimum condition of ridge analysis.

Experimental values were obtained using 56.8% ethanol, 36.4 min and 200.8 W.

UAE: ultrasound-assisted extraction, MAE: maceration extraction.

Different letters (a,b) within the same row indicate a significant difference at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

dw였다. 실측치는 DPPH 라디칼 소거능 38.367 TE mg/g dw, ABTS 라디칼 소거능 76.592 TE mg/g dw 및 TPC 73.543 GAE mg/g dw로 유의적인 차이는 없었으며 예측값 의 신뢰성을 뒷받침하였다.

최적화된 초음파 추출 조건을 이용하여 초음파 추출과 침 용 추출을 비교하였다. Table 5에 나타낸 바와 같이 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 및 TPC 모두 유의적 인 차이로 최적화된 초음파 추출법이 우수한 결과를 보였다.

초음파 추출은 침용 추출에 비해 총 폴리페놀 함량이 1.43 배, ABTS 라디칼 소거능 1.16배 및 DPPH 라디칼 소거능 1.09배 높은 함량을 보였다. 이는 같은 시간 대비 초음파 추출이 양파껍질 추출공정에서 효과적인 방법임을 알 수 있 다. 초음파의 cavitation 현상으로 인해 식물세포벽을 붕괴 하여 양파껍질로부터 유기화합물의 방출을 증가시킨 것으 로 보인다. Ali 등(2018)은

Piper betle

Limonium sinuatum

요 약

본 연구는 초음파를 이용하여 양파의 부산물인 양파껍질의 추출 조건을 최적화하고 추출물의 항산화 성분과 항산화 활 성을 측정하였다. Box-Behnken design에 따라 추출 조건 의 독립변수인 에탄올 농도(X1, %), 추출시간(X2, 분) 및 초 음파 세기(X3, W)에 따라 항산화 활성(DPPH 및 ABTS 라디 칼 소거능), 총 폴리페놀 및 quercetin 함량을 종속변수로 설정하여 이들의 값을 최대로 하는 공통의 조건을 예측하였 다. 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량에 대한 모델식의 R²은 0.9 이상으로 적합하였으며, quercetin 함량에 대한 반응표 면모형은 적합하지 않은 것으로 나타났다. 추출 조건으로 에탄올 농도와 추출시간은 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량 에 유의적인 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 최적 추출 조건 인 에탄올 농도 56.8%, 추출시간 36.4분 및 초음파 세기 200.8 W에서 제조한 추출물의 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량의 실측치는 예측치와 매우 유사한 값을 나타내었다.

최적 추출 조건에서 진행한 초음파 추출물을 침용 추출물과

비교 분석한 결과 유의적으로 초음파 추출물의 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량이 높았다.

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