Isolation and Identification of Streptomyces aburabiensis Producing Cathepsin B Inhibitor

약학회지 제39권 제 3 호 2 9 7 305(1995) Yakhak Hoeji V o l.39. N o .3

Cathepsin B

^{저해물질을 생산하는}

Streptomyces aburabiensis9]

분리 및 동정

박상진

이현숙

김인섬

김형태

윤성준

이계준

(Received April 28. 1995)

Isolation and Identification of Streptomyces aburabiensis

Producing Cathepsin B Inhibitor

S a n g J i n P a rk , H y u n soo k Lee, In Seop K im , H y o u n g T ae K im , S u n g J o o n Y oon * a n d Kye J o o n Lee*

Department of Microbiology, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea

^Central research Center, Dong Wha Pharmaceutical Co. Ltd,

Abstract - The a im o f th e p re se n t s tu d y w a s to develop strain s o f a c tin o m y c e te s p r o d u c in g low m o le c u la r w e ig h t c a th e p s in B in h ib ito r. A m o n g 700 isolates from soil sa m p le s, a s tra in o f Streptomyces sp. SM F30 p r o d u c in g c a th e p s in B in h ib ito r sh o w in g specificity a n d h e a t sta b ility w a s selected b y a n e c o n o m ic a l a n d effective screen ing m e th o d . 50 u n its characteristics for m a jo r c lu ste r a n a ly s is a n d 34 u n its ch aracteristics for m in o r clu ste r were tested a n d th e d a ta w ere a n a ly z e d n u m e r ic a lly u s in g th e TAXON p ro gram . T he Isolate SM F30 w a s identified as a s tra in o f Streptomyces aburabiensis

Keywords □ C a th e p s in B in h ib ito r, A ctin om y cetes. Streptomyces aburabiensis.

방선균은 생리대사가 다양하여 매우 다양한 구조의 물질을 생산하며 단백질을 외부로 생산

분비하는 등 잇 점이 많아 산업적으로 이용하고자 하는 노력이 계속되 어 왔다

특히 방선균이 생산하는

차대사산물은 저분 자량외 물질이 많아 항생물질

항종양물질

항바이러스 물질

생리활성조절물질

면역조절물질 등으로 이용되 어 왔으며 최근에는 생체고분자물질생산에도 이용되고 있다

단백질 분해효소는 생체내의 여러 조절기작에 관여하 는데

일반적으로는 소화

체내단백질의 전환과 숙성

체외단백질의 분해

호르몬의 숙성

수정등에 사용되며

최근에 면역 반응의 조절

부종

혈액 응고

혈압 조절

암세포의 전이등에 관여한다는 것이 알려지면서 생체내 반옹 조절과 그 저해물질을 이용한 질병의 치료에 대한 관심이 커지고 있다

단백질 분해효소는 그 활성부위의

■본논문에 관한 문의는 이 저자에게로

구조에 따라

등

tinidin

등

그리고

nin, chym osin

등)로 나누어진다

C a th e p s in

은 동물외 비장

흉선

간

허파

척수

근 육 등에 존재하는 호산성

이다

소의 비장으로부터 처옴 발견된 이후 합성기질에 대한

반응기작과 존재 위 치에 따라 여러 종류

)가 발견되었다

)는

를 분해하며

등의 활성제를 필요로 한다

일반

적으로 비장에 가장 많이 존재하며

흉선

신장

간

허

파 등에서도 발견된다

는 근 육 실 조 , 암

세포전이

심근조직손상

골다공증

등에 관련이 있는

박상진•이현숙■김인섭•김형태■윤성준■이계준

것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또 염증이 발생하였을 때. 호중구(neutrophil)나 거식세포(macrophage), 비만세포(m ast cell) 등이 활성화되어 lysosomal enzyme들을 과잉 분비 함에 따 라 염중이 확산되는데 저해물질이 이틀 저해. 염증의 확 산을 방지하는 것으로 보고되었다 ®

본 연구에서는 이러한 병리작용을 억제할 수 있는 생 리활성물질로서 큰 외머를 지닐 수 있는 cathepsin B 외 저해물질을 얻기 위해 전국 각지의 토양시료를 채취, 적절한 전처리와 방선균 분리용 배지를 이용하여 방선 균만을 분리하였고, 생체내에서의 이용성과 안정성을 위하여 열과 p H 에 안정하고 다른 계열의 단백질분해효 소에는 비교적 작용하지 않는 저분자량의 저해물질을 생산하는 균주를 분리하고 이를 수리동정하였다.

실험방법

방선균의 분러

°C dry oven에서 30분간 열처리하였다. 이렇게 전처 리된 토양시료 1.0 금을 취하여 멸균 용기에 넣고 멸균된 식염수 10 m /와 10 띠의 tween 20을 가하여 30분간 잘 섞어주었다. 이를 적절히 희석한 후 , cyclo he xi mide(50 m g 1"')과 n y statin(50 mg r ')이 첨가된 각 중 방선균 분리용 배지에 점중하고 방선균의 colony가 생길 때까지 28°C에서 10-20일간 배양하였다. 형성된 colony를 멸균된 백금이로 따내어 Bennett/s 한천배 지에 접종하고 수차례 계대배양하였다.

배지 및 배양-방

방선균 분리주 동정

한 포자를 생리식염수에 세척, glycerol에 현탁시킨 액 을 접종원으로 사용하였다.®* 고체배양은 한천배지를 사 용하였으며, 액체배양은 baffled 폴라스크에 배지를 넣 어 회전 교반 배양기에서 시행하였다.

형태학적 특성분석

세포벽의

이성체와

no acid

분석

세포내 당분석

pyridine-toluene( 10：6 ：6 ： 1, containing \% ^acetic

acid)으로 전개하고 diphenylam ine 2 g-aniline 2 g- 85% phosphoric acid 10 m/-methanol 90 m /의 용 액으로 발색하여 Sigma사의 표준제품과 비교하였다,

증동정을 위한 특성분석 및

프로그램에 의 한 수리분석

주군집 (major cluster) 동정을 위한 50 단위형질 (unit characters)을 하였으며 . 부군집 (minor clust­

er) 동정을 위하여서는 34가지의 단위형질을 조사하였 다 . T AXON 프로그램은 영국의 Newcastle upon Tyne 대학 미생물학과의 S. A. W ard 박사에 외해 개 발된 프로그램으로써 단위형질의 특성을 + 흑은 -로

Cathepsin B 저해물질을 생산하는 Streptomyces aburabiensis의 분리 및 동정

간단하게 입력하고, 입력된 자료를 CLU STAN으로 분 석하여 수리분류할 수 있으며 수리분류 데이터를 기본 으로 하여 작성된 동정확률행렬 (id e n tifica tio n probability matrix) 의 특성과 미지균의 특성을 비교 분석하여 수리동정할 수 있다.

저해황성 측정

저해역가는 다옴과 같이 계산하였고 저해물질의 정량 은 1 나]VI의 product(cx-naphtylamine)을 생산하는 효소률 50% 저해하는 저해물질의 양을 1 u n it로 하였 다 .

저 해 역 가 (%) = A-B

A ^{1 0 0}

A ： Enzym e activity w ithout inhibitor B ： Enzyme activity w ith inhibitor

T rypsin(Sigm a)에 대한 저해역가 측정은 nitro- anilide 계열의 발색단을 가진 합성기질인 N-cc- ben zo y l~ D L - a rg in in e - p - n itro a n ilid e (B A P N A ； Sigm a)롤 이용하였고, buffer로는 10 m M Tris-HCl (Sigma)을 사용하였다.

결과 및 고찰

방선균의 분리 및

저해물질 생산 균주의 선별

■713개를 선별. 수 차례외 계대 배양을 통하여 순수 분리 하였다. 분리된 방선균들을 단백질분해효소 저해물질 생성액체배지에서 3일간 배양한 후 원심분리(5000 rpm, 1 0 m in .)하고 저분자량 저해물질을 생성하는 균 주를 선벌하기 위하여 그 상등액을 취하여 1 0 0°C에서

1 0분간 열처러한 다움 cathepsin B 에 대한 저해활성 을 조사하였다.

검색한 713개의 열처러된 배양액중 저해역가 90%

이상을 보인 49개외 배양을 1차로 선별하였고 다시 이 들중에서 1 0배 희석하였을 때에도 80% 이상의 저해역 가률 보이는 18균주를 선택하였다. 이 들중 , cysteine계 열 단백질분헤효소에 대한 특이성이 큰 저해물질생산균 을 선별하기 위하여 trypsin (serine protease 계열).

serratiopeptidase (metalloprotease 계열). pepsin (aspartic protease 계열) 등 과 , cathepsin B 와 같은 cysteine 계열 단백질분해효소인 p a p a in 에 대한 저해 역 가틀 조사하였다.

그 결과 SMF30 균주는 cathepsin B 에 높은 저해 역가(98.7% )를 보인 반면 다른 계열의 단백질분해효소 인 trypsin에 대해서는 낮은 저해 역 가 (5.6% )률 보였 고 serratiopeptidase. pepsin등에는 전혀 저해역가를 보이지 않아 비교적 대상효소에 대한 특이성이 컸으며 저해물질이 열처리와 유기용매추출에 안정하므로 저분 자량외 저해물질을 생산하는 것으로 관단되어 최종선별 하였다.

선택균주

의 형태적 톡

분리주 SM F30을 inorganic salts-starch 한천배지 (ISP4 배지)에서 7일간 배양한 후 전처리 과정을 거쳐 주사 전자현미경 (Stereoscan 260 S E M , Cam bri dge ltd, U.K.. X5.(XXH0.000)으로 조사하였다 (Fig. 1).

포자 사슬의 모앙은 분지 가 잘된 망사 모양으로 분절되 어 끝이 굽은 모양이었고 (hook). 포자 모양은 타원형 에 가까운 원형이었고 표면은 거친 모양 (spike)으로

300 박상진■이현숙•김인섭■김형태•윤성준■이계준

Fig. 1 ― Scanning electron micrograph of isolate SMF30.

관찰되었다.

분리주 SMF30의 속 동정 - 분러 주 SMF30을 stai- ch-casein-nitrate 한천에서 배양한 후 균체를 회수하 여 가수분해한 시료를 이용한 세포벽외 분석은 DAP (diam inopim elic acid) isomer 가 LL-DAP(LL -2.6-diaminopimelic acid) 형태이며. am ino acid는 glycine, glutamic acid, alanine등이 검줄되었고. 당 은 검출되지 않았다. 형태적인 톡정에서 포자가 형성되 었고 Streptoverticilium으] 톡징이 관찰되지 않았으며.

포자표면이 매끈하지 않고 거친 (spike) 모양으로 나타 났다. 또한. 세포벽 D A P isomer와 am ino acid를 조 사한 결과 세포벽외 peptide는 glycine으로 연결된

Table I ― Comparison of diagnostic characteristics among Sreptomyces, streptoverticillium, and isolate SMF 30

Characteristics Streptomyces Streptoverticillium SMF30

Colont size Discrete Discrete Discrete

Substrate mycelium + +

Spore + - +

Sproangia - - -

Motile spore - - -

Aerial mycelium + +

Chains of arthrospores + + +

Arthrospore in verticils - + -

Sproe surface smooth + + -

Sproe surface hairly. spiny, or warty + - +

Motile spores - - -

Sugar in hydrolysates Ara. gal. xyl DAP isomer in cell wall

LL-DAP + + +

meso-DAP -

■

^Symbol ： +. 90% or more of strains are positive 스-. 10% or less of strains are positive

AB

0 C

A B

Fig. 2 — Cellulose thin layer chromatography of cell wall diaminopimellic acid (DAP) isomers and amino acids (A) and whole cell sugar extract (B) of isolate SMF30.

A ： 1. Cell wall hydrolysate. 2. DAP isomers (A； LL-DAP, Meso-DAP. C： 3~0H DAP). 3. Glycine.

4. Glutamic acid. 5. Alanine

B ： 1. Whole cell extract, 2. Arabinose. 3. Galactose. 4. Glucose. 5. mannose

0.899400 0.098647 0.000015 0.001059 0.000309

peptidoglycan type A3y으로 . 세포벽이 I 형인 것으로 나타났으며, 세포내의 특징적인 당이 나타나지 않았으 므로 당성분 C 형에 해당하는 것으로 판명되었다(Fig.

2)/^* 따라서 . 분리주는 전형 적인 Streptomyces 속에 해 당하는 것임을 알 수 있었다(Table I).

3,

Characters in paremthesis is the code name for computer

Table III — Identification score of the Streptomyces sp.

SMF30 to the major cluster of Streptomyces by TAXON program

이 ^ 95% Probability j 크 단^ _ Clus- Taxon m * of strain 요.^

, J. , iaxon ^ ,, tification

ter distance further

radius _ score

aTvay (%)

TAXON

프로그램울 이용한 분리주의 종

주군접

에 의한

보다 높았다. 그러 나. 분리주 SM F30은 군집 1B에서의 Willcox 확률이 너무 낮 고 , taxon거리(taxon dis- tance)가 0.5041 로 95% taxon 반경 (taxon radius) 보다 상당히 크 며 . 시험 균주가 군집 1B에 속하는 다른 균주보다 군집중심 (cluster centroid)에 더 가까이 있 다고 히■는 % of probability of strain further aw ay 가 아주 낮온 것으로 미루어 이 군집의 최외각에 속하기 보다는 다른 군집에 속할 가능성 이 높은 것으로 관단되 었다. 따라서, 이 균주를 부군집으로서 재 동 정하 였 다.

Cathepsin B 저해물질을 생산하는 Streptomyces 외 분리 및 동정 301

Table 11 ― Major unit characters for the identification of Streptomyces sp. SMF30

1. Morphology and pigmentation.

rectiflexible (RFS) red (RED) red/orange (ROS) production (PIG) PYI 배 지 (MPI) Spore chain morphology

Color of spore mass Mycelial pigment Diffusible pigment Melanin production on

2. Antimicrobial activity.

Basillus subtilis (SUB) Candida albicans (ALB) Streptomyces murinus (MUR)

3. Biochemical tests.

Lecithinase (L E O Pectin hydrolysis (PEC) H

2

4. Degradation tests.

Elastin (ELA) Arbutin (ARB)

5. Antibiotic resistance.

Neomycin (NEO) Oleandomycin (OLE)

6. Growth test

45 "C (450 Sodium azide (OIZ) Potassium tellurite (OIT)

7. Com pound as sole source of nitrogen (0.1%, W/V).

DL-a-amino-n-butyric acid (BUT) L-Valine (VAL)

L-Histidine (HIS)

8. O rganic compounds as sole source of carbon (1% , W/V)

Sucrose (SUC) Mannitol (MAN) Raffinose (RAF) Adonitol (ADO) D-Melibiose (MEB)

+ + + + + + +

spiral (SPI) grey (GRY)

yellow/brown (YBP) tyrosine 배 지 (MTY)

Micrococcus luteus (LUT) Saccharomyces cerevisiae (CER) Aspergillus niger (NIG)

Lipolysis (LIP)

Nitrate reduction (NOS) Hippurate reduction (HIP)

Xantine (XAN)

Ripamficin (RIF) Penicillin G (PEN) NaCl (TOA) Phenol (PHN) Thallus acetate (TOD

L-Cysteine (CYS) L-Phenylalanine (PHE) L-Hydroxyproline (HYD)

meso-Inositol (INO) L-Rhamnose (RHA) D-Melizitose (MEZ) Dextran (DEX) Xylitol (XYT)

4 2 0 6 03 10 0 0

00 00 0

4 117 30 7 3 9 74 2 6^1^4 3^4

12 10 34 2 3 5 00 0 13 35 5 5 5 5

B 5 3 8 2

1

1

1

—1

_

박상진•이현숙•김인섬•김형태•윤성준• 이계준

Table IV ~ Minor unit characters for the identification of Streptomyces sp. SMF30.

1. M orphlogy and pigmentation.

Spore chain morphology, Color of spore mass Diffusible pigment

2. Antim icrobial activity.

Bacillus subtilis (SUB) Mirococcus leuteus (LUT) Streptomyces murinus (MUR)

3. Biochemical tests.

Pectin hydrolysis (PEC)

4. Degradation tests.

Guadine (GUA) Urea (URE)

5. Antibiotic resistance.

Rifampicin (RIF)

6. G row th tests.

45 X) (4 5 0

Potassium tellurite (OIT)

rectiflexible (RFS) grey (GRY) production (PIG)

+ +

Xylan (XYN) Xanthine (XAN) Penicillin G (PEN)

Phenol (PHN) Sodium azide (OIZ)

7. Com pound as a sole source of nitrogen (0.1%,W/V)

Potassium nitrate (POT) + L-Phenylalanine (PHE)

L-Histidine (HIS) +

8. O rganic compounds a

L-Arabinose (ARA) D-Lactose (LAC) myo-Inositol (INO) Sodium acetate (ACE) Sodium citrate(CIT)

+ +

+

sole source of carbon (1% , W/V).

- Raffinose (RAF) + D-Xylose (XYL) + D-Melibiose (MEB) + D-Fructose (FRU) + Sodium propionate (RPO)

+ + + +

spiral (SPI)

Elastin(ELA) Allantoine (ALL)

NaCl (7NA)

Sucrose (SUC) + Salicilin (SAL) + Mannitol (MAN) + L-Rhamnose (RHA) + Sodiumpyruvate(PYR) +

*Characters in parenthesis is the code name for computer

Table V— Identification score of the Streptomyces sp.

SMF30 to the minor cluster of Streptomyces by TAXON program.

Clus­

ter

Taxon distance

95%

Taxon radius

probability of strain

further away i%)

iden­

tification score

2 0.3828 0.3972 15.0009 0.999472

64 0.5150 0.3154 0.0000 0.000522

34 0.5484 0.4066 0.0000 0.000006

14 0.5501 0.2869 0.0000 0.000000

22 0.5501 0.2869 0.0000 0.000000

부군집

)에 의한 동정-분러주

3 0

의 부군집 형질 실험 결과는

와 같다

T A X O N

프로그램에 의한 수리동정 결과

확률

이 부군집

에서

로 다옴 부

군집

의

에 비해 월동히 높았으며

거리가

로

반경보다 작고

p r o b a b i l i t y o f s t r a i n f u r t h e r a w a y

가 상대 적 으로 크 므로 부군집

에 속할 확률이 아주 높다는 것을 알 수 있었다

부군접

에는 중심균주인

I S P 5 0 3 3

과

과

등외

중둘이 속해 있다

부근집

외 가상중심균주

와 가상중심 에 가장 가까 운 중심균주인

최

Table V I― Comparison of taxonomic scores between hypothetical median organism (HMO), centrotype. outer- ___________ most member strain (QMS), best match strain, and Streptomyces sp. SMF30 in cluster 2.________________

member strain

in cluster 2 Tax. distance 95% Tax. % Prob of members Willcox radius furthuer away probability

99.6192 72.8418 23.4578 72.8418 15.0129

0.999999 0.999999 0.999999 0.999999 0.999472 H M O

Centrotype (S. aburabiensis) 0 M S (S. oliververticillatum) Best match strain (S. herbaricolor) St. sp. SMF30

0.397；

0.397：

0.397：

0.397：

0.397：

2328 3113 3621 3113 3828

matching to SMF30 ： 29 29 32 39

mismatching to SMF30 '■ 10 10 7 0

Ssm value {%) '■ 74.35 74.35 82.05 100

외각 균주인 Streptomyces herbaricolorI S P 5 1 2 3^{은 모}

두 t a x o n ^{거리가 낮아} 9 5 % t a x o n ^{반경에 포함되고}

W i l l c o x ^확률이 0 . 9 9 9 9 9 9이상이었다. 부군집 2^{와 분리}

주와의 t a x o n o m i c s c o r e s^는 T a b l e V I^{에 나타나 있다.}

T A X O N 프로그램에서외 부군집 2외 구성 균중 중

가상중심균주 ( H M O ) ^{와 중심균주인}

aburabiensis I S P 5 0 3 3 . 그 리 고 . 본균주와 가장 근접험

( b e s t m a t c h e d m e m b e r ) ^균주인 Streptomycei herbaricolorI S P 5 1 2 3^{과 분리 주} S M F 3 0가 가건 톡성 실 비교 . 단순비교계수( s i m p l e m a t c h i n g c o e f f i c i e n t ) ' !

분석한 결과 T a b l e V I I^{과 같았다.} S S M ^분석결괴

H M O ^와는 7 4 . 3 5 % ^로 S . aburabiensis^^ 7 4 . 3 5 % ^로

Vol. 39, No. 3, 1995

Table VII ― Comparison of taxonomic unit characters among "member of organisms in cluster 2 of Streptomyces and ____________ isolate SMF30 and the Ssm value calculated by TAXON program________________________________________

Taxonomic unit Positive • c u j • • p , , . ,

characters charartPrs statP in S. aburdoiensis S. herbaricolor c따 pqn

(TAXON code) (%) cluster 5 ISP 5033 ISP 5123

Cathepsin B 저해물질을 생산하는 Streptomyces ofowrabi'ensi's의분러 및동정 303

|+++-}

-

+4-+|+-|-|

I

- + + + + +++ +

771317793331979773993997997979939977999663669333969663993996996969939966999

M

^I

^ G

^ f fi s cr e

^ M^ A

^

^f fi L NF -^ A 7 -

^ r AC L O W U F CL

^ E r o _

304 박상진•이현숙■김인섬■김형태•윤성준• 이계준

S. /lerkm'co/or와는 82.05%로 나타났다.

분리주는 부군집 2의 3 member 중 123HB(S소rep- tomyces herbaricolor IS P 5123)와 가장 가까운 것으로 나타났다. 부군집을 동정하는데 필요한 39 단위형질 중 32개 형질이 동일한 걸과를 보였으며 raffinose와 rhamnose 이용성. penicilin (그에 대한 저항성, 45 °C 에서외 성장. 포자의 색깔(희색)등에서 다르게 나타났 다 . 여기에서 대부분 낮은 양성값(positive value)를 보이는 형질에서 차이를 나타냈다는 것을 알 수 있다.

이상외 수리동정에서 SMF30 균주가 가장 유사한 것 으로 여겨지는 것은 Streptomyces /zer?wn'co/or이었으 나 , 부군집 2에 속하는 최외각 균주(OM S) 보다도 taxon 거리가 크고 부균집에 속할 확률(% of proba­

bility of strain further aw ay)이 최외각 균주보다도 매우 낮아서 이 분러 동정균은 부군집 2에 속하는 신중 으로 판단되었다. 그러나. 최근 sfrepfomyces의 분류는 신중으로 명명하기보다는 통합하는 추세이고 부군집 2외 모든 균주는 중심균주인 Streptomyces abura- fe^nsfs와 같은 것으로 보고되고 있으므로 분러주 SMF30온 Streptomyces frfjuratensis외 한 strain(SMF- 30)인 것으로 동정. 명명되었다.

결 론

전국각지에서 수집된 토양시료를 여러가지 방법으로 전처러하고 방선균 분러용 배지를 사용하여 얻어진 약 700여종의 방선균으로부터 여러가지 병리작용에 관여 한다고 알려진 Cathepsin B 에 대한 저분자량외 저해 물질을 생산하는 균주틀 검색한 결과. 생산하는 저해물 질외 Cathepsin B 에 대한 톡이성. 역가. 열에 대한 안 정성등이 우수한 균주 SMF30을 선별하여 화학적 수리 동정을 행하였다. 총 50개의 주군집. 34가지외 부군집 형질을 조사한 결과를 T AXON 프로그램을 이용하여 분석한 결과 분러균 SMF30온 Streptom}/ces aburabi- ensis로 동정되었다.

감사의 말씀

본 연구는 과학기술처에서 선정한 '94 선도기술개발 사업과제 연구비에 의해서 수행되었다. 본 연구에 많은 도움을 준 서울대학교 분자미생물학 연구센터에 감사 드린다.

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