Article: Bioactive Materials
Combination of berberine and silibinin improves lipid metabolism and anti-obesity efficacy in high-fat diet-fed obese mice
Jin Hyung Lee
1· Young Hoon Choi
1· Young Geol Yoon
1고지방식이로 유도한 비만마우스에서 berberine과 silibinin 복합투여를 통한 지질대사 개선과 항비만 효능 증진
이진형
1· 최영훈
1· 윤영걸
1Received: 6 July 2021 / Accepted: 19 August 2021 / Published Online: 30 September 2021
© The Korean Society for Applied Biological Chemistry 2021
Abstract
In this study, we investigated whether the combined administration of berberine (BBR) and silibinin (SBN) was effective in improving hyperlipidemia and anti-obesity efficacy using a high-fat diet (HFD)-fed obese mouse model. HFD- induced obese mice were supplemented with the BBR and SBN combination (BBR-SBN) along with the HFD administration for 8 weeks. During the experiment, body weight, food intake, and levels of total cholesterol, triglyceride and high-density lipoprotein (HDL)-cholesterol were analyzed. Consumption of HFD in the mice caused rapid increases in body weight and the levels of total cholesterol and triglycerides compared to the normal control (NC) group. However, supplementation of BBR-SBN in these obese mice significantly reduced body weight gain and suppressed the levels of total cholesterol and triglyceride with the increment of HDL cholesterol level. In the HFD-fed group, abdominal fat weight was significantly increased and the adipocytes within the epididymal adipose tissue were found to have expanded sizes compared to the NC group. However, in the BBR-SBN group, the
sizes of the adipocytes were comparable to those of the NC group and abdominal fat weight was significantly reduced. Moreover, the deposition of giant vesicular fat cells in liver tissues seen in the HFD-fed group was considerably reduced in the BBR-SBN group. These results suggest that the BBR-SBN combination tends to have synergic potential as an anti-obesity agent by significantly reducing body weight gain as well as lowering serum lipid levels and thus improving anti-obesity efficacy in HFD- induced obese mice.
Keywords
Anti-obesity · Coptis chinensis · Dyslipidemia · High-fat diet · Silybum marianum
서 론
과도한 에너지의 섭취와 소비 간의 불균형으로 인해 발생하는 비만은 체 내의 지방이 과다하게 축적되어 대사이상이 유발되 는 현상으로 고지혈증(고콜레스테롤혈증), 당뇨병, 동맥경화 등 과 같은 심혈관계 질환과 대사성 질환의 위험 요인으로 알려져 있다[1]. 2019년 국민건강영양조사에 따르면 우리나라의 에너지 과잉 섭취분율은 모든 연령대에서 증가하고 있다[2]. 이와는 반 대로 유산소 신체활동 실천율은 지난 2014년도에 비해 10% 이 상 감소하는 등 육체적 활동 저하로 인한 비만율이 점진적으로 증가하고 있고 따라서 비만과 관련된 만성질환 발생율도 해마 다 증가하는 추세에 있다[2]. 특히, 비만 자체의 심각성과 더불 어 이로 인해 유발되는 심혈관계 및 대사성 질환은 오늘날 심 각한 사회 문제로 인식되고 있다[3,4].
Jin Hyung Lee and Young Hoon Choi are equally contributed as primary authors to this manuscript.
Young Geol Yoon () E-mail: [email protected]
1Department of Biomedical Science, Jungwon University, 85 Munmu-ro, Goesan-eup, Goesan-gun, Chungbuk 367-700, Republic of Korea This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.
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고지혈증의 유발 요인으로는 고지방, 고당질, 포화지방산 및 고콜레스테롤이 함유된 식이요인의 영향이 가장 크다고 알려져 있으며 식생활의 불균형 및 서구화된 식생활과 같은 생활습관 이 원인인 경우가 대부분이다[5]. 고지혈증은 체 내 지질대사에 이상이 생겨 혈액 내의 지방성분이 필요 이상으로 높아진 상태 로서 혈관 벽에 축적되어 염증을 일으키고 그 결과 심혈관계 질환을 야기하는데 주요 위험인자는 콜레스테롤과 중성지방 수 치가 증가되는 경우이다[6]. 현재 고지혈증 환자에게 처방되고 있는 대표적인 약물은 스타틴계로서 총 콜레스테롤과 중성지방 수치를 감소시키는 효과가 있음이 알려져 있다[7]. 그러나, 스 타틴계 약물은 근염, 근육병증, 근육통 및 횡문근 융해증과 같 은 근육 관련 부작용이 있고 장기 복용 시 간 손상 발생률이 기존에 임상시험이나 서구의 연구에서 알려진 것에 비해 높게 나타남이 확인되었다[8,9]. 따라서 이러한 각종 부작용을 최소화 하고 혈액 내 지질 저하 효능이 최적화된 소재를 찾고 치료제 로 개발하는 일은 매우 중요하다.
Berberine (BBR)은 황련(Coptis chinensis)과 황백(Phellodendri cortex)에서 유래한 알칼로이드 물질로서 항염증 활성 등 다양 한 약리학적 효능을 지니고 있다[10-12]. 특히, 스타틴 계열의 물질과는 다른 메커니즘을 통해 고지혈증 및 제2형 당뇨병 환 자에게서 강력한 지질 저하 기능이 있음이 밝혀졌다[13]. BBR 은 간세포에서 LDL 수용체(LDLR)의 mRNA를 안정화시켜 LDLR의 발현은 증진시키고 proprotein convertase substilisin/
kexin type 9 (PCSK9)의 mRNA 전사를 감소시켜 PCSK9의 발현을 억제하는 활성이 있음이 알려졌다[14,15]. PCSK9는 간 세포 표면에 있는 LDLR과 결합하고 이것의 분해를 통해 LDL 콜레스테롤 수치를 증가시킨다[16]. 따라서, BBR은 신규 PCSK9 저해제로서 고지혈증의 완화 및 지질 저하제로서 새로 운 관심을 받고 있다[14,15]. 또한, BBR은 지방세포 분화과정 의 중요한 전사인자인 peroxisome proliferator-activated receptors 의 발현을 억제하여 지방세포의 분화와 지방생성효소의 발현 및 지방의 축적을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌으며 이와 더불어 BBR이 장 내에서 콜레스테롤의 흡수를 직접적으로 억제하여 혈청 내 총 콜레스테롤 수치를 약 30% 정도 감소시킬 수 있다 는 결과가 보고되었다[17-19].
Silibinin (SBN)은 밀크씨슬(Silybum marianum)에서 분리된 천연 플라보노이드로서 간세포의 퇴행성 변화를 야기하는 여러 약물과 화학물질로부터 간을 보호하는 효능과 알코올성 간경변 및 비알코올성 지방간 질환에도 유익한 효과가 있음이 알려졌 고 더불어 간담즙성 질환과 담낭 질환을 치료하는 데도 사용되 고 있으며 항염, 항균, 항산화 및 항암 효과가 있음이 보고되었 다[20-22]. 최근 3T3-L1 세포를 이용한 연구에서 SBN이 지방 생성을 억제하는 효과가 있음이 확인되었는데 이는 3T3-L1 전 지방세포(preadipocytes)에서 지방세포로 분화되는데 필요한 초 기단계의 지방생성인자들의 발현을 SBN이 억제하기 때문인 것 으로 밝혀졌다[23]. 또한 SBN은 농도의존적인 경향으로 지방의 축적과 중성지방 함량을 감소시킬 수 있음을 확인하였고 다양 한 화학적 약물 요법으로 인해 발생하는 간독성과 고지혈증의 완화와 치료에도 효과가 있음이 보고되었다[24,25].
위에서 기술한 바와 같이 BBR과 SBN은 각각 고유한 지질 대사 조절 기능이 있음을 알 수 있다. 본 연구에서는 두 약물 의 복합투여를 통해 혈중 지질 저하 및 항비만 증진 효능에 시
너지 효과가 있는지 확인하였으며 고지방식이로 유도한 비만마 우스 모델을 이용하여 혈액 내 지질대사 개선과 비만 억제 효 능을 분석하였다.
재료 및 방법
시약 및 실험동물 사육과 식이 투여
Berberine chloride (14050), silibinin (S0417) 그리고 simvastatin (PHR1438)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매 하여 멸균 증류수에 용해하여 사용하였다. 실험동물은 DBL (충 북 음성)로부터 생후 4주령의 C57BL/6 생쥐를 구입한 후, 온 도 18±2oC, 상대습도 50±10%, 환기회수 10-20회/시간, 조명시 간 12시간(점등 08:00, 소등 20:00)으로 설정된 동물실에서 환 경적응을 위해 일주일 동안 고형배합사료(RodFeed, DBL)로 적 응시킨 다음, 평균 체중 19~21 g의 마우스를 각 군 당 8마리씩 6개군으로 나누어 분류하였다. 실험동물의 사육과 사용 등 실험 과정은 중원대학교 동물윤리위원회의 규정에 저촉되지 않게 실 시하였다(JWCUC-201608-001-02). 정상식이(normal control, NC)군에는 일반식이인 고형배합사료를 공급하였고, 고지방식이 (high fat diet, HFD)군은 60 kcal % fat (D12492, Reseach diets Inc., New Brunswick, NJ, USA) 고지방식이를 자유급식 방법으로 제공하였다. 6개군 중에서 5개군에는 고지방식이를 공 급하여 비만을 유도하였으며, 1개군은 일반식이인 고형배합사료 를 전체 실험기간 동안 공급하여 NC군으로 분류하였다. 7주 동 안 고지방식이를 제공한 5개군 중에서 1개군은 고지방식이만을 지속적으로 제공하여 HFD군으로 분류하였고 3개군에는 고지방 식이의 제공과 함께 각각 BBR (100 µg/g BW), SBN (100 µg/g BW), 그리고 BBR-SBN (BBR 100 µg/g BW plus SBN 100 µg/g BW)을 경구투여하여 BBR군, SBN군, BBR-SBN군으로 분류하였으며, 남은 1개군은 양성대조(positive control, PC)군으 로 분류하여 고지방식이 제공과 함께 고지혈증 환자의 혈중 지 질 개선에 이용하는 simvastatin (0.67 µg/g BW)을 투여하였다.
체중과 식이섭취량은 일주일에 한번 일정한 시간에 주기적으로 측정하였고, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 실험 기간 동안의 체중 증가량을 같은 기간 동안 섭취한 식이섭취량으로 나누어 산출하였다.
혈장 지질 분석
혈액 내 지질 분석을 위해 8주 동안의 경구투여를 마친 마우스 를 마취시킨 후 경동맥에서 혈액을 채취하여 13,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리한 후, 혈청을 분리하여 −80oC에 냉동 보 관하며 분석에 사용하였다. 혈중 중성지방(triglyceride, TG) 함 량은 중성지방 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 효소학적 방법으로 처리한 후 550 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였고, 총 콜레스테롤(total cholesterol, T-CHO) 함량은 총 콜레스테롤 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd.)을 이용해 효소학적 방법으로 처리한 후 500 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. High-density lipoprotein (HDL)-cholesterol 함량도 측정용 키트(Asan Pharmaceutical co. Ltd.)를 이용하여 효소학적 방법으로 처리한 후 500 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
Aspartate transaminase (AST) 및 alanine aminotransferase (ALT) 측정
혈액 내 AST와 ALT의 함량은 실험동물을 마취시킨 후 흉부를 열어 심장에서 혈액을 채취하고 이를 13,000 rpm으로 원심 분 리한 후 혈청을 분리하여 분석에 사용하였다. 혈장 AST/ALT 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd.)를 사용하여 Reitman-Frankel 법을 이용하여 처리한 후 505 nm에서 흡광도 를 측정하여 함량을 분석하였다[26].
Histological staining
간과 부고환의 지방조직을 확인하기 위해 8주 동안의 경구투여 를 마친 실험동물을 마취시킨 후 간 조직과 부고환 지방조직을 적출하여 10% 중성포르말린에 고정 후 paraffin block을 제작 하여 0.4 µm 굵기로 삭절한 후 Hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 통해 지방세포의 크기와 형태를 광학현미경을 이용하여 분석하였다.
통계처리
모든 실험결과는 평균(mean)±표준오차(standard error, SE)로 나 타냈으며 실험결과 분석은 Graph pad Prism 5.0 프로그램 (Graph Pad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용하여 진행하였다. 각 그룹 간 비교는 분산분석(one way analysis of variance, ANOVA)에 이어 Tukey’s multiple comparison test를 이용하여 대조군과 실험군 사이의 유의성을 p <0.05 수준에서 검증하였다.
결과 및 고찰
체중 증가량, 식이섭취량 및 식이효율
실험동물군의 체중 측정 결과는 Table 1에 나타내었다. 7주 동
안 고지방식이를 공급한 5개의 실험군(HFD군, PC군, BBR군, SBN군 및 BBR-SBN군)은 NC군에 비해 유의적인 체중 증가를 보여 성공적으로 비만이 유도되었음을 확인할 수 있었다. 이 중 4개의 실험군(PC군, BBR군, SBN군 및 BBR-SBN군)에 추가적 으로 8주 동안 매일 각각 simvastatin, BBR, SBN, 그리고 BBR-SBN 복합물을 경구투여하였다. 실험에 사용한 BBR과 SBN의 용량은 이전 연구에서 독성이 나타나지 않는 함량으로 서 단일물의 경우에는 각각 하루에 100 µg/g BW의 함량으로 투여하였고, 복합물의 경우에는 BBR과 SBN을 각각 100 µg/g BW의 함량으로 경구투여하였다[27,28]. 8주 동안 각 약물을 투 여한 후 체중 증가 양상을 관찰한 결과, 지속적으로 고지방식 이만을 공급한 HFD군(6.26±0.29 g)보다 PC군(4.14±1.06 g), BBR군(3.89±0.29 g) 및 SBN군(4.93±1.39 g)에서 유의적이지는 않으나 체중 감소 경향이 나타났으며 특히 BBR-SBN 복합투여 군(2.25±0.14 g)은 HFD군과 비교하여 약 36% 정도 유의적인 체중 감소 효과를 보였다. 식이량은 NC군과 비교했을 때는 모 든 실험군에서 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는 일반식이 사료보다 고지방식이 사료의 탄수화물 함유량이 낮아 이에 대 한 실험동물들의 선호도가 점점 줄어듦으로써 식이섭취량이 NC 군에 비해 감소하는 경향을 보인 것으로 추측된다[29,30]. 그러 나, 실험군들 사이의 식이섭취량은 유의적인 차이를 보이지 않 았다. 식이효율은 HFD군이 0.059±0.003로서 NC군(0.014±0.002) 보다 약 4.2배 정도 유의적으로 증가하였다. PC, BBR 및 SBN 투여군은 각각 0.036±0.009, 0.033±0.003, 0.042±0.012으로서 유의한 차이는 보이지 않았다. 비록 PC, BBR 및 SBN 투여군 과 BBR-SBN 투여군(0.021±0.001) 사이의 식이효율은 통계적으 로 유의한 차이는 보이지 않았으나 BBR-SBN 투여군에서 크게 감소하는 경향을 보였으며 또한 HFD군과 비교했을 때 통계적 으로 유의하게 감소하였다. 식이효율은 식이 섭취량에 대한 체 중 증가량으로 식이효율이 낮다는 것은 같은 양의 식이를 섭취 하더라도 체중 증가가 적다는 것을 의미한다[31]. 즉, 식이효율
Table 1 Body weight, food intake and food efficiency ratio of high-fat diet-fed mice
NC HFD PC BBR SBN BBR-SBN
Weight (g)
0 week 20.91±0.23 20.90±0.27 20.32±0.43 20.84±0.19 20.05±0.22 21.40±0.33
7th week 26.66±0.30 37.25±0.90a 38.11±1.39a 36.74±0.67a 35.45±2.02a 35.63±0.66a 15th week 29.88±0.66 43.50±0.65a 42.25±1.97a 40.63±0.47a 40.38±0.97a 37.88±0.69ad
Weight gain (g)1) 3.22±0.46 6.26±0.29c 4.14±1.06 3.89±0.29 4.93±1.39 2.25±0.14d
Intake
Food intake (g/day) 4.22±0.05 1.90±0.12a 2.07±0.13a 2.08±0.10a 2.10±0.11a 1.96±0.03a FER2) 0.014±0.002 0.059±0.003b 0.0360.009 0.033±0.003 0.042±0.012 0.021±0.001e NC, normal control mice; HFD, high-fat diet-fed mice; PC, high-fat diet-fed mice treated orally with simvastatin (0.67 µg/g body weight); BBR, high- fat diet-fed mice treated orally with berberine (100µg/g body weight); SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with silibinin (100 µg/g body weight);
BBR-SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with the combination of berberine (100µg/g body weight) and silibinin (100 µg/g body weight).
1)Weight gain (g) = body weight at 15th week – body weight at 7th week
2)Food efficiency ratio = [weight gain (g/day)] / [food intake (g/day)]
Values are mean ± SE of eight mice per group.
ap <0.001 compared with the NC group
bp <0.01 compared with the NC group
cp <0.05 compared with the NC group
dp <0.05 compared with the HFD group
ep <0.01 compared with the HFD group
은 비만을 나타내는 척도로서 식이효율 값이 적을수록 비만조 절 효과가 있다고 할 수 있다. 따라서 고지방식이를 제공했을 때 BBR-SBN 복합투여는 BBR과 SBN 단독투여에 비해 식이효율 을 더욱 감소시키는 활성이 있음을 알 수 있으며 이를 통해 고 지방식이 마우스의 체중 증가를 억제하는 효과가 나타남을 확 인하였다(Table 1).
복부 지방량 변화
고지방식이로 유도한 비만마우스에 8주 동안 매일 BBR, SBN, BBR-SBN, 그리고 simvastatin을 각각 경구 투여한 후, 복강을 개복하여 복부지방의 축적 정도를 비교하였다(Fig. 1). HFD군 의 g 체중 당 복부 지방량은 0.080±0.002 g으로 NC군의 0.040
±0.001 g에 비해 약 2배 정도 유의적으로 증가하였다. 그러나, 약물 처리군인 BBR군은 0.058±0.001 g, 그리고 SBN군은 0.065±0.003 g으로 HFD군보다 각각 약 27.5%, 그리고 18.8%
정도 유의적으로 복부 지방량이 감소하였다. BBR-SBN 복합투
여군의 복부 지방량은 0.054±0.002 g으로 HFD군에 비해 약 32.5% 정도로 매우 높은 수준으로 감소함을 확인하였다(Fig. 1).
BBR군 및 SBN군과 BBR-SBN 투여군 사이의 복부 지방량은 감소하는 경향의 변화를 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았 다. 그러나, PC군과 BBR-SBN 투여군 사이는 유의한 복부 지 방량 감소 효과를 보였다. 이러한 결과는 각각 독립적인 약물 투여에도 유의미한 복부지방 감소에 효과가 있지만 이들 약물 의 복합투여는 더욱 상승적인 복부지방 감소 효과를 기대할 수 있음을 의미한다. PC군으로 사용한 simvastatin 투여군의 복부 지방량은 0.069±0.001 g으로 HFD군에 비해 약 13.8% 정도의 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다.
AST 및 ALT 측정
간 조직의 손상은 세포 내부에 존재하는 효소가 혈액으로 유출 되는 것을 측정함으로써 확인할 수 있는데, 세포 내에서 유리 되는 효소 중 AST와 ALT의 상승은 간 손상으로 인한 간 세 포의 파괴와 간 조직의 괴사가 진행되면서 아미노기 전이효소 가 혈액 내로 방출되어 증가하는 것이므로 간 세포의 파괴 및 변성의 지표로 사용되고 있다[26,32]. 치료 약물 또는 천연 추 출물의 투여는 예상치 않은 간 기능 이상을 야기할 가능성이 있으므로, 본 실험에서도 BBR과 SBN의 안전성을 확인하기 위 해 실험동물에 8주 동안 투여한 후, 간 기능에 영향이 있는지 알아보고자 혈중 AST, ALT 수치를 측정하였다(Fig. 2). 대조군 과 각 실험군의 AST 및 ALT 측정 결과, NC군과 HFD군 사 이에 유의적인 차이는 없었으며 따라서 고지방식이 공급으로 인 한 간 손상은 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 NC 군과 비교하여 BBR 투여군, SBN 투여군, 그리고 BBR-SBN 복합투여군 사이에서도 유의적인 차이는 보이지 않았다(Fig. 2A, B). 즉, 8주 동안의 약물투여가 실험동물의 간 기능에 부정적인 변화를 일으키지 않았으며, 따라서 간 독성을 지니지 않은 것 으로 판단되었다.
혈중 지질 분석
고지혈증은 혈액 내의 지질 대사에 이상이 발생하여 지질 함량 이 비정상적으로 증가한 상태로 높은 농도의 지질이 혈중에 존 Fig. 1 Abdominal fat weights of high-fat diet-fed mice. NC, normal
control mice; HFD, high-fat diet-fed mice; PC, high-fat diet-fed mice treated orally with simvastatin (0.67µg/g BW); BBR, high-fat diet-fed mice treated orally with berberine (100µg/g BW); SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with silibinin (100µg/g BW); BBR-SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with the combination of berberine (100 µg/g BW) and silibinin (100µg/g BW) (**p <0.01, ***p <0.001). Values are mean ± SE (n =8). BW, body weight
Fig. 2 Serum AST and ALT analyses. The degree of liver injury was demonstrated by the serum AST (A) and ALT (B) levels. Result showed no significant difference among these six groups. NC, normal control mice; HFD, high-fat diet-fed mice; PC, high-fat diet-fed mice treated orally with simvastatin (0.67µg/g BW); BBR, high-fat diet-fed mice treated orally with berberine (100 µg/g BW); SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with silibinin (100µg/g BW); BBR-SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with the combination of berberine (100 µg/g BW) and silibinin (100 µg/g BW). Values are mean ± SE (n =8). BW, body weight
재함으로써 혈관벽에 누적되거나 응고되어 혈관을 막거나 혈액 의 원활한 소통을 방해하여 동맥경화증 등의 심혈관계 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 특히, 총 콜레스테롤(T-CHO), 중 성지방(TG) 및 HDL 콜레스테롤 등의 지질 대사체 함량은 이 러한 심혈관계 질환을 조절하고 치료하는데 중요한 지표가 되 고 있다[33]. 따라서, 고지방식이로 유도한 비만 마우스 모델에 BBR과 SBN 그리고 BBR-SBN 복합물을 고지방식이와 함께 제 공한 후, 혈중 T-CHO, TG, HDL 콜레스테롤의 변화를 측정하 여 이상지질대사의 개선효과에 대해 분석하였다(Fig. 3).
T-CHO의 경우 정상식이를 공급한 대조군인 NC군이 129.1±
6.1 mg/dL인 것에 비해 HFD군은 182.3±11.4 mg/dL로서 고지방 식이로 인해 혈중 T-CHO 함량이 NC군에 비해 약 1.4배 정도 유의적으로 증가함을 확인하였다(Fig. 3A). 그러나, PC군, BBR 군, 그리고 SBN군에서의 혈중 T-CHO 함량은 각각 158.8±3.7, 157.7±8.9 mg/dL 그리고 157.5±13.0 mg/dL로서 HFD군에 비해 각각 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다.
반면에, BBR-SBN 복합투여군의 T-CHO 함량이 142.1±7.4 mg/dL로서 HFD군의 수치에 비해 약 22% 정도의 유의한 감소 효과가 있었다(Fig. 3A). 특히 각 실험군(BBR군, SBN군, BBR-SBN군 및 PC군)과 NC군 사이에는 통계적 유의성이 없 는 것으로 보아 투여한 약물들이 혈중 T-CHO 함량을 낮추어 일반식이를 공급한 NC군 수준으로 유지시킬 수 있는 활성이 있음을 확인할 수 있었다. TG의 경우에도 HFD군은 84.1±4.4 mg/dL로서 NC군(60.7±4.2 mg/dL)에 비해 약 39% 정도 증가했 음을 확인하였다(Fig. 3B). 그러나, BBR군, SBN군 및 BBR- SBN군의 혈중 TG 함량은 각각 63.1±3.8, 67.9±0.8 mg/dL 그 리고 61.5±2.5 mg/dL로서 HFD군에 비해 각각 약 25, 19% 그 리고 27% 정도의 통계적으로 유의한 감소 효과를 보였고 또한 PC군(60.9±1.7 mg/dL)도 HFD군에 비해 약 27% 정도 감소하였 다(Fig. 3B). 따라서 각 약물 투여군에서 전반적으로 TG 함량
이 감소하는 경향이 있으며 특히 BBR과 SBN을 복합투여했을 때 중성지방 함량은 일반식이군인 NC군의 TG 함량 수준으로 회복되고 있으며 고지혈증 환자의 치료에 사용하는 simvastatin 의 중성지방 감경 효과와 비교해도 거의 같은 수준의 활성이 나타나고 있음을 확인하였다. HDL 콜레스테롤의 경우에는 NC 군은 85.3±3.3 mg/dL, HFD군은 89.5±3.0 mg/dL로서 두 군의 차이는 거의 없었다. 그러나 BBR군과 BBR-SBN군은 각각 118.7±9.9, 122.8±5.0 mg/dL로서 HFD군에 비해 약 1.3-1.4배 정도의 통계적으로 유의한 증가 및 개선 효과가 있음을 확인하 였다(Fig. 3C). PC군과 SBN군도 각각 103.8±4.6, 118.7±9.9 mg/dL로서 HFD군에 비해 HDL 콜레스테롤 함량이 증가했으나 유의적이지 않았다.
이러한 결과들은 BBR과 SBN 복합투여가 고지방식이에 의 해 증가된 T-CHO와 TG의 함량을 낮추게 하고, HDL 콜레스 테롤의 함량을 증가시키는 등 이상지질대사에 대한 조절 및 개 선 기능이 있음을 의미한다. 뇌졸중, 고혈압, 동맥경화증과 같 은 심혈관계 질환을 일으키는 원인 중 하나인 고지혈증은 체 내의 필요 이상 많은 지방성분이 혈관벽에 쌓여 염증과 질환을 일으키는데, 본 실험결과로 미루어볼 때 고지혈증 환자들의 혈 중 지질함량과 그로 인해 초래되는 동맥경화 및 심혈관 질환 등의 예방과 치료에 긍정적인 효과를 줄 수 있을 것으로 판단 된다.
부고환 지방조직의 형태학적 관찰
부고환 주위 지방조직을 적출하여 H&E 염색 후, 광학현미경을 이용하여 관찰하였다(Fig. 4). 부고환 지방세포의 크기는 HFD 군이 NC군에 비하여 매우 크게 증가하였다(Fig. 4A, B). BBR- SBN군은 NC군보다는 다소 크지만 simvastatin을 투여한 양성 대조군(PC군)의 지방세포 크기보다도 줄어드는 경향을 확인할 수 있었다(Fig. 4C, F). 이 결과는 BBR과 SBN 단독 및 복합 Fig. 3 Plasma total cholesterol (T-CHO) (A), triglyceride (TG) (B) and HDL cholesterol (HDL) (C) levels of normal or high-fat diet-fed mice.
Combination of berberine and silibinin significantly decreased the T- CHO and TG levels and increased the HDL levels (*p <0.05, **p <0.01 and ***p <0.001). NC, normal control mice; HFD, high-fat diet-fed mice; PC, high-fat diet-fed mice treated orally with simvastatin (0.67 µg/
g BW); BBR, high-fat diet-fed mice treated orally with berberine (100 µg/g BW); SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with silibinin (100 µg/g BW); BBR-SBN, high-fat diet-fed mice treated orally with the combination of berberine (100 µg/g BW) and silibinin (100 µg/g BW).
Values are mean ± SE (n =8). BW, body weight
투여군의 혈청 내 지질함량 수준의 조절 효과와도 일치하고 있 다(Fig. 3). 지방세포 크기의 감소 경향은 BBR과 SBN이 지방 세포 분화에 필요한 지방생성인자들의 전사와 발현을 억제하여 지방의 축적을 저해하는 활성이 있기 때문인 것으로 사료되며 특히 BBR-SBN 복합 투여군에서는 시너지 효과로 인해 더욱 우수한 내장 지방 축적 억제 효과가 있음을 알 수 있다 [18,19,23] (Figs. 1, 4F).
간 조직의 형태학적 관찰
적출한 간 조직을 H&E 염색한 후, 광학현미경을 이용하여 간 조직 내 세포를 관찰하였다(Fig. 5). NC군의 모든 개체에서는 간 조직을 이용한 검사 결과 간에서 유의한 간 병변과 지방간 형태는 관찰되지 않았다(Fig. 5A). 그러나, 고지방식이를 제공한 HFD군의 간 조직에서는 NC군에 비해 백색의 거대 소포성 지 방구의 침착이 간 조직 전체에 걸쳐 생성되어 있음을 관찰하였 다(Fig. 5B). 반면에 BBR 투여군, SBN 투여군 및 BBR-SBN 복합투여군에서는 모두 지방구 침착과 같은 지방간 병변이 억 제되고 HFD군의 경우에 비해 간 조직의 거대 소포성 지방구 의 침착이 크게 감소되어 있음을 확인하였다(Fig. 5D-5F).
Simvastatin을 투여한 PC군에서도 간 조직 내 크고 작은 지방 구가 현저히 줄어 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 5C). 이와 같
은 결과는 BBR과 SBN의 단독투여 및 BBR-SBN 복합투여가 고지방식이에 의한 간 세포의 지방화를 완화시킬 수 있는 효과 가 있음을 의미한다. 특히 단일물질을 투여한 군보다 BBR-SBN 을 함께 투여한 복합투여군에서 지방구의 침착이 다른 군에 비 해 더욱 억제되는 경향이 관찰되었으며 따라서 간 조직 내 지 방 축적 억제 효과가 더 우수하게 나타남을 확인하였다(Fig.
5F).
본 연구를 통해 고지방식이를 제공한 HFD군에서 볼 수 있 는 급격한 체중 증가는 부고환과 간 조직에 위치한 지방의 증 가에서 확인한 바와 같이 체 내 지방의 축적과 보존에 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 또한, 고지방식이는 혈중 T-CHO 와 TG 함량을 크게 증가시킴으로써 혈액 내 지질대사에 이상 을 야기할 수 있으나 BBR-SBN의 지질 저하 활성에 의해 이 상지질대사가 조절 및 개선될 수 있음을 확인하였다. 특히, 각 단일물질로서 BBR과 SBN의 투여로 인한 항비만 및 지질대사 개선 효능도 뛰어나지만 BBR-SBN 복합투여로 인한 시너지 효 과로 인해 항비만 및 지질대사 개선 활성이 더욱 증진됨을 확 인하였다. 고지방식이로 인한 비만인의 치료에 직접적으로 반영 하기에는 어려움이 있지만 본 연구에서 얻은 결과로 미루어볼 때 BBR과 SBN의 복합투여는 고지방식이로 인해 초래되는 이 상지질대사의 조절에 효과가 있을 것으로 사료되며 비만 환자 Fig. 4 Histological analysis of the epididymal adipose tissues in mice (H&E staining, ×200). (A) normal control mice, (B) high-fat diet-fed mice, (C) high-fat diet-fed mice treated orally with simvastatin (0.67 µg/g BW), (D) high-fat diet-fed mice treated orally with berberine (100 µg/g BW), (E) high- fat diet fed mice treated orally with silibinin (100 µg/g BW), (F) high-fat diet fed mice treated orally with the combination of berberine (100 µg/g BW) and silibinin (100 µg/g BW). BW, body weight
들의 체중과 식이효율을 조절하는데 기초자료로 응용할 수 있 을 것으로 기대한다.
초 록
본 연구에서는 고지방식이(HFD)를 급식하여 제조한 비만마우 스 모델을 사용하여 berberine (BBR)과 silibinin (SBN) 복합투 여가 혈중 지질대사 및 항비만 개선 효능에 유의적인 시너지 효과가 있는지 조사하였다. HFD로 유도된 비만마우스를 8 주 동안 HFD의 지속적인 제공와 함께 BBR 및 SBN (BBR-SBN) 조합을 투여하였다. 실험이 진행되는 동안 체중과 식이량을 측 정하였고 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방 및 HDL 콜레스테롤 수준을 분석하였다. HFD를 제공한 마우스는 정상 대조군(NC) 그룹에 비해 체중과 총 콜레스테롤 및 중성지방 수치가 급격히 증가했다. 그러나 이러한 비만마우스에 BBR-SBN조합을 투여 하였을 때 체중 증가가 현저하게 감소하였고 HDL 콜레스테롤 수치가 증가하였으며 총 콜레스테롤 및 중성지방 수치는 유의 하게 억제되었다. HFD그룹의 복부지방 무게는 유의하게 증가 했으며 부고환 지방조직 내의 지방세포의 크기가 NC 그룹에 비해 크게 확장된 것으로 나타났다. 그러나 BBR-SBN 그룹에
서는 지방세포의 크기가 NC 그룹의 크기와 비슷했으며 복부지 방 무게가 현저하게 감소하였다. 더불어, HFD 그룹에서 보이는 간 조직의 거대 소포성 지방구의 축적은 BBR-SBN 그룹에서 크게 감소되었다. 이러한 결과는 BBR-SBN 조합이 HFD 유발 비만마우스에서 체중 및 복부 지방 증가를 현저하게 감소시키 는 경향이 있으며 혈청 내의 총 콜레스테롤 및 중성지방 수준 을 낮추어 항비만 효능을 개선시킬 수 있는 가능성을 보여주는 것으로 앞으로 항비만 치료 및 개선제제로서의 잠재력을 가지 고 있음을 시사한다.
Keywords 고지방식이 · 엉겅퀴 · 이상지질혈증 · 항비만 · 황련 감사의 글 본 논문은 중원대학교 교내학술연구비 지원(과제관리번호: 2020- 008)에 의한 결과로 이에 감사드립니다.
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