Validation of the Analytical Method for Chlorogenic Acid in Blueberry Yeast Fermented Powder for Standardization as a Functional Health Ingredient

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블루베리 효모 발효 분말의 기능성 원료 표준화를 위한 지표성분으로서 Chlorogenic Acid 분석 및 검증

정수지․양희종․류명선․서지원․정도연 (재)발효미생물산업진흥원

Validation of the Analytical Method for Chlorogenic Acid in Blueberry Yeast Fermented Powder for Standardization as a Functional Health Ingredient

Su-Ji Jeong, Hee-Jong Yang, Myeong Seon Ryu, Ji Won Seo, and Do-Youn Jeong Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI)

ABSTRACT This study validated an analytical method for chlorogenic acid in blueberry yeast fermented powder (BYFP) for standardization as a functional health ingredient. Measurements of the yield according to the concentration of the extraction solvent for analyzing the level chlorogenic acid before validation showed that the extraction yield was highest at 2,040.14 µg/mL when extracted with 50% ethanol. The quantitative determination method of chlorogenic acid was optimized by HPLC analysis using a Capcellpak-C18 column with a gradient elution of 1% acetic acid in water and acetonitrile. This method was validated according to the specificity, linearity, accuracy, precision test, and recovery test. The method showed reliable linearity of the calibration curve with a R

²

of 0.9999, and the limit of quantitation and the detection limit were 5.38 µg/mL and 16.32 µg/mL, respectively. The relative standard deviation (RSD) from the intra- and inter-day precision according to the chlorogenic acid concentration ranged from 1.34 to 2.5% and 0.92 to 2.17%, respectively. The recovery test ranged from 103.03% to 103.36% with RSD values from 0.83 to 1.22%. Therefore, chlorogenic acid as a marker compound in BYFP was analyzed. The amount of chlorogenic acid in BYFP was approximately 2,032.66 µg/mL after triplicate analysis, and the RSD was 0.58% using the validated method. These results suggest that the method is very useful for evaluating the marker compounds in BYFP to develop a health functional food material.

Key words: blueberry, blueberry yeast fermented powder, chlorogenic acid, functional health ingredient, validation

Received 17 July 2019; Accepted 29 September 2019

Corresponding author: Do-Youn Jeong, Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI), Sunchang, Jeonbuk 56048, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-63-653-9579

서 론

블루베리는 북아메리카 원산의

Vaccinium

속 관목성 작 물로 동남아시아에 주로 약 400여종의 품종이 분포하고 있 으며, 2002년 타임지 선정 세계 10대 슈퍼 푸드로 생체 조절 기능을 수행하는 생리활성 물질을 함유하고 있어 특정 퇴행 성 질환 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Jeong 등, 2012). 특히 블루베리 색소인 anthocyanin은 수용성 물질로 체내 흡수 시 부작용이 없으며, 항암(Liu 등, 2016) 및 항산 화(Prior 등, 1998) 효과가 탁월한 것으로 보고되어 소비자 들에게 건강기능식품으로서의 가치를 인정받으면서 그 수 요량이 급격하게 증가하고 있다. 또한 블루베리에는 대중적 으로 알려진 anthocyanin 이외에도 항알레르기성, 항암, 항 고혈압, 항염증, 항균 및 항산화 효과(Cho 등, 2017)와 혈소 판 응집 억제, 심혈관 질환 및 알츠하이머에 의한 뇌손상

예방(Havsteen, 1983) 등의 역할을 수행하는 폴리페놀 화 합물이 함유되어 있고, 특히 caffeic acid와 quinic acid의 es- ter 결합으로 형성된 폴리페놀 화합물의 한 종류인 chlorogenic acid가 과량 함유되어 있다.

Chlorogenic acid는 쌍자엽 식물의 잎이나 과실에 다량 으로 들어있는 화합물로, 특히 커피 콩, 사과, 배, 블루베리 와 같은 과실과 토마토, 고구마, 우엉, 감자, 땅콩, 가지 등과 같은 채소에 다량 함유되어 있다(Chung 등, 2011). 폴리페 놀 화합물인 chlorogenic acid는

in vitro

시험에서 HSC- T6 세포에서 collagen Ⅰ과 TIMP-1의 발현을 활성화해 산화 스트레스 억제를 통한 간질환에 대한 보호 효과가 있는 것으로 보고되었고(Shi 등, 2016), 특히 활성산소나 발암성 물질에 의한 DNA 손상으로 세포 돌연변이를 유발하게 되며 심할 경우 암세포로 변형되게 하는 물질의 하나인 8-hy- droxydeoxyguanosine의 생성을 채소나 과일에 함유된 chlorogenic acid가 억제한다고 보고되었다(Kasai 등, 2000).

또한 산화적 손상의 원인으로 발병하는 암이나 심혈관 질환 예방 효과(Rice-Evan 등, 1996) 및 당뇨병이 유발된 동물 모델에서 혈당 저하효과와 지질 개선 효과(Lee 등, 2012)

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Table 1. Analytical conditions of HPLC analysis for chlorogenic

acid

Parameters Conditions Column

Flow rate Injection volume UV detection Run time

Capcellpak-C18 (4.6×150 mm, 5 µm, Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) 0.4 mL/min

10 µL 330 nm 45 min

Gradient

Time (min) % A¹⁾ % B²⁾ 0

25 30 32 39 40 42

5 20 25 100 100 5 5

95 80 75 0 0 95 95

1)1% acetic acid in acetonitrile.

2)1% acetic acid in water.

등

in vivo

실험에서도 다양한 연구 결과가 보고되어 건강촉 진 물질로 chlorogenic acid의 기능성에 대한 연구와 관심 이 점차 증가하고 있는 추세이다.

인류가 오래전부터 제빵, 와인 및 맥주와 같은 발효 주류 산업 등에 주로 이용해왔던 효모인

Saccharomyces cer- evisiae

는 인체에 무해한 GRAS(generally regarded as safe) 균주로 헥산, 효소, 단백질, 지질, 미네랄 등의 원료로 사용되어 왔고(Lee 등, 2009), 다양한 생리활성 물질 생산 에 관한 연구를 통해 항치매 β-secretase 저해물질(Lee 등, 2007), 항고혈압성 안지오텐신 전환효소 저해물질(Kim 등, 2011), 항혈전용해 활성물질(Jang 등, 2011) 등의 다양한 생리 기능성 물질을 생성하여 건강식품의 공급원으로 사용 되고 있다. 건강기능식품은 섭취 시 인체 내 영양소 균형 조 절 및 생리작용 개선 등의 건강에 도움이 되는 목적으로 인 체에 유용한 기능성을 갖는 원료 또는 성분을 이용한 정제, 분말, 캡슐, 과립, 액상, 환 등의 형상으로 제조 가공된 식품 을 의미하며, 최근 한국인의 식습관 및 생활습관의 서구화로 당뇨, 고혈압, 신장질환, 고지혈증, 간질환 등과 같은 만성질 환의 발병률이 크게 증가하고 있어(Lee와 Park, 2016), 이 를 예방하기 위한 목적으로 효과가 검증된 기능성 소재에 대한 소비자 관심의 증가로 수요가 급증하고 있다. 일반적으 로 기능성 이외 건강기능식품 개발 및 생산 시 가장 중요한 부분을 차지하는 범위는 원료 표준화와 규격 두 부분으로 나뉘며, 원료 표준화는 제조 과정 중 목표로 설정한 기능성 물질의 농도가 원재료에서 최종 제품까지 제조되면서 손실 을 최소화하기 위한 우수제조 공정 규범을 말하며, 일반적으 로 지표성분 표준화 방법이 많이 사용되고 있다. 지표 물질 은 천연물에 존재하며 원료 표준화를 위해 설정되는 물질로 원료의 사용 여부 확인 및 제조공정 표준화를 관리하기 위한 물질로 특이성, 대표성, 안정성, 분석기술의 용이성, 시간과 비용 측면의 고려를 통하여 표준화를 수행하여야 한다(Jeon 등, 2011).

본 연구진은 순창군에서 계약 재배되는 블루베리를 국내 과실 유래 효모를 이용하여 발효하였으며, 해당 소재에 대한 기능성 연구를 통해 cyclophosphamide 처리로 유도된 면 역저하 모델에서 블루베리 효모 발효 분말의 면역증강 효과 를 확인하여(Jeong 등, 2019), 블루베리 효모 발효 분말의 천연물 유래 면역증강제로서의 소재 개발 가능성을 확인하 였다. 따라서 건강 기능성 식품 개별 인정형 소재를 개발하 기 위한 목적으로 블루베리 효모 발효 분말의 지표성분으로 chlorogenic acid를 선정하였으며, 최적의 추출 용매의 농 도 확립과 HPLC 방법을 이용한 지표성분의 분석법의 유효 성을 검증하고 분석법을 바탕으로 블루베리 효모 발효 분말 내 지표성분의 함량을 분석하였다.

재료 및 방법

재료 및 시약

블루베리는 전라북도 순창군에서 2018년도에 재배 및 수 확한 블루베리를 구입하여 사용하였고, 블루베리 발효를 위 한 효모는 (재)발효미생물산업진흥원에서 보유하고 있는

Saccharomyces cerevisiae

SRCM100936(KCCM12244P) 을 사용하였다. 블루베리 효모 발효물 제조를 위하여 YPD 액체 배지(Difco^TM, Detroit, MI, USA)에 SRCM100936을 접종하고 30°C, 150 rpm에서 2일간 배양한 후 10,000 rpm 에서 30분간 원심분리 하여 균체를 회수하였다. 회수한 균 체를 멸균 증류수로 3회 세척하고 발효를 위한 스타터로 사 용하였다. 원재료인 블루베리 과실을 파쇄하고 85°C에서 45분간 살균한 후 앞서 준비한 종균 스타터 10%(1.0×10⁸ CFU/mL, OD_{(600 nm)} 4.0)를 접종하여 25°C에서 4일간 정치 발효한 후 100°C에서 30분간 가열하여 효모를 불활성화한 시료를 동결 건조하여 지표성분 분석을 위한 블루베리 효모 발효 분말(BYFP, blueberry yeast fermented powder)로 사용하였다.

지표성분 분석을 위해 사용된 chlorogenic acid 표준품은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하 였으며, 실험에 사용된 모든 용매는 특급으로 Wako Pure Chemical Co.(Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.

표준용액의 조제: Chlorogenic acid 검량선 작성을 위한 표준품은 50% 에탄올에 녹여 1 mg/mL가 되도록 제조한 후 단계적으로 희석하여 500, 250, 125, 62.5, 31.25 μg/mL로 조제하여 사용하였다. 표준품의 함량을 구하기 위하여 표준 용액의 크로마토그램에서 얻은 피크의 농도별 면적에 대한 검량선을 작성하였다.

Chlorogenic acid의 HPLC 분석

블루베리 효모 발효 분말의 chlorogenic acid 함량 분석 을 위한 HPLC 조건은 Table 1과 같다. HPLC 분석을 위한 컬럼은 Capcellpak-C18(4.6×150 mm, 5 μm, Shiseido

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Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하였으며, HPLC는 pump, autosampler, column oven, diode array UV/VIS detector (Agilent 1200 series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 용매 A는 1% acetic acid(in acetonitrile), 용매 B는 1% acetic acid(in water)를 사용하였 으며, 모든 용매는 사용 전 탈기 및 필터로 여과한 후 사용하 였다. 컬럼의 유속은 0.4 mL/min으로 UV 330 nm 파장에서 측정하였으며, 시료는 10 μL를 주입하였다.

Chlorogenic acid 추출 조건 확립

블루베리 효모 발효 분말의 chlorogenic acid 함량 측정 을 위한 분말 시료로부터 추출 용매의 농도에 따른 최적의 추출 방법을 확립하기 위하여 에탄올 농도 조건을 달리한 후 각각의 농도에 따른 추출 특성을 확인하였다. 블루베리 효모 발효 분말은 0, 25, 50 ,75, 100%의 에탄올 농도에서 2회 추출하였으며, 추출 방법은 시료 0.5 g에 25 mL의 농도 별 에탄올을 가하고 실온에서 30분간 초음파 처리(40 kHz, Bransonic series CPX5800H-E, Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)한 후 8,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상등액을 취하였다. 잔사는 동일한 방법으로 1회 반복 추출한 다음 상등액을 50 mL로 정용한 후 0.45 µm syringe filter로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 각 각의 시료는 앞서 제시한 HPLC 분석법으로 측정하였으며, 모든 시료는 3회 반복하여 분석하였다.

지표성분 시험법의 검증(method validation)

블루베리 효모 발효 분말의 분석방법 확립을 위한 검증은

‘의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인(식품의 약품안전처)’을 참고(Korea Food and Drug Administra- tion, 2015)하여, 지표 성분에 대한 특이성(specificity), 직 선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision) 및 회수율(recovery) 분석을 통하여 시험법 검증을 실시하였다.

특이성(specificity): 앞서 준비한 chlorogenic acid 농 도별 용액과 블루베리 효모 발효 분말을 전처리 후 HPLC를 이용하여 분석하고, 크로마토그램의 retention time과 chlorogenic acid peak가 분리되는지 확인하였으며, diode array detector(DAD) system을 이용하여 동일한 spectrum 을 나타내는지를 확인하였다.

직선성(linearity), 정량한계(limit of quantitation) 및 검출한계(detection limit): Chlorogenic acid 표준용액 1 mg/mL를 조제하여 50% 에탄올로 단계 희석하여 31.25~

500 µg/mL의 각 시료를 HPLC로 분석한 후 농도에 대한 peak 면적에 대하여 검량선을 작성하고 상관계수(R²) 값을 확인하였다. 작성된 표준검량선으로부터 각 농도별 peak의 신호 대 잡음비(signal to noise, S/N)를 구하여 S/N비가 3.3일 때 검출한계, S/N비가 10이 될 때 정량한계로 계산하 였다.

정확성(accuracy): 블루베리 효모 발효 분말을 일내 분

석(intra-day)과 일간 분석(inter-day)의 변이성을 측정하 여 시험법에 대한 정확성을 확인하였다. 표준용액 chlorogenic acid를 저농도(low quality control, LQC, 50 µg/

mL), 중농도(medium quality control, LQC, 150 µg/mL), 고농도(high quality control, LQC, 300 µg/mL)로 조제하 여 intra-day와 inter-day에서 HPLC 분석의 재현성을 확 인하였다. 정확성은 조제한 각 농도의 표준용액을 3회 반복 분석하여 결과 값이 참값에 근접한 백분율로 나타내었다.

Intra-day의 정확성은 하루 동안 표준용액을 1일 3구간에 서 분석하였으며, inter-day의 정확성은 intra-day의 과정 을 3일 동안 반복 분석하여 그 변이성을 측정하였다. 각 시험 은 각각의 구간마다 3회 반복하여 HPLC 분석을 수행하였 고, 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 표 준편차를 평균으로 나누어 백분율로 계산하였다.

정밀성(precision) 및 회수율(recovery): 정밀성은 50, 150, 300 µg/mL 농도의 chlorogenic acid 표준용액을 각각 6회 반복하여 측정 후 상대표준편차를 측정하였다. 회수율 은 3가지 농도의 표준용액을 6회 반복 시험 후 얻은 peak의 면적을 표준용액의 peak 면적과 비교하여 회수되는 정도를 확인하였고, 백분율로 계산하여 회수율을 구하였다.

제조 공정별 블루베리 효모 발효 분말 내 chlorogenic acid 함량 분석

순창산 블루베리와 효모를 이용하여 발효한 블루베리 효 모 발효 분말의 제조 공정별 chlorogenic acid 함량을 확인 하기 위하여 3 lot의 블루베리 동결 건조 분말(원재료)과 블 루베리 효모 발효액 동결 건조 분말(효모 불활성화 이전의 발효 종료 시료), 블루베리 효모 발효 분말(최종 산물)을 앞 서 확립한 추출 조건에 따라 동일하게 추출하여 농도를 산출 하였다.

통계처리

모든 분석의 통계 처리는 엑셀프로그램을 이용하여 수행 하였다.

결과 및 고찰

용매별 chlorogenic acid 추출 특성

기능성 소재에 대한 관심과 활용 범위를 확대하고자 하는 연구가 다양하게 수행되고 있어, 이에 수반되는 과학적 표준 화가 필수적 요건으로 자리 잡고 있으며, 소재에 따른 추출 방법 및 기능성 등에 대한 과학적 자료의 확보가 무엇보다도 중요시되고 있다. 특히 chlorogenic acid와 같은 폴리페놀 류와 플라보노이드는 일반적으로 소재의 종류, 성분의 종류 및 추출조건 등에 따라 추출 효율에 영향을 주며, 따라서 시료에 맞는 적당한 추출방법의 중요성이 부각되고 있다 (Kwak 등, 2003). 따라서 블루베리 효모 발효 분말의 지표 성분 분석을 위한 추출 용매 조건을 조사하기 위해 추출 용

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Fig. 1. DAD (Diode array detector)

spectrums of chlorogenic acid in Standard (A) and blueberry yeast fermented powder sample (B).

Table 2. Content of chlorogenic acid extracted by different sol-

vent ratio (ethanol/water, v/v)

Ethanol (v/v, %) Chlorogenic acid (µg/mL) 0

25 50 75 100

1,956.65±1.07^a 1,962.07±1.78^a 2,040.14±14.59^b 1,192.93±13.50^c 602.96±4.65^d

Each value is presented as mean±SD. Means within a measure- ment with different letters were significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

매로 물과 에탄올의 농도에 따른 chlorogenic acid의 함량 을 측정하였다. 용매 농도별 추출 수율을 조사한 결과 블루 베리 효모 발효 분말을 100% 물로 추출 시 chlorogenic acid 함량은 1,956.65 µg/mL로 검출되었으며, 50% 에탄올 로 추출하였을 때 2,040.14 µg/mL로 최대 함량을 나타내어 인진쑥 추출물을 50%로 에탄올로 추출하였을 때 최대 추출 수율을 나타낸 결과와 동일한 결과를 얻었다(Kim, 2014).

하지만 50% 이상의 에탄올로 추출하였을 경우에는 농도에 의존적으로 급격하게 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 이 는 배박 추출물에서 용매별 추출 조건 시험 결과 에탄올 농 도가 증가할수록 chlorogenic acid 추출 수율이 향상되었다 는 결과와는 다른 양상을 나타내었으며(Cho 등, 2015), 오 가피의 경우 75% 에탄올 추출(Im 등, 2008), 울릉도 미역취 에서는 10% 에탄올에서 최대수율(Ji 등, 2019)을 나타내는 것으로 보고되고 있어 측정하고자 하는 소재와 추출 용매의 농도에 따라 chlorogenic acid의 추출 수율에 영향을 받는 것을 확인하였으며, 블루베리 효모 발효 분말의 경우 지표성 분 chlorogenic acid의 추출은 50% 에탄올로 추출 시 가장 효과적임을 확인하였다.

특이성 확인

특이성 시험은 불순물 및 배합 성분 등의 혼재 상태에서 chlorogenic acid를 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는지 를 확인하기 위한 시험으로 표준품이 다른 물질의 간섭 없이

성분이 분리되는지를 확인하였다. 블루베리 효모 발효 분말 에서 검출된 chromatogram이 표준용액인 chlorogenic acid 와 동일한지 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액의 spec- trum을 확인하였다. 시험용액의 chlorogenic acid peak의 purity를 확인하기 위하여 약 18분대 검출된 peak의 spec- trum을 확인한 결과 330 nm에서 최대 흡광도를 보였으며, 표준용액과 시험용액에서 동일한 패턴의 spectrum을 나타 냄을 확인하였다(Fig. 1). 따라서 chlorogenic acid의 최대 흡수파장인 330 nm에서 HPLC를 이용하여 표준용액에서 chlorogenic acid와 블루베리 효모 발효 분말에서의 크로마 토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 확인한 결과, 머무름 시간이 Fig. 2와 같이 18.5분대로 동일하여 peak 머무름 시간이 같은 것으로 확인되었다.

직선성, 검출한계 및 정량한계

검체 중 일정 농도 범위에 있는 chlorogenic acid의 양에 대하여 직선적인 측정값을 얻을 수 있는지에 대한 검증 시험 으로 chlorogenic acid 표준원액을 31.25~500 µg/mL로 단계적 희석하여 직선성 및 검출한계와 정량한계를 측정하 였다. Chlorogenic acid의 검량선의 R²이 0.9999로 높은 직선성을 보였으며, S/N비에 의한 검출한계는 5.38 µg/mL, 정량한계는 16.32 µg/mL 수준으로 나타났다. 따라서 본 실 험을 통해 블루베리 효모 발효 분말의 표준화를 위해 설정된 지표성분 chlorogenic acid의 분석을 위한 검출한계와 정량 한계를 검출한 것으로 충분히 본 연구에서의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

정확성, 정밀성 및 회수율

Chlorogenic acid의 실험 결과가 참값이나 표준값에 근 접한 정도를 측정하여 정확도를 확인하였다. 정확성 결과는 Table 3과 같이 chlorogenic acid의 intra-day 분석에서는 95.18±1.34~101.02±1.55%, inter-day 분석에서는 96.23

±2.17~100.83±1.54%로 측정되었다. 정밀성 분석의 경우 이미 알고 있는 농도의 chlorogenic acid 표준용액을 검체

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A

B

C

Fig. 2. HPLC chromatograms of (A) blank, (B) chlorogenic acid standard solution, and (C) blueberry yeast fermented powder (BYFP).

Table 3. Intra-day and inter-day accuracy of chlorogenic acid

analysis

Nominal concentration

(µg/mL)

Mean measured concentration

(µg/mL)

Accuracy (%) RSD¹⁾

(%) Intra-

day

50 150 300

47.59 151.32 303.05

95.18 100.88 101.02

1.34 2.5 1.55 Inter-

day

50 150 300

48.11 151.24 302.48

96.23 100.82 100.83

2.17 0.92 1.54

1)Relative standard deviation.

Table 4. Precision of chlorogenic acid analysis

Nominal

concentration (µg/mL)

Mean measured concentration

(µg/mL) SD Recovery (%) RSD¹⁾

(%) 50

150 300

51.52 155.03 309.99

0.63 1.67 2.57

103.03 103.36 103.33

1.22 1.08 0.83

Table 5. Comparison of chlorogenic acid according to fermented

process

Process Mean (µg/mL) SD RSD⁴⁾ (%) Sample 1¹⁾

Sample 2²⁾ Sample 3³⁾

534.33 1,696.11 2,032.66

3.3829 4.7466 11.7543

0.63 0.28 0.58

1)Blueberry powder extract (raw material).

2)Blueberry yeast fermented powder extract before deactivation of yeast.

3)Blueberry yeast fermented powder extract (final product).

에 넣은 후 측정하였으며, 세 농도를 각각 6회 반복 후 얻어 진 시료 면적을 검량선에 근거하여 회수되는 양을 백분율로 계산하였다. Table 4와 같이 chlorogenic acid의 표준품 회수율은 103.03~103.36%로, RSD는 0.83~1.22%로 나 타났으며, 50 µg/mL에서는 103.03%, 150 µg/mL에서는 103.36%, 300 µg/mL에서는 103.33%의 회수율로 측정되 었다. 지표성분으로서 chlorogenic acid에 대한 분석방법 벨리데이션에 대한 선행 보고로는 Pellati 등(2004)의 연구 에서는 R²은 0.9999 이상으로 96.56~103.83%의 회수율을 얻었으며, RSD는 3% 이내로 보고되었다. Cho 등(2015)의

배박 추출물의 chlorogenic acid의 HPLC 벨리데이션 분석 결과 R²은 0.9999 이상, 97.33~105.68%의 회수율을 얻었 고, RSD는 2.84% 이내로 보고하여, 본 실험을 통한 블루베 리 효모 발효 분말의 chlorogenic acid의 분석 결과와 유사 하였으며, 상대적으로 본 연구의 정밀성 결과가 RSD의 근거 하여 더 양호하다고 판단하였다.

제조 공정별 블루베리 효모 발효 분말 내 chlorogenic acid 함량

본 시험법의 검증과정을 통하여 chlorogenic acid에 대한 상기 HPLC 분석법이 기능성 원료 인증을 위한 블루베리 효모 발효 분말 내의 chlorogenic acid 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다. 검증된 분석법으로 블루베리 효모 발 효 분말 제조 공정별 chlorogenic acid 함량은 최종산물의 제조 공정 중 블루베리 원액, 블루베리 효모발효액 및 블루 베리 효모발효 분말 등의 세 공정을 분석하여 확인하였다.

그 결과 공정별 chlorogenic acid 함량은 블루베리 원액을 동결 건조한 분말 추출액에서 534.33 µg/mL를 나타내었고,

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블루베리 효모 발효액 분말에서는 1,696.11 µg/mL로 효모 발효를 통해 chlorogenic acid 함량이 약 3.17배 증가한 것 을 알 수 있었다. 최종 산물인 효모 균주 불활성화 블루베리 효모 발효 분말의 chlorogenic acid 함량을 측정한 결과는 2,032.66 µg/mL를 나타내어 기존 원물 대비 효모를 이용하 여 발효한 결과 chlorogenic acid 함량 증가를 도모하였다.

최종 산물인 블루베리 효모 발효 분말의 chlorogenic acid 함량의 평균은 2,032.66 µg/mL, 기준값은 2,032.66 µg/mL 의 80~120%로 기준 규격을 설정하였을 때(Korea Food and Drug Administration, 2008) 함량은 1,626.13~2,439.19 µg/mL였다(Table 5).

요 약

블루베리 효모 발효 분말의 개별 인정형 건강기능식품 기능 성 원료로 개발하기 위하여 지표성분 표준화를 위한 chlorogenic acid의 분석법 설정과 분석법에 대한 벨리데이션을 실시하였다. 벨리데이션에 앞서 chlorogenic acid의 분석을 위한 추출 용매의 농도별 수율을 조사한 결과 50% 에탄올로 추출 시 2,040.14 µg/mL로 가장 우수한 수율을 나타내어 추출 용매의 농도를 확립하였다. Chlorogenic acid의 분석 은 1% acetic acid가 첨가된 water와 acetonitrile을 이동 상으로 하고 Capcellpak-C18(4.6×150 mm, 5 μm) 컬럼을 사용하여 기울기 용리(gradient elution) 방법으로 분석하 였다. 본 연구에서는 분석법에 대한 특이성, 직선성, 정확성 과 정밀성 및 회수율을 확인하였다. Chlorogenic acid의 검 량선은 상관계수(R²)가 0.9999로 우수한 직선성을 보였으 며, 검출한계와 정량한계는 각각 5.38 µg/mL, 16.32 µg/mL 로 나타났다. 시료 농도별 intra-day 및 inter-day 분석에서 의 상대표준편차(RSD)는 각각 1.34~2.5%, 0.92~2.17%로 나왔다. 회수율 측정 결과에서는 103.03~103.36%로 나왔으 며, RSD는 0.83~1.22%였다. 따라서 HPLC를 이용한 chlorogenic acid의 분석법이 블루베리 효모 발효 분말의 기능 성 원료 표준화를 위한 지표성분 분석의 적합한 시험법임을 검증하였다. 또한 본 시험법에 따라 제조 공정별 블루베리 효모 발효 분말 내의 chlorogenic acid 함량을 측정하였으 며, 최종 산물인 블루베리 효모 발효 분말의 chlorogenic acid 함량을 세 lot를 3회 분석하였을 때 2,032.66 µg/mL가 나왔으며, RSD 값은 0.58%로 확인되었다. 따라서 본 연구 를 통해 확립한 분석법이 블루베리 효모 발효 분말의 개별인 정형 건강기능식품 기능성 원료 개발을 위한 기초 자료로 활용될 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 순창군 향토건강식품명품화사업의 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

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