Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody 슬라이드 간편 준비법
원동일
경북대학교병원 진단검사의학과
A Simple Method to Prepare Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody Slides
Dong Il Won
Department of Laboratory Medicine, Kyungpook National University Hospital, Daegu, Korea
Background: Neutrophils fixed on a slide are used in indirect immunofluorescence assay (IIF) for anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA). A simple method to prepare ANCA slides is described in this report.
Methods: This method uses an overlay method to separate WBC from EDTA whole blood and OctospotTM kits to cytocentrifuge WBC onto 8-well slides. This in-house ANCA IIF was compared with commercial ANCA IIF using 40 sera, and with enzyme linked immunosorbent assay for anti-myeloperoxidase (MPO) antibody (MPO ELISA) using 117 sera.
Results: In ANCA IIF parallel tests using 10 positive and 30 negative sera, in-house slides were in good qualitative agreement, 97.5% (39/40) with commercial kits (κ = 0.93). Fluorescence pattern and intensity of positive reaction was also highly concordant between two methods. In MPO ELISA positive cases, the positivity rate of in-house ANCA IIF was 97.8% (45/46), which accounts for its assay sensitivity for the presence of anti-MPO antibody.
Conclusions: In-house ANCA slides was convenient and cost-efficient to be prepared. As these slides were found to have acceptable agreement and sensitivity as compared with commercial kits, in-house ANCA IIF is considered to be useful to screen ANCA in combination with MPO ELISA in routine clinical laboratory practice.
Key Words：ANCA, Neutrophil, Slide
교신저자：원동일
우) 700-721 대구 중구 삼덕동2가 50번지 경북대학교병원 진단검사의학과
전화：053)420-5291, 팩스：053)426-3367 E-mail：[email protected]
서 론
혈관염(vasculitis)이 처음 발생하는 장기는 매우 다양 하며, 신장 및 폐, 상기도 등의 장기가 가장 흔하다. 특발 소혈관혈관염(idiopathic small-vessel vasculitides, SVV) 중 신장에 국한된 괴사성 SSV가 국소괴사사구체신염(focal necrotizing glomerulonephritis)이다. 항호중구세포질항 체(anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA)는 SSV의 진단에 유용한 자가항체로서, 표적 항원은 proteinase-3 (PR3), myeloperoxidase (MPO), elastase, lactoferrin, lactoperoxidase, lysozyme,
azurocidine, cathepsin G 등이다[1].
ANCA 검출을 위한 indirect immunofluorescence assay (IIF)는 슬라이드(slide) 표면에 고정시킨 호중구 (polymorphonuclear leukocyte, PMN)를 기질로 이용 한다. 역사적으로 보면, 1960년대 중반에 류마티스관절염 환자에서 PMN을 사용하여 granulocyte-specific anti- nuclear antibody (Ab) 즉, GS-ANA를 검출하는 기법이 도 입되었다[1]. 1989년 Wiik이 ANCA 검사 표준법을 제시하였 고[2], 1993년부터 수차례 열린 국제 학회에서 ANCA 검사 표준화에 대한 합의가 있었다[3-6].
ANCA 검사를 위하여 과거 국내에서도 ANCA slide를
자가제조 하였으나[7-9], 현재 대부분의 검사실에서 상용
키트를 사용하고 있다. 간편하게 ANCA slide를 준비하는
방법으로서, 1990년 전혈을 slide위에 응고시켰다가 제거
한 다음 부착되어 있는 WBC를 이용하는 방법이 제시되기
도 하였으나[10] 많이 이용되지는 않았다.
Table 1. Comparison of two methods to separate WBC
Sedimentation method (standard) Overlay method (simple)
1. A 10 mL volume of blood is defibrinatied with glass beads.
2. The defibrinated blood is thoroughly mixed with 250 IU of heparin.
3. Aliquots of 2 mL are layered onto 5 mL dxtran-sodium diatrizoate gradients in 10 mL tubes.
4. These are left at room temperature for 45 min for sedimentation of erythrocytes.
5. The WBC containing plasma layers are combined in a 10 mL tube.
6. Wash × 3 with 1% human serum albumin in PBS.
1. 500
L of EDTA blood is carefully overlaid onto 1 mL of Histopaque
®-1077 in a 2 mL microcentrifuge tube.
2. The tube is left motionless for 20 min at room temperature for sedimentation of erythrocytes.
3. The top 250
L of WBC containing plasma is carefully aspirated.
4. Wash × 2 at 140g and × 2 at 340g in order to remove platelets with PBS.
이 보고에서, 먼저 간편하게 ANCA slide를 준비하는 방법을 소개하고, 이 자가제조 ANCA IIF를 상용 ANCA IIF 키트 및 anti-MPO Ab에 대한 enzyme linked immunosorbent assay (MPO ELISA)와 비교하였다.
ANCA IIF의 ‘권장 표준법’이란 Wiik이 참고문헌 1에서 기술한 방법을 지칭한다.
1. 대상
기질로 사용할 WBC는 건강검진을 목적으로 방문하여 이를 기증하기로 동의한 건강인에서 얻었다. 통상 혈액검사 를 마치고 버려질 EDTA 혈액을 사용하였다. ANCA IIF 에서, 자가제조와 상용 키트간 병행검사를 위하여 상용키트 로 양성과 음성으로 판정된 10검체, 30검체를 각각 이용하 였다. ANCA IIF와 MPO ELISA와의 상관성을 비교를 위하여, 2007.10.24부터 2010.1.2까지 주로 신장내과나 류마티스내과 환자중 두 검사를 모두 시행한 234건을 대상 으로 결과 기록 후향분석하였다.
2. ANCA slide 준비, 염색 및 판독 1) WBC 분리 및 세척
O형의 건강인에서 채취한 EDTA 혈액에서 Table 1에 기술된 overlay 방법으로 WBC를 분리하였다(Fig. 1-A).
분리한 상층 혈장의 WBC를 phosphate-buffered saline (PBS) 3 mL로 총 4회 세척하였는데, 혈소판을 제 거하기 위하여 differential centrifugation을 하였다. 즉, 처음 2회는 140g에서 6분 원심분리하여 상층을 버리면 혈소
(coating)으로 구분되어 있는 Octospot 키트(Fig. 1B) 를 이용하였다. WBC 부유액을 8-well strip에 30 µL/well씩 분주하였다(Fig. 1C). Strip을 holding block 에 끼우고, 그 위로 filter card와 8-well slide를 well 위 치에 잘 맞게 포개어 맞대고, 이를 Cytoclip에 끼웠다(Fig.
1D). 이 Cytoclip들을 Shandon Cytospin cytocent- rifuge에 장착하여 1,500 rpm으로 10분 원심분리하였다 (Fig. 1E, 모두 Thermo Fisher Scientific Inc.). 실제 cytocentrifugation전 먼저 PBS 50 µL/well 분주후 원 심분리하여 filter card를 미리 적셔 주어 세포 부착이 잘 일어나도록 하였다.
3) 건조 및 고정
건조 자체만으로 고정의 역할을 하므로, 원심후 세포 형 태를 유지하기 위하여 신속히 공기 건조시켰다. 실온에서 선풍기를 이용하여 60분 건조시켰다.
Slide를 미리 4°C로 냉장한 99% ethanol (Duksan Pure Chemicals Co., Ansan, Korea)에 담그고, 냉장고 로 옮겨 15분간 고정하였다.
4) 냉동 및 해동
고정한 slides를 방습처리하여 -20°C 혹은 -80°C에 냉
동 보관하였다. 검사 직전, slide를 냉동고에서 꺼내어
37°C에서 15분간 해동하였다. 해동시 일부 핵내 항원이 세
포질 혹은 세포밖으로 이동하기도 한다.
Fig. 1. In-house preparation of ANCA slide. A) Overlay method to separate WBC. B) Octospot kit:
holding block, 8-well strip, and 8-well slide from the above. C) Washed WBC suspension is aliquoted into each well of the strip. D) The strip is inserted in its holding block. A filter card and a slide are applied upon the strip. They are altogether combined with a Cytoclip. E) Cytoclips are installed to a Cytospin centrifuge. F) Staining using an automated IIF processor.
5) 염색
양성 대조로서 보관중인 이전 P- 및 C- ANCA 양성 검 체를, 음성 대조로서 건강인 검체중 젊은 남자 혈청을 사용 하였다. 이차항체인 anti-IgG FITC로서 rabbit antihu- man IgG, polyclonal γ-chain specific F(ab’)
2fragment (Catalog No. F0315, Dako, Glostrup, Denmark)를 사용하였다.
IIF processor인 PhD
™(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 염색 과정을 자 동화하였다(Fig. 1F). 이를 위하여, PhD 구동 소프트웨어 에 Octospot slide의 규격을 미리 입력하고, 염색 과정은 Bio-Rad ANCA IIF 염색 과정과 유사하게 설정하였으나, 선별검사를 위한 혈청은 1:10 희석하였고, Evans blue counterstain은 생략하였다. 간단히 기술하면, 희석 혈청 을 45 µL/well을 분주하여 30분간 반응시킨 후, PBS 450 µL/well로 세척하고, anti-IgG FITC를 PBS에 1:20으로 희석하여 45 µL/well을 가하여 20분간 반응시 켰다. 다시 세척후 각 well에 mounting medium (2:1 glycerol-PBS 혼합)을 떨어뜨린 후 Octospot 전용 cover slip을 덮었다.
6) 판독
형광 현미경은 Nikon M60 (Nikon, Tokyo, Japan) 본체에 100 W 수은등을 광원으로 하여 WIB cube
(450-490 nm의 여기필터(excitation filter), 505 nm의 이색성 반사경(dichroic mirror) 및 520 nm 선택필터 (barrier filter)를 사용하였다. 10배 접안렌즈와 20배 대 물렌즈로 관찰하였고, 필요한 경우 pattern을 확인하기 위 하여 40배 대물렌즈도 사용하였다.
두 전문가가 각각 판독후 종합하여 판정을 결정하였다.
ANCA 양성 판정인 경우, 그 형광 강도에 따라 ± (약양 성), 1+, 2+, 3+, 4+의 5단계로 등급화하여 판정하였 다. 단계 구별은 임의적일 수 밖에 없으나, 가능하면 역가 를 반영하도록 등급 결정 요령을 숙달하였다. 예를 들면, 3+이면 예상 역가는 선별(1:10)의 3단계 이배수 희석인 1:80이다. PMN은 물론 모든 림프구에도 핵 혹은 핵주변 반응이 보이는 경우, ANA이거나 ANCA와 ANA의 병존 가능성을 배제하지 못함(‘not determinable’)으로 판정하 였고, formalin 고정 ANCA slide는 사용하지 않았다.
3. 상용 키트를 이용한 검사
상용 ANCA IIF 키트는 Complete ANCA Kit With Ethanol Fixed Slides (Bio-Rad)를 제조사의 지침대로 사용하였으며, 선별검사를 위한 혈청은 1:20 희석하였다.
PhD를 사용하여 염색하였다. MPO ELISA 혹은
anti-PR3 Ab ELISA (PR3 ELISA)는 수탁 전문 기관인
삼광의료재단(Samkwang Medical Laboratories,
Seoul, Korea)이나 서울의과학연구소(Seoul Clinical
(A) anti-MPO Ab containing serum (B) ant-dsDNA Ab containing serum
Anti-MPO Ab 1,933 AAU/mL Anti-MPO Ab 135 AAU/mL
Anti-PR3 Ab 107 AAU/mL Anti-PR3 Ab 80 AAU/mL
Antinuclelar Ab IIF Negative Anti-dsDNA Ab 505 IU/mL (Normal < 7) Fig. 2. Comparison of WBC staining pattern between anti-MPO Ab and anti-dsDNA Ab. A) Typical peripheral staining of PMN nuclei and the nucleus of an adjacent lymphocyte, especially, the side facing neutrophils, while a more distantly located lymphocyte is not stained. B) Typical peripheral staining of all leukocyte nuclei by serum containing anti-dsDNA Ab (×200, anti-IgG FITC stain).
JWP P-ANCA 2+ P-ANCA 1+
IBK P-ANCA 1+ P-ANCA 2+
SKP P-ANCA ± Negative (±, Negative)
†control C-ANCA 4+ C-ANCA 3+
GOL C-ANCA 1+ C-ANCA 1+
*Thirty negative sera by Bio-Rad IIF kits were also all negative by in-house slide. Overall, two methods were in good qualitative agreement, 97.5% (39/40) ( κ = 0.93).
†
Determinations of two experts
Laboratories, Seoul, Korea) 검사실에 의뢰하였다. 두 검사실 모두 Myeloperoxidase 혹은 Proteinase 3 IgG ELISA Test System (ZEUS Scientific, Inc., Raritan, NJ, USA)을 사용하였으며 임계치는 두 검사 모 두 150 AAU/mL이다.
결 과
1. 권장 표준법에서 개선
1) WBC 분리 방법 개선
Table 1에 권장 표준법과 간편 방법을 비교하였다.
Overlay 방법은 Histopaque
®-1077 (Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA)을 사용하여 EDTA 전혈로부터 간
편하게 WBC를 분리할 수 있었다. PMN만 따로 분리할 필
요없이 WBC 전체를 이용하는 것이 좋다. 혈액중 WBC 수
는 건강인간 큰 차이가 없으므로, 각 well에 분배되는
WBC 수가 적정하게 되는 술식을 한번 확립했으면 WBC
부유액의 세포 농도를 조정할 필요는 없었다.
Table 3. Positivity rates of ANCA ELISA (> 150 AAU/mL) according to ANCA IIF scores by each ANCA slide Negative
ANCA IIF
Positive ANCA IIF score, regardless of their fluorescence patterns
± 1+ 2+ 3+ 4+ PPV*
For anti-myeloperoxidase Ab ELISA In-house slide 3.1%
(1/32)
15.4%
(2/13)
57.7%
(15/26)
45.0%
(9/20)
62.5%
(5/8)
77.8%
(14/18)
52.9%
(45/85) Bio-Rad IIF kit 0.0%
(0/12)
10.0%
(1/10)
15.4%
(4/26)
57.1%
(12/21)
52.9%
(9/17)
93.5%
(29/31)
52.4%
(55/105) For anti-proteinase 3 Ab ELISA
In-house slide 3.2%
(1/31)
10.0%
(1/10)
5.3%
(1/19)
7.7%
(1/13)
12.5%
(1/8)
27.3%
(3/11)
11.5%
(7/61) Bio-Rad IIF kit 10.0%
(1/10)
16.7%
(1/6)
9.1%
(1/11)
14.3%
(1/7)
0.0%
(0/9)
20.0%
(1/5)
10.5%
(4/38)
*Positive predictive value (PPV) of ANCA IIF (including weak positive, ±) for positive ANCA ELISA.
Fig. 3. MPO ELISA results (cutoff 150 AAU/mL) according to ANCA IIF scores. Comparison between in-house slides and Bio-Rad IIF kits was performed using different samples of different periods (N = 117 and 117, respectively). Horizontal bars represent median values in each ANCA IIF score. See Table 3.
Abbreviation: Neg, negative.
2) 판독시 장점
Bio-Rad IIF 키트에서는 일부러 순수 PMN만 부착되 어 있으나, 이는 오히려 정확한 판독을 저해한다. 본 방법 에서는 전체 WBC를 slide에 부착시키므로, PMN외 림프 구에 대한 반응을 참조하여 ANA와 ANCA를 구별하는데 도움이 되었다. 즉, 두 항체 모두 PMN 핵에 반응을 하나, ANA는 림프구 핵에도 반응하고, ANCA는 그렇지 않다.
주의해야 할 것으로서, 림프구가 PMN 근처에 위치하면 고 정시 PMN MPO에 오염되어 ANCA도 반응할 수 있다 (Fig. 2). 또한, ANA라도 PMN으로 부터의 거리와 무관 하게 일부 림프구에만 반응하거나 림프구보다 PMN 핵에
더 강하게 반응할 수 있다.
3) 비용 절감
ANCA slide를 준비하기 위한 Octospot 키트의 소모품 중 8-well strip과 slide는 세척하여 재생이 가능하고, filter paper 등도 여러 번 쓸 수 있으므로, 초기 구입 비 용을 제외하면 상용 키트에 비하여 검사 비용을 절감할 수 있다.
2. 상용 키트와 결과 비교 1) 두 ANCA slides 병행 검사
자가제조 slide와 Bio-Rad IIF 키트의 병행 검사를 위 하여, Bio-Rad IIF 키트를 기준으로 양성인 10 혈청과 음성 인 30 혈청을 이용하였다(Table 2). 정성 판정의 일치율 은 97.5% (39/40)로 우수하였다(κ = 0.93, 약양성은 양 성으로 간주). 즉, ANCA 음성인 30 혈청 모두 자가제조 slide로도 음성이었고, ANCA 양성 10 혈청들에서 두 방 법간 양성 반응의 형광 양상이나 강도는 잘 일치하였다.
Bio-Rad IIF 키트 약양성이나 자가제조 slide 음성인 경 우가 1례 있었는데, 자가제조 slide의 두 판독자의 결과는 각각 약양성, 음성이었다.
2) MPO ELISA와의 비교
ANCA에 대한 병원 통상 검사로서 ANCA IIF와 더불
어 MPO 혹은 PR3 ELISA도 함께 시행한 경우를 대상으
로 비교하였다. ANCA IIF에 사용할 slide에 대하여 두 시기
로 나누어서, 첫 시기(2007.10.24～2008.05.13)에 Bio-Rad IIF
키트를, 둘째 시기(2008.11.19～2010. 1.2)에 자가제조 slide를
사용하였다. 즉, 자가제조 slide와 ELISA와의 일치율을,
Bio-Rad IIF 키트의 ELISA와의 일치율과 비교하였다(각각
N = 117, 117, Fig. 3, Table 3). 이 조사에서 ANCA IIF 결
과가 ‘음성’ 혹은 ‘양성’으로 판정이 확실한 경우만 조사 대
상에 포함시켰고, ANCA와 ANA의 병존 가능성을 배제하지
100% (55/55)이었다. 자가제조 ANCA IIF 음성이나 MPO ELISA 양성인 1례에서 자가제조 slide의 두 판독자 의 결과는 각각 약양성, 음성이었다.
ANCA IIF 양성인 경우 MPO ELISA 양성일 확률, 즉 양성 MPO ELISA를 위한 ANCA IIF의 양성예측도 (positive predictive value, PPV)에 대하여, ANCA IIF 모든 양성 예(± ～ 4+)에서 두 slide 모두 52% 정도 로 비슷하였다. 그러나, ANCA IIF 1+인 예에 국한한 경 우 자가제조 slide 57.7%, Bio-Rad IIF 키트 15.4%로 두 slide간 큰 차이를 보였다(Table 3).
고 찰
본 보고에서는 간편하게 ANCA slide를 준비하는 방법 을 소개하고, 약 1년간 실제 사용한 결과를 분석하여 이 방 법이 ANCA 선별 검사로서 적합하다는 것을 증명하였다.
또한, 현재 임상에서 ANCA IIF와 ELISA 검사가 각각 선 별, 확인 목적이 아닌, 각각의 위음성, 위양성을 상호 보완 하는 목적으로 병행 실시하는 것이 권장되므로, 본 자가제 조 ANCA IIF는 상용 키트보다 비용 절감 및 결과 판독에 서 더 유리할 것으로 생각된다.
자가제조 slide 음성이나, Bio-Rad IIF 키트 약양성인 경우가 1례는 Sjӧgren 증후군 진단을 받은 73세 여자 환 자로서, MPO ELISA 227 AAU/mL, PR3 ELISA 60 AAU/mL, ANA IIF 약양성(homogeneous pattern), anti-dsDNA Ab 1 IU/mL, 및 anti-SSA Ab 267 AAU/mL (정상<150)이었다. 한 보고[12]에 의하면, 이 질환에서 ANCA IIF와 anti-MPO Ab 양성일 수 있는데 (60예중 각각 10례, 4례), epiphenomenon으로 생각되고 임상적 특성과의 연관성은 없었다고 한다.
ANCA IIF 1+인 예에서 MPO ELISA 양성일 확률은 자가제조 slide가 Bio-Rad IIF 키트보다 훨씬 높았는데 (각각 57.7%, 15.4%), 이것은 Bio-Rad slide에서는 림 프구를 거의 포함하지 않아서 ANA와 구별하기 힘들므로, 낮은 역가의 ANA를 P-ANCA로 오인하는 경우가 많았기 때문으로 생각된다. ANCA IIF와 MPO ELISA의 두 상 용 키트와 비교한 결과를 종합하면, 자가제조 slide는 ANCA 선별 검사로 사용하기에 적합한 것으로 보였다.
권장 표준법에서 채택한 WBC의 분리법은 dextran 침
문제가 없는 것으로 보였다.
Octospot slide를 사용하여 한 slide당 8 well에 cytocentrifugation 하는 것이 가능하였다. 주변 도료막 (coating)으로 원형 well을 마련해야 하는 이유로서, 자동 화 IIF processor가 세척시 그릇 역할을 하여 세척액의 표 면장력을 유지시키며, 형광현미경 판독시 well의 위치를 쉽 게 찾을 수 있게 한다. Cytocentrifugation을 해야 하는 이유는, 원심분리하면서 세포 부유액에서 PBS가 신속히 제 거되고 원심력에 의하여 세포가 넓게 퍼져 부착되어 건조되 므로 판독하기에 용이하기 때문이다. 권장 표준법은 세포 부유액을 직경 1 mm 점적후 즉시 도말하는 방법과 cytocentrifugation 방법중 택일하도록 하고 있다.
권장 표준법이 매우 엄격하여 자가제조시 지키기 힘든 항목이 있는데, 본 간편법을 사용하더라도 이상을 발견한 경우는 없었다. 그러한 예들로서, PMN을 세척하고 부유하 기 위해 1～3%의 인 혹은 우 혈청알부민 PBS를 사용하는 것을 권장하고 있으나, 알부민을 첨가하지 않아도 세포 부 착이나 배경 형광 증가 등 특별한 문제는 없었다. Bio-Rad IIF 키트에서 사용하는 Evans blue counterstain은 하지 않아도 판독시 세포들을 구별하는데 지장이 없었는데, counterstain은 오히려 약양성 ANCA 검체에서 위음성을 초래할 수 있다고 한다[4]. 또한, 본 연구에서 Lock의 보 고[14]에 따라 ethanol 고정을 15분간 하였다. 권장 표준 법은 5분간이지만, 세포막과 과립막의 permeabilization 을 충분히 하려면 15분간 하는 것이 좋을 것으로 생각된다.
본 연구에서 초기 선별용 혈청 희석 배수는 1:10으로 하였 지만 권장 표준법은 1:20이고, 사용하는 이차 항체, 광원 등 검사실 여건에 따라 최적 희석 배수가 다를 수 있다[4].
본 연구에서 환자 혈청과 이차 항체를 위한 최적 희석 배수 는 checkerboard titration 실험에서 결정되었다.
ANA와 ANCA를 구별하기 위하여, 본 연구의 slide에
서 림프구의 반응을 참조하는 것이 도움이 되었고, 이전 서
등의 보고[14]에서 가상 단층분석법으로 절편 영상을 추출
하면 P-ANCA는 핵 주변부에 강한 형광이 나타나고
anti-dsDNA Ab는 핵 중앙부에 강한 형광이 나타나 구별
이 가능하다고 하였다. 또한 Euroimmun사 제품
(Euroimmun AG, Luebeck, Germany)은 PMN
biochip과 Hep-2 세포 biochip의 모자이크를 사용하여 한
well에서 염색과 판정을 함께 하도록 하고 있다. 고전적인
방법으로, ethanol대신 formalin으로 PMN을 고정하면 ANA에 대한 항원성이 감소되므로 구별에 도움이 된다. 그 러나 어느 방법이든 두 항체가 병존하는 경우까지 포함하면 두 항체를 감별하기가 쉽지 않다.
결론적으로, ANCA slide를 간편하게 준비하기 위하여, EDTA 전혈에서 overlay 방법으로 WBC를 분리하였고, WBC 부유액을 8-well slide에 cytocentrifugation 하였 다. 본 자가제조 slide는 ANCA IIF의 기질로서 적합해 보 였으므로, 이 방법은 임상 검사실에서 MPO ELISA와 병 행하여 ANCA 선별 검사에 유용할 것으로 판단된다.
감 사
본 연구와 병원 통상 검사에 사용할 ANCA slide를 자 가제조한 이혜진 MT께 감사드립니다.
요 약
서론: 항호중구세포질항체(ANCA) 검출을 위한 간접면 역형광법(indirect immunofluorescence assay, IIF)에 서 슬라이드 표면에 고정시킨 호중구를 기질로 이용한다.
본 보고에서 간편하게 ANCA 슬라이드를 준비하는 방법을 소개한다.
방법: 본 방법은 EDTA 전혈로부터 백혈구를 분리하기 위한 overlay 방법과, 8-well 슬라이드에 cytocentri- fugation을 하는 Octospot
TM키트를 사용한다. 이 자가제 조 ANCA IIF의 평가를 위하여, 40 혈청에서 상용 ANCA IIF와, 117혈청에서 항myeloperoxidase (MPO) 항체에 대한 효소면역법(MPO ELISA)과 비교하였다.
결과: 10 양성과 30 음성 혈청을 이용한 ANCA IIF 병행검사에서, 자가제조 슬리이드와 상용 키트간 정성 판정 일치율은 97.5% (39/40)로 우수하였고 (κ = 0.93), 양성 반응의 형광 양상이나 강도도 두 방법간 잘 일치하였다.
MPO ELISA 양성인 예에서 자가제조 ANCA IIF의 양성 률, 즉 항MPO항체 존재에 대한 검사 민감도는 97.-8%
(45/46)이었다.
결론: 자가제조 ANCA 슬라이드는 준비하기에 편리하고 비용효율이 높았다. 이 슬리이드는 상용 키트와 일치율 및 민감도가 우수하였으므로, 자가제조 ANCA IIF는 임상 검 사실에서 MPO ELISA와 병행하여 ANCA를 선별하는데 유용할 것으로 생각된다.
참 고 문 헌
