혈중 변역 복합체 검출을 위 한 R퍼i

대한임상병리사회지 : 제 23권 1호 1991

혈중 변역 복합체 검출을 위 한 R퍼i

ELISA법 의 개 발

연세대학교 의과대학 중앙연구설

연세대학교 의과대학 부속병원 외파면역학 검사실*

임태숙 • 이은미*

Key words : Circulating immune complexes.

Aggregated human gamma globulin.

Enzyme linked immuno sorbent assay.

Radio immunoassay.

1 . 서 론

혈액 중에는 여러 종류의 면역복합체가 존재하며，

그 측정방법도 항원 특이적 방법과 항원 비특이적

‘방법 등으로 대별되며 항원 비특이적 방법에는 첫 째， 면역복합체의 물리화학적 특성을 이용한 방법，

둘째， 면역복합체와 혈청 보체와의 생물학적 결합능 을 이용한 방법， 세째， 면역복합체 내의 IgG 분자와 선택적 결합력이 있는 류마티스양 언자를 이용하는 방법， 네째， Raji cell이나 혈소판 표면에 존재하는 보체나 Fc 수용체와 면역복합체의 결함능을 이용하 는 방법 , 다섯 째 , IgG와 친화력 이 있 는 protein-A

를 이용하는 방법 등 50여가지 이상의 검사방법이 소개되고 있으나 이러한 방법 중 어느 한 방법도 혈 액 중 면역복합체를 정확하게 측정해 내지 못하고 있으므로 세계 보건기구의 협동연구 보고서 10)는 18

가지 측정 방법 을 비 교 검 토하여 conglutinin binding assay, Raji cell assay, monoclonal rheumatoid factor assay, solid-phase (고상) Cq binding assay 및 Cq deviation test 등 몇 가지 를 추천하였는2， 3) 이들은 방사성 동위원소를 사용하여 그 감수성에 많은 향상을 가져왔으나 방사성 동위원 소의 비용， 생체위험요인 등의 불펀한 점이 있으므 로 면역효소법을 도입하고 있다.

Cunningham-Rundles C 등6)은 lymphoblastoid B cell line이며 표면 면역글로부런이 없고 C3b, C3

d, IgG Fc 수용체 를 가지 고 있는 Raji cell에 대 한 부착능을 이 용한 Raji cell ELISA법 을 연구 개 발하 였다.

본 연구는 혈액 중 면역복합체의 여러 검출방법 중 Raji cell ELISA법을 단계별 요인에 따라 반응양 상을 살펴보고 조건을 조절하여 이 방법의 최적조건 을 개 발하고 또 고상 C1q ELISA법 , Raji cell RIA

법 , Raji cell ELISA법 간의 상관성 및 유용성 을 살 펴보고자 하였다.

II. 실험재료 및 방법 1. 실험재료

1) 인 혈청으로푸터의 C1Q 폼리

C1q는 Volanal‘is법 14)에 의하여 저이온 강도의 완 충액에서 침전시킨 후 protein-A sepharose CL -4 B column{Pharmacia, Uppsala, Sweden) 에 통과시 켜 사 용 하 였 고 순 도 는 SDS {sodium dodecyl sulfate)-polyacrylamide gel electrophoresis로 검 정하여 사용하거나 상업용 C1 q (CalbioChem Co, CA, U.S.A.) 를 사용하였다.

2} AHGG(aggregated human gamma

glob따in} 의 체 조

Human IgG를 10mg/ml 되 도록 PBS에 아주 천

천히， 소량씩 계속적으로 2-3시간 동안 실온에서 완전히 녹인 후 63.C 에서 30분간 응칩시킨 후 4.C 에 서 5분간 1000g로 원심분리하여 상충액을 O.lM PBS(pH 7.2) 로 펑 형 시 킨 sephacryl S-300 column (Pharmacia, Uppsala, Sweden) 에 통파시 쳐 IgM 에 해 당하는 분획 (MW: 900,000) 을 모아서 사용하 였으며， 단백질 정량은 표준 물질로 bovine serum albumin (BSA) 을 사용한 Lowry법 7)으로 정량하여

1% BSA을 넣은 다음 일정량씬 분주하여 -70.C 에 서 보관하여 6주까지 사용하였 다.

3) Conjugate(goat anti-human IgG, alkaline phosphatase conjugated, Sigma Co., MO, U. S.

A), 125I-goat anti-human IgG (Sigma Co., MO, U.S.A) 와 기 질 (π-nitrophenyl phosphate disodium,

PNP) 등은 상업용을 사용하였다.

4) Raji cells

Raji 세 포는 0.5% penicillin파 streptomycin.

1% L-glutamin, 1% HEPES 완충액 파 10% 소 (牛) 태아 혈청이 보충된 RPMI _{배지를 넣어} 5%

CO2 ^{배양기에서} 48시간 계대 배양하였으며. trypan blue 염 색 으로 살아있 는 세 포수가 항상 90% 이 상이 되는지 검정하여 사용하였다.

5) 환자 및 정상 대조군 혈청

환자군은 1982 년에 개정된 American Rheumatism Association (ARA) criteria에 의 해 진 단된 전 신 성 홍반성 낭창 환자 (SLE) 32예， 류마터스성 관절 염 환자 (RA) 11예， 기타 자가면역성 질환자 57예 둥 100예와 정상대조군은 정규 직원 신체검사의 100

예를 대상으로 하였으며 채혈 후 실옹에서 30분 정 도 방치한 후 혈청을 분리하여 검사 전까지 -70.C

에서 보관하였다.

2. 실험방법

1) Solid-phase C1 q ELISA법

ELISA법은 Singh의 방법을 기초로 하여 변형시 켰으며 11), 96 well EIA plate(Dynatech Inc., CA.

U.S.A.) 에 부착 완충액에 든 5μg/ml짜리 human C1q(Calbiochem Co., CA, U.S.A.) 를 100μI씩 넣 고 4.C 냉장고에 하룻밤 동안 두어 부착시켰다. 다 음날 plate를 0.05% PBS-tween으로 3회 세척한 후 1% 소 태아 혈청이든 PBS-tween으로 36.5.C 에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합반응을 방지시켰 다. Plate를 털어낸 후 pH 7.5의 0.2M disodium

EDTA용액 50μl를 가한 다음 1 : 16되게 희석한 검 사혈청을 50μl씩 첨가시킨 후 습도를 유지시킨 채

4.C 냉장고에서 1시간 동안 반응시켰다. 이것을

PBS-tween 용액으로 3회 세척한 후 1% 소 태아 혈 청 이 든 PBS-tween으로 1 : 1000 희 석 된 conjugate (goat anti-human IgG, alkaline phosphatase conjugated, Sigma. Co., MO., U.S.A.) 용액으 로 100μl씩 가하고 1시간 동안 36.5.C 배양기에서 반응시켰다. 다시 3회 세척한 후 PNP를 1.2mM MgCl2^{가 포함된} pH 9.8의 1.0M diethanol amine

에 1mg/ml 되 도록 용해 시 키 고 100μl씩 가했 다 . Plate를 차광상태 가 되 도록 하여 20분 반응시 킨 후

1N NaOH 30μl를 가하여 발색 반응을 정지시켰다.

MR 600 microplate reader (Dynatech Inc., CA.,

U.S.A.) 에서 405nm의 흡광도를 측정하였다. 시료 내 혈액 중 면역복합체의 양은 blank well의 흡광도 를 제한 뒤 AHGG의 표준곡선에 비교해서 μg of AHGG equivalent/ml 단위 로 판독하였고 검 사는 삼중 반복검사로 시행하였다.

2) Raji cell radioimmunoassay(RIA) 법 Raji cell RIA법은 Theofilopoulos의 법을 변형하 였으며 12) RPMI 배지에 3 일 동안 배양시킨 Raji 세 포를 1% 소 태아 혈청이든 RPMI 배지 50μl 속에

2 X 10⁶ cells이 되 도록 세 포수를 맞추어 polystyrene

tube에 넣고， 생리식염수로 1:4되도록 희석시킨 혈 청 25μl를 넣은 뒤 37.C 에서 30분간 반응시켰다. 이 때 표준 곡선의 작성을 위하여 또 따른 2 X 10⁶ Raji

cells파 정상인 혈청을 최종 희석배수가 1:4 되도록 생리식염수로 희석시킨 각종 농도의 AHGG(500, 125, 31. 25, 7.5μg/ml) 각각 25μl씩파도 반응시킨 다. 반응 후 각 tube에 1% 소태아 혈청이 든 RPMI

로 1500g에서 5분간 원섬분리하여 상층액을 버리고 3회 세척한다. 그 후 여기에 1% 소 태아 혈청이든 RPMI로 1 : 10희석된 125I-goat anti-human IgG (10

μCi!ml) 25μl를 pellet에 가하고 4.C 에서 30분간 반 응시켰다. 1% 소태아 혈청이 든 RPMI로 1500g에 서 5분간 원심분리하여 상층액을 버리고 3회 세척 한 후 각 tube의 radioactivity를 gamma counter에 서 측정하였다. 시료내 혈액 중 면역복합체의 양은 radioactivity를 AHGG의 표준곡선과 비 교해 서 μg

of AHGG equivalent/ml로 표시 하고， 각 검 사는 이 중반복검사로 시행하였다.

3) Raji cell ELISA법

Raji cell 면 역 효소.법 은 Cunningham-Rundles법 을 변형하여 검사하였다6) 10% 소 태아 혈청이 든

111 . 실험결과

1. Raji cell E Ll SA 법의 단계별 요인에 따른

반응양상

1) Raji cell ELISA법의 혹이성

Raji cell상의 C3b 수용체와 면역복합체에 고정되 어 있는 보체 C3b가 특이적으로 결합하는 양상올 보 고자 하였다 (Fig.1) .

이때 conjugate는 1 : 1000, PNP는 1mg/ml, Raji 세포는 2 X 10⁶ cells/tube을 사용하였다. 그 결 파 Raji 세포의 C₃b 수용체는 응집이 되거나 면역복 합체를 이루어 보체를 포함할 때만 특이적인 반응도 를 나타내었다. 즉 63⁰C 에 30분간 응집시킨 AHGG

의 농도를 증가시킴에 따라 발색도가 증가하는 좋은 용량 반응곡선을 형성하였으나 면역복합체가 아닌 monomer( 단량체) IgG에 신선한 인혈청을 가하거 나， 보체를 56⁰C, 30분간 가열시쳐 비동화된 인혈청 을 AHGG와 반응시킨 경우는 농도 증가에 따른 발 색도의 증가를 관찰할 수 없는 혈액 중 단량체 IgG 의 농도와 무관한 기저반응 양상을 보였다.

2) AHGG와 NHS의 희석배수에 따른 철합농 AHGG와 NHS(보체)의 농도가 Raji 세포상의 보 체 수용체와 보체를 포함한 혈액 중 면역복합체의 결합에 미치는 영향을 보기 위해 다음과 같이 RPMI 배지에 2 일동안 배양시킨 Raji 세포를 동일

배 지 50μl 속에 2 X 10⁶ cells이 되 도록 세 포수를 조 정하여 polystyrene tube에 넣어 둔다. 표준곡선의 작성을 위해 생리식염수로 1:4 희석된 정상 AB 혈 청과 생리식염수로 1:4 희석된 각종 농도의 AHGG

(500, 125, 31, 25, 7.5μg/ml) 검 체 를 혼합하여 최 종 1 : 8로 희석시켜 36.5⁰C, 5% CO2 배양기에서 1 시간 동안 사전 배양시켰다. 사전 배양된 각종

AHGG 검체 50μl와 생리식염수로 1:8되게 희석시

킨 각 실험혈청 50μl를 10% 소 태아 혈청이 포함된 RPMI 배 지 50μl 속에 들어 있 는 2 X 10⁶ Raji cells

에 넣어 4⁰C 냉장고에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 730g, 5분간 원심분리하여 3회 세척한 후 상층액 은 버 리 고 pellet에 1m}의 goat-anti human IgG, alkaline phosphatase conjugate를 각 tube에 넣 고，

실온에서 하룻밤 방치했다. 다음 날 생리식염수로 세 번 세 척 한 다음 o .05M sodium carbonate buffer

(pH 9.8) 에 PNP를 1mg/ml이 되 도록 용해 시 키 고，

각 tube에 1ml씩 가했다. 실온에서 20분 동안 반응 시 킨 후 3N NaOH _{30μl를 넣} 고 730g, 5분 동안 원 섬분리하여 상층액을 수거했다. 상층액의 흡광도를

Shimadzu UV-visible recording spectrophotomet- er(UV-240) 의 400nm에 서 측정 하였 다 .

이 홉광도 값을 AHGG의 표준곡선에 비교해서 μg of AHGG equivalent/ml로 판독하였 고， 각 검 사는 이중 반복검사로 시행하였다

CD AHGG+Complement (2) AHGG only

@ 단량체 IgG 十 Complement

@ 단량체 OgG) +Complement

@ NHSO: 8) 2.0

AHGGO : 4) +NHS(l : 4)

AHGGO : 4) + Heated-NHS (1 : 4) 7S IgG(Commercial, 1: 4) +NHS(l : 4) 7S IgG(Column 통과， 1 : 4) + NHS(l : 4) NHS(1 : 8)

1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

g다응현 “어 ωυ다여〔연。m끄려

0.3 듀는스~

7.5 31. 25 125 500

μg of AHGG equivalent/ml Fig. 1. Raji cell ELISA의 특이 성

구분하여 실험하였다.

이때 AHGG와 NHS은 각각 1:4로 희석하였으며 conjugate는 1 : 1000, PNP는 1mg/ml로 조절 하여 실험하였다. 그 결과 Raji 세포 효소 면역 활성도는 세포수 (C3b 수용체)가 증가함에 따라 증가하였으나 가장 좋은 용량 반응곡선을 보이 는 2 x 10⁶ cells/ ml

를 적정수로 정하였다 (Fig.4).

AHGG와 NHS의 희석배수를 1 : 1 에서 1 : 16으로 희석시켜 최종 희석배수가 1:2에서 1 : 32가 되도록 하여 반응시켰다 (Fig.2) .

125μg AHGG

3 1. 25μg AHGG

15μg AHGG

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Concentration of NHS Fig. 3. AHGG 농도와 NHS(C')

농도에 따른 반응억제 효파

2.0

Fig. 2. AHGG와 NHS의 희석배수에 따른 결합능

이 때 Raji cell은 2 X 10⁶ cells/tube, conjugate는 1 : 1000, PNP는 1mg/ml로 하였 다 . 그 결과 최 종 희석배수가 1 : 4일 경우가 가장 좋은 용량 반응곡션 을형성하였다. NHS는농도가높을때， 즉최종희 석배수가 1 : 2 일 때 반응곡선이 고원현상을 이루어 반응억제 효과를 보여주는 것으로 생각되었다.

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0.1

31.25 125 500

μg of AHGG equivalent/ml Fig. 4. Tube당 사용된 Raji 세포수에 따른 결합능

5) Conjugate(anti-!gG conjugated with alkaline phosphatase) 의 희 석 배 수에 따른 철합농

혈액 중 면역복합체를 이루고 있는 면역글로부런 에 대 해 anti-IgG conjugated with alkaline phosphatase를 반응시 켜 혈액 증 면 역 복합체 의 양 을 가장 정확하게 측정할 수 있는 최적조건을 찾기 위 해 conjugate를 1 : 500, 1: 1000, 1 : 2000으로 희 석하여 반응시켰다. 그 결과 NHS을 첨가한 AHGG 의 Raji 세 포 효소 면 역 활성 도는 conjugate의 농도 3) AHGG 농도와 NHS 농도에 따른 반용억제

효과

수용체에 대해 보체를 포함한 면역복합체와 보체 (유리 C3 -Czb) 가 경쟁반응을 함으로써 반응억제 효과를 나타내는지를 관찰하기 위해 다음과 같이 낮 은 농도의 AHGG와 높은 농도의 AHGG를 NHS

(C') 즉 신선 인혈청의 농도별(1 : 1 에서 1 : 64) 로

실험을 하였다.

이 때 Raji cell는 2 X 10⁶ cells/tube, conjuate의 희 석 배 수는 1 : 1000, PNP는 1mg/ml이 되 게 하였 다. Fig.3에서 보는 바와 같이 AHGG의 농도가 낮 을 때 31.25μg/ml 이하는 1:4로 희석된 NHS와 반 응하여 최대값의 O.D.(흡광도)를 보이다가 1 : 2보 다 원액에 가까운 NHS와는 O.D. 값이 낮은 반응 억제 효과를 보였다. AHGG의 농도가 높을 때 (125 μg/ml)는 1 : 1의 NHS에서도 반응 억제 효과를 보 이지 않았다.

7.5

4) Tube당 사용된 Raji cell에 따른 철합농 Tube당 사용된 Raji cell에 따른 면 역 복합체 의 결 합능을 보기 위해서， tube당 세포의 수를 4단계로

f도#갓___.

가 높을수록 증가하는 양상을 보였다 (Fig.5) .

6) Substrate (p-nitrophenyl phosphate,

PNP) 반웅시간에 따른 반웅양상

기질 (PNP) 의 반응시간에 따른 반응양상을 보기 위해 PNP(lmg/ml in coating buffer) _{1ml를 가한} 다음 실온에서 기질의 반응시간을 15분， 20분， 30 분， 1시간 동안 반응시켰다. Fig.6에서 보는 바와 같이 기질의 반응시간에 따라 비례하는 Raji 세포 효소 면역 활성도를 나타내었으나 기질의 반응시간 이 20분， 1시간에서 좋은 용량 반응 곡선을 형성하 였다.

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1 : 500

Fig. 5. Conjugate의 희 석 배 수에 따른 결합능

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1시간 후 30분 후 20분 후

듣뜨~15분후

7.5 31.25 125 500

μg of AHGG equivalent/ml Fig. 6. Substrate (PNP) _반응시 간에 따른 반응양상

7) Raji cell incubation시 반용은도에 따른 철과

4⁰C 이하에서 침전을 일으키는 cryoglobulin의 성 질이 있는 혈액 중 면역복합체가 4⁰C 이하에서 응집 을 일으켜서 세포상의 보체 수용체와 보다 효과적인 반응 양상을 보이는지를 관찰하였다. 보체를 포함한 혈액 중 면역복합체와 Raji 세포의 보체 수용체의 반응온도를 36.5⁰C, 실온 (25⁰C) ， 4⁰C 로 실험하였고 또 모든 반응 단계를 4⁰C 에서도 시켜보았다. Fig.7 에서 보는 바와 같이 온도에서 따른 양상에는 큰 차 이를 보이지 않았으나 모든 단계를 4⁰C 에서 실시한 경우가 다른 용도에 비해 다소 낮은 활성도를 보여 주었다.

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1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.1

7.5 31. 25

4⁰C 36.5⁰C R.T.

125 500

μg of AHGG equivalent/ml Fig. 7. Raji cell incubation시 반응온도에 따른 결과

8) Raji cell ELISA"협의 최쩍 조건상에서의 반웅양상

위의 반응조건들과 반응양상을 종합하여 Raji cell

ELISA법의 최적 조건을 AHGG와 NHS의 희석배 수는 1 : 4로， Raji cell 수는 2 x 106 cell/ml로，

conjugate의 희 석 배 수는 1 : 1000, 기 질 (PNP) _{의 반}

응시간을 20분으로 보체를 포함한 면역복합체와

Raji cell의 반응온도는 4⁰C 로 조절 한 뒤 Raji cell

ELISA법을 실시하여 Fig.8과 같은 표준곡선을 얻 었다. 이 표준곡선에 준하여 검체의 혈액 중 면역복 합체를 정량하였다.

9) Raji cell ELISA법 의 찌 현성

상기와 같은 최적조건으로 검사할 때 Raji cell ELISA _{법 의 검 사} 간 변 이 계 수 (coefficient of variation) 는 환자군과 정 상군에 서 각각 21.12% 및 5.25% 의 값을 나타내었고， 검사내 변이계수는 환자 군파 정상군에서 각각 6.65% 및 3.66% 의 값을 나 타내었다.

49(p<0.0001), Raji cell RIA 법 파 Raji cell ELISA법 의 상관계 수는 0.63(p<0.0001) 으로서 통 계학적으로 의의있는 상관관계를 보였으나 고상 C1

q ELISA법 파 Raji cell ELISA법 , Raji cell RIA법 간의 상관성 에 비 해 Raji cell ELISA법 과 Raji cell

RIA법간의 상관성이 훨씬 높은 양상을 보였으며 통 계학적으로 유의하였다.

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같 0.8

임 0.7

늦 0.6

요 0.5

럭 0.4

흔히 자가 면역성 질환자의 혈액 중에 존재하는 면역복합체는 항원에 특이한 것이 아니고 항원， 항 체복합체 자체도 비특이적이기 때문에 어떤 특수한 질환의 진단 및 병태생리를 구명할 수 없음이 밝혀 져 있다. 그러나 면역복합체가 지난 생물학적 특성 으로 인해 질환에서의 병태 생리기전을 추정할 수 있으며 특히， 임상적으로 몇 가지 질환의 예후 및 경 파관찰에 유용하게 사용될 수 있음이 이미 알려져

있다 3)

이러한 혈액 중 면역복합체의 측정을 위한 검사방 법은 여러 가지 방법들이 보고2，3，8)되어 있고， 검사방 법에 따라 같은 검체 내에서도 그 결과는 다양하게 나타나는데 2，3) 그 이유는 검사방법에 따라 검출되는 혈액 중 면역복합체가 검사법의 원리와 민감도에 따 라 다르기 때문이라고 한다1)

본 실험에서는 현재 사용하고 있는 고상 C1q ELISA법 파 병 행 하여 Raji cell법 을 개 발하고자 하 였다 .AHGG와 NHS의 희석배수， Raji cell 수，

conju gate 희 석 배 수， PNP의 반응시 간， 반응온도 등 각 실험요인의 최적조건을 결정하여 Raji cell의

C3 b receptor의 결합능을 이용한 Raji cell ELISA

법 6)을 개발하여 보았고， 정상 대조군과 자가 면역질 환자군의 혈청에서 실제 면역복합체를 측정하였다.

Raji cell은 IgG가 응집되거나 면역복합체를 이루어

보체를 포함할 때만 특이적인 반응도를 나타내었고 단량체 IgG와는 농도에 무관한 곡선을 나타내 어 혈

IV. 고 찰 31.25 125 500

μg of AHGG equivalent/ml Fig. 8. Raji cell ELISA법의 optimum

condition 상에 서 의 반응양상 7.5

0.1

2. 대조군과 환자군의 면역복합체 측정걸과

1) 째 가지 방법 (Solid-phase Cl q ELISA, Raji cell RIA, Raji cell ELISA) 으로 측 정한 대조군과 환자군의 혈액 중 면역복합체 치 철과치

세 가지 측정방법에 따른 대조군과 환자군의 혈액 중 면역복합체치는 고상 C1q ELISA법에서 mean::t

SD는 대조군은 10. 3::t5. 0, 환자군은 89. 3::t 105.

l(t= -7.25, p<O.OOOl), Raji cell RIA법에서 대 조군은 16. 3::t5. 0, 환자군은 118. 5::t 140. O(t= -5.

83, p<O.OOOl), Raji cell ELlSA법 에 서 대 조군은

11. 7::t 5 . 0, 환자군은 195.5::t257.5(t= -5.84, p<

0.0001) 로서 세 방법 모두에서 대조군에 비해 환자 군의 혈액 중 변역복합체치가 높아 통계적으로 유의 한 차를 보였 다 (Table 1).

2) 셰 방법간의 상판성

정상군 100예와 환자군 100예의 결과치로 세 방법 간의 상관성을 보았을 때 C1q ELISA법과 Raji cell ELISA법의 상관계수는 0.34(p<0.0001), 고상 C1

q ELISA법 파 Raji cell RIA법 의 상관계 수는 O

Table 1. 측정방법에 따른 혈중 내 면역복합체 결과치

Patients (mean::tSD) Control

(mean::tSD) P value

C1q Raji Raji

.000 .000 .000 t-value

-7.25 -5.83 -5.84 89. 3::t 105.1 *

118.5::t 140.0 195.5::t257.5

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100 20 100 Method

ELISA RIA ELISA

* ^μg of AHGG equivalent/ml

액 줌의 IgG에는 큰 영향을 받지 않는 반응양상을 보였다. 이 결과는 다른 보고자들의 결과와 일치했 으며 또한 이 등4)과 Theofilopoulo 등 12 ， 13) 에 의 하면 보체의 결함은 변역복합체의 크기에 따라 민감하게 활성도가 변화되며 그 크기에 비례한다고 하였다.

즉， 혈액 중 면역복합체의 대용물로 표준곡선에 필 요한 AHGG는 검사의 정확도 및 재현도를 좌우하는 가장 중요한 요소로서 그 농도 및 응접정도가 일정 하게 유지되어야 함이 중요하다. 본 실험에서는

63⁰C 에 서 30분간 응접 후 Sephacryl S-300 column

에 통과시켜 IgM 구역에 해당하는 응접된 IgG 분획 만을 모아 Lowry법 으로 농도를 측정 한 후 분주하 며 -70⁰C 에서 보관했다가 사용하였으며， 보관 2개 월 이후부터는 서서히 그 활성도가 떨어점을 관찰할 수 있었다. 이 등3，4)파 James 등9) 이 제작 후 6주 혹 은 3개월까지 그 활성도가 유지됨을 보고한 것과 비 슷하였으나 앞으로 AHGG의 제작， 농도측정， 활성 도 유지， 크기에 따른 반응도 등에 대한 보다 많은 연구를 하여 실험의 정확도와 재현성을 높임이 중요 하다고 생각된다

Theofilopoulos _{등 12)에 의 하면} Raji cell 표면 에 는

C3-C3b^, Fc, C3d, C1q 등에 대 한 수용체 를 갖고 있 는데 이들 수용체와 보체를 함유한 면역복합체가 반 응할 때 IgG Fc 수용체 보다는 보체 수용체 를 통한 반 응이 8배나 더 잘 일어난다고 하였다. 이는 IgG Fc

수용체보다 보체수용체들이 더 많이 존재하거나

IgG Fc수용체보다 보체수용체가 결합친화력이 더 높기 때문이라고 하였다.

본 실험에서는 혈액 중 보체 각각에 대한 수용체 별로 조사는 하지 않았으나 AHGG와 NHS을 함께 반응시켰을 때만 특이적인 반응도를 보이는 것으로 보아 Raji cell ELISA법 에 서 보체 가 있 어 야 함을 시 사해 주었다.

AHGG의 저 농도 (31. 25μ g/ml 이 하) 에 서 NHS의 희석배수가 1:4 일 때 O.D. (흡팡도) 값이 최대값을 보이다가 그 이하에서는 감소하였다. 이는 대량의 보체에 의한 억제효과인 것처럼 생각되었다. 즉， 대 량의 C3^-C3^{b가 그 수용체 와 반응하고 남았거} 나 다시 면역복합체에 의해 C3^{가 C}3b로 만들어 질 때 C3^b가

C3b를 포함한 면역복합체와 경쟁반응을 하거나 유 리 C3^-C3^{b가 C}3b를 포함한 면역복합체에 비해 업체 화학적 방해를 덜 받아 유리 C3^-C3^{b가 그 수용체와} 경쟁적으로 보다 잘 반응하는 것을 나타낸다고 생각 된다.

환자군에서의 검체는 자가면역성 질환자들의 혈 청을 사용하였다. 이들 환자들의 면역복합체가 cryoglobulin이 라는 첨 에 착안하여 반응온도를 고려

하여 실험한 결과 별 차이를 보이지 않았고 모든 반 응단계의 온도가 4⁰C 에서 다소 낮은 반응양상을 보 였는데 이는 면역복합체의 모델로 임의로 만든 AHGG를 사용하였 기 때 문에 cryoglobulin의 특성 을 가진 검체들의 실제적인 반응양상으로 볼 수 없 으며 이에 대한 연구를 좀 더 해봄이 타당하다고 생 각된다.

Raji cell ELISA실험에서 가장 큰 제한점은 세포 면역반응에서의 오차가 다소 큰 점인데 본 실험에서 나타난 바와 같이 검사간 변이계수 13.19%, _검사내 변이계수 5.16% 로서 검사 내 변이계수보다 검사간 변이계수가 좀 더 심한 듯하였다.

방법상의 상관성을 보았을 때 Raji cell ELISA법 파 Raji cell RIA법 의 상관 계 수가 0.63(P<0.0001)

으로 다른 방법간의 상관계수보다 높은 점파 C₁q ELISA법 에 서 음성 인 검 체 들이 Raji cell ELISA법 에서 양성을 보인 경우나 또는 그 반대의 경우도 있 었는데 이것은 면역복합체의 구성성분의 차이와 검 사방법의 원리와 민감도 등의 차이에기인하는 것으

로 생각되었다 1 ，2)

V. 결 론

Raji cell을 이용하여 방사성 동위원소 노출의 위

험이 없는 Raji cell ELISA법을 개발하고자 실험하 여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. Raji cell ELISA법의 최적조건은 AHGG의 희 석배수 1:4와 NHS의 희석배수 1 : 4, Raji cell 수 는 2 X 1Q6cells/ ml, conjugate의 희 석 배 수 1 : 1000,

기질인 PNP 반응시간 20분， 검체와 Raji cell 반응 온도를 4⁰C 로 조절했을 때 가장 좋은 반응 양상을 보 였다

2. Raji cell ELISA 법의 검사간 변이계수는 13.

19% 이었고， 검사내 변이계수는 5.16% 이었다.

3. 정상대조군에서 혈액 중 변역복합체치는 mean ::t SD가 고상 C1q ELISA법에서 10.3 ::t 5.0μg

of AHGG equivalent/ml, Raji cell RIA법 에 서 16.

3 ::t 5.0μg of AHGG equivalent/ml 이었고， Raji cell ELISA 법 에 서 는 11.7 ::t 5.0μg of AHGG

equivalent/ml 이 었 다 (p< 0.0001) .

4. 홍반성 낭창 환자 등 자가면역성 질환군에서 혈액 중 면역복합체치는 mean ::t SD가 고상 C1q ELISA법에서 89.3 ::t 105.1μg of AHGG equivalent Iml, Raji cell RIA법에서 118.5 ::t 140.0μg of AHGG equivalent/ml, Raji cell ELISA법 으로는 195. 5::t257. 5μg of AHGG equivalent/mI로서 정 상 군에서 보다 통계학적으로 의미있는 높은 결파치를

..!i!..~t:-}(p<0.0001).

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~7-114-i::- 0.34(p<0.0001)~ lft:-}l.Jl~.£.n:1, .JlAJ C1 q ELISA t{j oJ1 i::- Raji cell RIA t{j .9-l AJ~7-114-i::-

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Development of Raji cell ELISA Method for Detecting Circulating Immune Complexes ( CIC)

Rim, T.S, ·Lee, E.M, *

Dept. of Central Research Laboratory, College of Medicine, Yonsei University Dept. of Immunology Laboratory of Surgery, College of Medicine, Yonsei University*

ABSTRACT

There are various kinds of circulating immune complexes(cic) and we have a number of methods of measuring them. However, any of them can not alone measure cic correctly, usually two or three methods are combined to be applied.

Currently, in the immunological laboratory, the solid-phase Clq ELISA (Enzyme Linked Immuno -sorbent Assay) which uses a component of the complement system(C1q) is commonly used, but in an effort to more correctly measure cic, anothe- r kind of ELISA using Raji cell was experimented.

To be more specific, optimum conditions were put forward synthesizing the reaction factors of the Raji cell ELISA and based on those conditions, cics of the autoimmune disease patients and the normal control group were measured with the three methods (Raji cell ELISA, Raji cell RIA and Clq ELISA).

Following results were obtained.

1. The optimum conditions of the Raji cell ELISA which displayed the best standard curve were ; 1 : 4 dilution ratio of AHGG. 1 : 4 dilution ratio of NHS, 2 X l0⁶cells/ml of Raji cell numbers-

• 1 : 1, 000 dilution ratio of conjugate, 20minutes of substrate (PNP) reaction time and 4•c reaction

temperature of sample and Raji cells.

2. The coefficient (C. V.) variation of interass- ays of the Raji cell ELISA was 13.19%, which that of intraassay was 5.16%.

3. For the normal control group the mean of cic levels was 10.3±5.0(mean±S.D),ug of AHGG equivalent/ml with the Raji cell RIA and 11. 7±5.

O,ug of AHGG equivalent/ml respectively.

4. For the autoimmune disease patient group, the mean of cic levels was 89. 3 ± 105 .l(mean ± S.

D.) ,ug of AHGG equivalent/ml with. the solid -phase C1q ELISA, 118.5±140.0,ug of AHGG equivalent/ml with the Raji cell RIA and 195. 5±

257. 5,ug of AHGG equivalent/ml with the Raji cell ELISA, all of which showed higher levels of cics than the normal control group significantly.

5. It was also revealed that correlation between the solid-phase Clq ELISA and Raji cell ELISA was 0.34(P<0.0001), while the correlation betw- een the solid-phase C q ELISA and the Raji cell RIA and between the Raji cell RIA and the Raji cell ELISA were 0. 49 (P < 0. 0001) and 0. 63 (P < 0.

0001) respectively.

Summing up, the optimum condition of Raji cell ELISA is established, and in order to more correc- tly measure the cic levels, the principle of measur- ement and the sensitivity of the tests should be

considered. In this regard, the combined use of the solid-phase Clq ELISA and the newly-experi-

mented Raji cell ELISA is believed to be more effective than single C1 q ELISA .

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