The Types of Extended-Spectrum $\beta$-Lactamase (ESBL) Produced by Enteric Bacteria, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli Isolated from Sewage of Wastewater Treatment Plant at Minragdong in Busan, Korea

163

부산 민락동 오수처리장에서 분리된 장내세균

Klebsiella pneumoniae ^와 Escherichia coli 가 생성한 광범위 베타 락탐 ( Extended-Spectrum ^β -Lactamase, ESBL ^{) 분해효소의 유형}

이훈구

부경대학교 자연과학대학 미생물학과

본논문은부산소재하수처리장중계시설인민락오수처리장의하수에서광범위베타락탐분해효소

(extended- spectrum

β

-lactamase, ESBL)

생성균주를분리동정하고이들이생성한

ESBL

유형을조사하였다

.

민락오수처리 장은부산남구수영구의민락동일대에밀집한횟집의하수를모아서남구용호동에있는하수종말처리장으로 중계시키는시설이다

. 2009

년

1

월하수검체로부터항균제이중디스크확산시험

(double disk synergy test)

에양 성반응을나타낸

19

균주를

1

차시험균주로선택하였다

.

인돌생성시험

methyl-red, Voges-Proskauer, Simmon ’ s citrate, decarboxylase-dihydrolase

및 당 발효능 생화학 시험을 통하여

Klebsiella pneumoniae (3

균주

)

와

Escherichia coli (16

균주

)

가동정되었다

.

이균들을공여균주로

, Escherichia coli J53 (sodium azide

^r

)

를피전달균주 로하여접합시험을실시하여

plasmid

로매개된

4

균주접합체를얻었다

.

이들로부터

plasmid

를추출하여

PCR

로

유전자증폭을시켜유전자를분석하고등전점을조사한결과

Klebsiella pneumoniae

에서생성된

ESBL

유형은모

두

SHV-12 (3

균주

)

였고

, Escherichia coli

에서생성된

ESBL

유형은

SHV-12/TEM-1 (1

균주

)

였다

.

Key words

□

double disk synergy test, Escherichia coli , extended spectrum beta-lactamase (ESBL), Klebsiella pneumoniae , SHV-12, TEM-1

1980

년대 초 유럽에서

Klebsiella pneumoniae

와

Escherichia coli

등일부장내세균에서

plasmid

^{매개성광범위 베타락탐분}

해효소

(extended spectrum

β

-lactamase, ESBL)

생성균주가 병원 에서환자로부터분리된이후우리나라를포함한전세계적으로 여러병원에서폭넓게분리되어질병치료에중요한문제로대두 되고있다

(1, 18).

β

-Lactamase (EC 3.5.2.6)

는

amide, amidine,

기타

C-N

결합을 가수 분해시키는 효소로서 특히환상의

amide

^{를 분해시킨다}

(5, 6).

그결과

penicillin

류나

cephalosporin

류또는 이와관련이 되 는 β

-lactam

항균제에서

amide

결합

,

즉β

-lactam ring

을가수분 해시킴으로써 불활성화 시킨다

(4, 8).

크게

TEM

형과

SHV

형의 두계열로나뉘며이들은대부분

TEM

이나

SHV

β

-lactamase

구 조에서

1~4

개의아미노산치환이일어난 변이형으로서구조유 전자의 점돌연변이

(point mutation)

가일어난 것이다

(9).

이들은

Bush

^의

DNA

^{의 분자구조 차이에 의한 분류와}

Ambler

^{의 β}

-

lactamase

구조에서아미노산서열을기준으로분류하는두가지

의분류체계를가지고있다

(2, 5).

현재임상에서빈번하게분리되고있는

ESBL

생성균주는주로

장내세균과

( Enterobacteriaceae )

^{세균에서생성되며}

cephalosporin

계열의소위제

3

세대항균제들에대해서내성을획득하고있다

.

일부는세균의염색체성

DNA

^{에의해서매개되기도하지만세균}

접합에의한

plasmid

로쉽게다른종의세균에게도약제내성이

전달되고있다

(6, 8).

환자나 임상가검물로부터제

3

세대약제내성을획득한 균주 가분변이나생활하수

,

^{양식장이나축산폐기물들을통하여자연}

계로확산될경우

,

자연계내에서서식하고있는여러종류의세 균군에게내성을전달시킬수있고

,

^{이와같이내성을전달받은}

균주는가축이나음식물

,

기타여러가지복잡한생활환경을통

하여 인체로재유입될 위험성을가지고 있다

.

그러나

ESBL

생

성균주와이들이생성하는

ESBL

유형의 연구는환자로부터기

인된것이대부분이며생활환경으로부터분리된것에대한연구 는많이이루어진바가없다

.

본연구자는이러한문제의중요성 을감안하여부산경남지역의오수펌프장

,

도축장

,

소하천등생 활환경으로부터

ESBL

^{생성장내세균군을분리하여}

,

^{이중디스크}

확산시험

,

접합시험

,

유전자분석과등전점시험을통하여

plasmid

매개성

ESBL

^{생성세균과 이들이생성하는}

ESBL

^{의유형을조}

사해오고있다

(12).

본연구는부산 수영구민락동 횟집밀집지역과그인근주거 지역으로부터생활하수를모아서이지역최종하수처리시설인 부산남구용호동소재남부하수종말처리장으로하수를중계시키 는 민락오수처리장하수로부터

ESBL

생성균주를분리하고 그 유형을파악하기위하여이루어졌다

.

*To whom correspondence should be addressed.

Tel: 82-51-629-5613, Fax: 82-51-611-6358

E-mail: [email protected]

재료 및 방법

균주분리

민락오수처리장 하수로부터 균주분리는 다음과 같이 하였다

. 2009

년

1

월멸균된 채수병에

2

개의 중계 시설하수를 받은 후 실험실로옮겨각각

0.1 ml

을취하여제

3

세대

cephalosporin

계열 항균제인

ceftazidime (4

µ

g/ml, Young-Jin Pharm., Korea)

을첨가 한 장내세균 선택배지인

MacConkey agar

배지

(Difco Labora- tory, USA)

^{에고르게 도말하여}

37

^o

C

^에서

17

^{시간배양하여 균집}

락을 얻었다

.

이를

2

회에 걸쳐

Brain Heart Infusion agar

(BHIA, Difco)

^{상에서순수 분리하였다}

.

^{이렇게 분리된균주를}

생화학 검사를 실시하여종수준까지 최종동정하였다

.

균주의 동정은

Ewing (7)

을따랐다

.

항균제내성검사는시판되는항균제감 수성검사 디스크

(BBL, Becton Dickinson, Microbiology System, USA)

를구입하여디스크확산법으로하였고판정기준은

NCCLS

를따랐다

(15).

사용된 항균제는

ampicillin (AM), amikacin (AN), cephalothin (CF), chloramphenicol (C), gentamicin (GM), kanamycin (K), nalidixic acid (NA)

와

tetracycline (Te)

등

8

종이었다

.

이중디스크 확산(

Double disk synergy

^{) 시험}

항균제검사방법과같이

McFarland No. 0.5

농도에맞춘신선 한균부유액을멸균된면봉으로적셔

Mueller-Hinton agar

^배지

(MHA, Difco)

에 고르게 도말 하였다

.

이 평판의 중앙에

ticarcillin/clavulanate (75/10

µ

g, Becton Dickinson Microbiology System, USA) disk

를놓고

disk

로부터

25 mm

떨어진 곳에제

3

세대 항균제인

cefotaxime (30

µ

g), ceftazidime (30

µ

g), ceftriaxone (30

µ

g) disk

를올려놓고

37

^o

C

에서

18

시간배양한후

에억제대의형태를관찰하여상승효과

(synergism)

를판정하였다

(10, 13).

이때 사용된 항균제는 모두

BBL (Becton Dickinson Microbiology System)

제품이었다

.

교차접합시험(

Transconjugation

)에 의한 내성 전달

이중디스크확산시험결과양성을 나타낸균주를

ESBL

^생성

plasmid

내성잠재전달균주

(donor)

로하고

sodium azide (50

µ

g/

ml)

^가첨가된

Mueller-Hinton agar

^{배지에서 감수성을 확인하였}

다

. E. coli J53 (sodium azide

^r

ceftazidime

^s

)

을 피전달균주

(recipient)

로하여교차접합시험을 실시하였다

.

시험균주들은모

두

BHI

에서 배양된 대수증식기 중반의 신선한균주를 선정하 였다

.

전달균주와피전달균주의균체수비율을

1:10

이되게하여 새로운

BHI

에혼합한후

37

^o

C

에서

24

시간배양하였다

.

이배양 액을멸균된면봉에 적셔

ceftazidime (32

µ

g/ml)

과

sodium azide (50

^µ

g/ml)

^{가 함께 첨가된}

MacConkey agar

^{에 고르게 도말하고}

37

^o

C

에서

24

시간배양하여균집락생성된균주를선별하고생화

학검사를통하여

E. coli

로확인된균을최종실험균주로선별

하고접합자의약자인

C

를해당균주번호앞에부여하여모균 주와구별하였다

(13).

^{이후이균주들에대한}

PCR,

^전기영동

,

^등

전점시험으로

plasmid

에의한내성이 전달되었음을확인한 다

음

Gel Extraction kit (DyneBio Inc., Korea)

를사용하여

plasmid

DNA

를순수정제하여제노택

(Genotec, Korea)

에의뢰하여염기 서열을분석하였다

.

염기서열결정후

, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

와

BCM Search Launcher (http://searcherlaumcher.bcm.tmc.edu/)

를 이용하 여

Multiple Sequence Alignment, Sequence Utility

에서개시코돈

을확인하고해당아미노산결정과유사도등을비교하고

ESBL

유형을 분류하였다

.

형별분류동정 기준은

Bush

와

Jacoby

에의 해서 운영되고 있는

lahey clinical study (http://www.lahey.org/

temtable.asp)

^를따랐다

.

등전점(

Isoelectric focusing, IEF

⁾

등전점 측정을 위하여 균주로부터

crude

β

-lactamase

추출

, polyacrylamide gel

제조및전기영동을실시하였고 단계별방법 은다음과같았다

(12, 13).

BHI

액체배지

30 ml

에접종하여

37

^o

C

에서

24

시간진탕 배양 한후

1,000

×

g

에서

15

분간원심분리하여침전된 세균을모아

3

차증류수

1 ml

에재부유시켰다

.

이를초음파파쇄기

(Ultrasonic homogenizer 4710. Cole-Palmer Instrument Co., USA)

를 이용하 여

30

초간

4

회분쇄하였다

. 5,000

^×

g

에

5

분간원심분리하여상등 액을

eppendorf tube

^{에옮긴후검사실시전까지}

-20

^o

C

^에서보

관하였다

(13).

등전점 검사는 유리판 위에

pipette

^{을이용하여증류수 몇방}

울을떨어뜨리고

gel support film

의소수성부분을유리판에기 포가생기지않도록하여부착시켰다

. Polyacrylamide gel

^을적당

량

(3~4 ml)

을분주하고

,

분주된

gel

위에

gel support film

의친수 성부분을기포가생기지않도록주의하면서부착시켰다

.

이렇게 준비한 유리

gel

판을 형광등불빛 아래에서

1

시간 중합시켰다

.

유리

gel

판위에

sample template

를 놓고

sample 2

µ

l

를

loading

한후

5

분간상온에서방치한다음조심스럽게

sample template

를제거하였다

. Isoelectrofocusing Chamber (Mine IEF Cell 111.,

Bio-Rad Co., USA)

^{의흑연전극에 증류수로적당히 습윤한상태}

를유지시키고유리

gel

판의

gel

이흑연전극에닿도록하여

100 V

^에

30

^분

, 200 V

^에

30

^분

, 450 V

^에

60

^{분간순차적으로전기영동}

시켰다

.

등전점검사를위한

gel

조성은전보를따랐다

(12, 13).

전기영동이 끝난유리

gel

^{판으로부터}

gel support film

^을분리

하여

nitrocefin (500

µ

g/ml in phosphate buffer, pH 7.0)

을

1~2

ml

정도를

gel

표면 위에 뿌려준 후 적색

band

가 나타나면

Wattman No. 2

여과지를

gel

위에 덮어 착색시키고

band

를단 백질표준

marker

와비교하면서판독하였다

(1, 12).

Plasmid

분리와

Polymer Chain Reaction (PCR)

을 이용한

ESBL

유전자의 형별 분류

실험균주를

BHI

에접종하여

37

^o

C

에서

18

시간 진탕배양한후 배양액

1 ml

^을

3,000

^×

g

^{로원심분리하여얻은 침전된 세균을같}

은 양의 생리식염수로 재부유 시켜

3

회 세척하였다

.

이를

plasmid

^{의 분리}

kit

^인

plasmid Minipreps DNA Purification kit (Injae Science Co. Korea)

으로 조작지시서를 따랐다

. ESBL

균

주의 형별 확인을 위하여 사용된

primer

는 각각

TEM type

과

SHV type

의 보존적 염기서열을 이용하여 제노택

(Genotec, Korea)

^{에서제작하였다}

.

TEM

형

primer

는

F (5 ’ -ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA-3 ’) R (5 ’ -GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC-3 ’ )

였고

SHV

형

primer

는

F (5 ’ -TGG TTAT TGC GTT ATA TTC GCC- 3 ’ ) R (5 ’ - GGT TAG CGT TGC CAG TGC T-3 ’)

였다

(13)

TEM

형 확인을 위한

PCR

조건은

denaturation 94

^o

C 30

초

, annealing 50

^o

C 90

초

, extension 72

^o

C 60

초로 하여

30 cycle

을 반복하였고

, SHV

^{형 확인은}

denaturation 96

^o

C 30

^초

, annealing 50

^o

C 15

초

, extension 72

^o

C 120

초로하여

24 cycle

을반복하였다

.

사용된

primix Taq

^은

TaKaRa

^제품

(TaKaRa Bio Inc., Japan)

^이었

고최종량은

20

µ

l

가 되게조절 하였다

. PCR

기기는

GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer, USA)

^{를 사용하였다}

.

^{이와 같}

이하여 얻어진

PCR

생성물을

1.0% agarose gel

에

TBE buffer

속에서

100 V

로

15

분간전기영동을하여각각의전형적인

TEM

(1 kb)

과

SHV (800 bp)

형의

band

를

UV

형광등 아래에서 확인 하였다

(13).

결 과

ESBL

생성 장내세균의 분리동정

2009

년

1

월민락오수처리장의방류수를채취하여

ceftazidime (4

^µ

g/ml)

^이첨가된

MacConkey agar

^{배지상에서성장된균집락}

을선별하여이중디스크확산시험결과중앙에놓여진

ticarcillin/

clavulanic acid

^{와주변에놓인제}

3

^{세대항균제사이에간섭현상}

을 나타내 투명대를 형성한

19

균주를 실험균주로 선택하였다

(Fig. 1).

그람염색및

oxidase

시험 결과

2

종모두음성을 나타 내었고

, catalase

시험은양성을나타내었다

.

이들에대한생화학 검사결과

Klebsiella pneumoniae (3

주

)

와

E. coli 16

주등 총

19

균주의장내세균이동정되었다

(Table 1).

각균종에대한생화학 검사결과는다음과같았다

(Table 1).

E. coli

는

MacConkey

평판배지에서전균주가고원

(plateau)

형 의적색집락을 형성하였고

KIA

배지

slant

와

butt

에서산생성

(A/A), 0.4%

^{한천이첨가된}

nutrient

^{반고체배지에서일부균주}

들이운동성이있었고

, indole, methyl-red

시험에서양성을나타 내었다

.

^{그러나전균주는}

VP

^배지에서

acetoin

^{을생성하지못하}

였고

Simmon ’ s citrate

배지에서

citrate

를단독탄소원으로이용하 지못하였다

. Lysine decarboxylase

^시험과

ornithine decarboxylase

시험은양성반응을 나타내었고

, arginine dihydrolase

시험에서는

균주에따라변화가있었다

. Glucose

를비롯한여러종류의당을

발효시켰다

.

K. pneumoniae

는

MacConkey

평판배지에서전균주가중앙이 선명한 적색

,

주변부가투명한 동심원으로 집락 표면에점성을 띄는 매끄러운

convex

형태였다

. KIA

배지 상에서

slant

부분과

butt

^{부분에서 산생성}

(A/A), 0.4%

^{한천이 첨가된}

nutrient

^반고

체배지에서운동성이없었다

. Indole, methyl-red

시험에서음성

Fig. 1. Detection of ESBL positive strains by the double-disk synergy test between 3rd generation cephalosporins (ceftazidime, ceftriaxon, and cefotaxime) and ticacillin/cavulanic acid (center). The synergic effects between 3rd generation cephalosporins and ticacillin/clavulanic acid are marked in arrow.

Table 1. Biochemical reactions of strains isolated from sewage plant drain water at Minragdong in Busan, Korea Strain No.

Test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

KIA A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A

H

2

S - - - - - - - - - -

Indole Production + + + + + + + + + +

Methyl-Red + + + + + + + + + +

Voges-Proskauer - - - - - - - - - -

Citrate, Simmons - - - - - - - - - -

Lysine, Moeller ’ s + + + + + + + + + +

Arginine, Moeller ’ s - - + - - - + + + -

Ornithine, Moeller ’ s + + + + + + + + + +

Motility + - + - - - + - + -

Gas from Glucose + + + + + + + + + +

Table 1. Biochemical reactions of strains isolated from sewage plant drain water at Minragdong in Busan, Korea (continued)

Acid production from: +

Glucose + + + + + + + + + +

Lactose + + + + + + + + + +

Sucrose - - - - - - - - - -

Mannitol + + + + + + + + + +

Dulcitol - - - - - - - - - -

Salicin - - + - + - + + - -

Adonitol - - - - - - - - - -

Inositol - - - - - - - - - +

Sorbitol + + + + - + + + + +

Arabinose + + + + + + + + + +

Raffinose - - - - - - - - - -

Rhamnose + + + + + + + - + +

Trehalose + + + + + + + + + +

Species E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli Table 1. Biochemical reactions (continued)

Strain No.

Test 11 12 13 14 15 16 17 18 19

KIA A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A

H

2

S - - - - - - - - -

Indole Production + + + - + + - - +

Methyl-Red + + + - + + - - +

Voges-Proskauer - - - + - - + + -

Citrate, Simmons - - - + - - + + -

Lysine, Moeller ’ s + + + + + + + + +

Arginine, Moeller ’ s - + + + - + + + +

Ornithine, Moeller ’ s + + + - + + - - +

Motility + - + - - - - - +

Gas from Glucose + + + + + + + + +

Acid production from:

Glucose + + + + + + + + +

Lactose + - + + - - + + +

Sucrose - - - + - - + + -

Mannitol + + + + + + + + +

Dulcitol - - - - + - - - -

Salicin - + + + - + + + +

Adonitol - - - + - - + + -

Inositol - + + + - + + + +

Sorbitol + + + + - - - - +

Arabinose + + + + - - - + +

Raffinose - - - + + + + + -

Rhamnose + - - + + + + +

Trehalose + + + + + + + + +

Species E. coli E. coli E. coli K. pneu-

moniae E. coli E. coli K. pneu-

moniae K. pneu-

moniae E. coli

을나타내었고

VP

시험에서

acetoin

을생성하여적색을나타내었 고

, Simmon ’ s citrate

시험양성을나타내었다

. Lysine decarboxylase

시험 양성이었고

ornithine decarboxylase

시험 음성이었다

. Glucose

를비롯한 여러종류의 당을발효시켰다

. Glucose

로부터 가스를생성하였다

.

교차접합시험(

Transconjugation

)에 의한 내성 전달 검사

Plasmid

매개에의해서

ESBL

이전달된것을확인하기위하여

동정된

19

^균주

(ceftazidime

^r

sodium azide

^s

)

^{를전달균주로}

, E. coli J53 (ceftazidime

^s

sodium azide

^r

)

을피전달균주로하여

ceftazidime (32

^µ

g/ml)

^과

sodium azide (50

^µ

g/ml)

^가첨가된

MacConkey agar

배지에균을접종하였다

.

교차접합시험을실시하기전피전달균 주인

E. coli J53

은

ceftazidime (32

µ

g/ml)

이 첨가된

MacConkey

agar

배지에서성장이되지않는것을확인하였고

,

전달균주들은

모두

sodium azide (50

µ

g/ml)

에서성장되지않는것을확인하였 다

. K. pneumoniae 3

균주

(

균주번호

c14, c17, c18)

와

E. coli 1

균 주

(

균주번호

c12)

가접합자를형성하였다

.

이접합자들에대한생 화학검사를실시하여피전달어미균주인

E. coli J53

과일치함을 확인하였다

.

항균제 감수성 검사

이중디스크확산시험에서양성반응을나타낸

19

^{모균주에대}

하여

8

종의항균제로감수성시험을실시한결과

, E. coli 16

균주 는조사된

8

^{가지항균제에대하여 최소}

3

^{종부터 최대}

8

^종의항

균제에내성을획득하였다

.

이중

5

가지항균제에내성을획득한 균주

(5

균주

)

가가장많았다

(Table 2).

K. pneumoniae

는분리된 균주가

3

균주로 적게분리되었기때 문에통계적유의성은없으나이들역시

5~6

종의항균제에내성

을획득하였다

(Table 2).

접합자의 β

-lactamase

^등전점

접합자를형성한 균주에대한 등전점은

E. coli

는

pI 5.4

와

pI 8.3

^이었고

(Fig. 2), K. pneumoniae

는

pI 8.3

^{에서단일한 생성물을}

만들었다

(Fig. 2).

Plasmid

^{분리 및}

Polymer Chain Reaction (PCR)

^{를 이용한}

ESBL

유전자의 염기서 열 분류

접합자집락으로부터

plasmid

를추출하여

PCR

로증폭한다음 전기영동을실시한결과는다음과같았다

. E. coli

는

1,000 bp

부 근과

800 bp

^{부근에서 생성물을형성하여}

TEM

^형

(1,080 bp)

^과

SHV

형

(780 bp)

이동시에 전달되었다

.

그러나

K. pneumoniae

는

모두

800 bp

^{부근에서단일한생성물을형성하여}

SHV

^형이었다

.

이들을

elution kit

를사용하여정제한

DNA

를유전자 서열분석 과단백질분석을한결과

E. coli

접합자는

TEM-1

^과

SHV-12

^였

다

. K. pneumoniae

의경우 전기영동 결과

SHV

단독 생성물을 형성한

3

^{균주는모두}

SHV-12

^였다

(Fig. 3).

고 찰

광범위 베타 락탐 분해효소

(extended-spectrum

β

-lactamase,

ESBL)

^{를생성하는 장내세균은국내외를 막론하고대부분 임상}

가검물로부터얻어진것들이며

(11, 14)

그외의환경검체등에서

는자주보고되지않고있다

(3, 20).

^{그러나 우리나라의경우부}

산지역의 도축장이나하천수 등생활환경에서이미

plasmid

매

개성

ESBL

^{생성균들이분리되었고이들의}

ESBL

^{유형도조사되}

었다

(12, 13).

본 연구에서는 부산지역의 민락오수처리장에서

plasmid

^매개성

ESBL

^{생성균주를분리동정하고이들이생성하}

는

ESBL

유형을분류하기위하여실시되었다

.

이오수처리장으

로하수가유입되는구역은 상당히광법위하여 부산남구에있 는황령산록의고지대부터저지대인민락동포구까지이다

.

역세 권은아파트대단지를포함한주거지역

,

대형회센터나재래시장

Table 2. Multidrug resistance patterns of the isolates

Species Antibiotics Strains (Strain No.)

E. coli

Nal AN K Te C Am Ce Ge 1 (8) Nal AN K Te Am Ce Ge 1 (4)

AN K Am Ce Ge 1 (12)

Nal K Am C Ge 3 (1, 2, 6)

Nal K Am C Ce 2 (7,10)

Nal Am C Ce 2 (3,9)

Nal K Am Ce 2 (5,11)

Nal Am Ce Ge 1 (15)

Nal T Am Ce 1 (16)

Nal Am Ce 1 (15)

pneumoniae K.

K Te C Am Ce Ge 1 (17)

Nal AN Am Ce Ge 1 (14)

AN K Am Ce Ge 1 (18)

Abbrivations: ampicillin (AM), amikacin (AN), cephalothin (CF), chloramphenicol (C), gentamicin (GM), kanamycin (K), nalidixic acid (NA), tetracycline (Te)

Fig. 2. Isoelectric focusing points of each ESBL producing transconjugants. E. coli C12 produced the products of pI 5.4 and pI 8.3.

K. pneumoniae (C14, C17, C19) produced only one product at pI 8.3.

이산재해있고민락포구의해산물폐기물뿐아니라인근에종 합병원급내지준종합병원의하수도혼입되고있다

.

이렇게광범 위하고다양한 생활권으로부터모여진 하수들이이곳에서용호 동소재하수종말처리장으로중계되어처리된다음용호만으로 방류된다

.

Plasmid

매개성

ESBL

생성세균은장내세균과

( Enterobacteriaceae )

에속한

E. coli

와

K. pneumoniae

가가장대표적인세균이며이 두 종의 세균은 기회감염균과 원내감염균으로 매우 중요하다

(18).

우리나라에서는

TEM

형의경우

,

임상가검물에서

TEM-52

형이 우점종으로분리되는것으로 보고되었고

(17), SHV

는

SHV-12

가 우점종으로 분리되고 있다

(11).

^{부산지역의 환경에서 분리되는}

TEM

유형 역시

TEM-52

와

TEM-1

가 자주 분리되고 있다

(12, 13).

^{환경에서분리된}

SHV

^{형은제한된자료이지만}

SHV-12

^가단

일유형으로분리되고

(12, 13)

있으며

,

본연구에서도동일한결과 를얻었다

.

^{따라서부산지역에서분리된결과만가지고우리나라}

전체의생활환경에서분리되는

SHV

유형을단언하기는어렵지

만

SHV-12

^{가우리나라에서분리되는}

SHV

^{유형의우점종일가능}

성이 높다고 생각된다

(13). SHV-12

는

SHV-1

에서

35Leu

→

Gln, 238Gly

^→

Ser, 240Glu

^→

Lys

로치환된것으로

pI 8.2

로

SHV-5a

로

분류되던것이었다

(16).

입원환자들에게집단적인원내감염을일

으키기도한다

(19).

본연구에서 이중디스크확산 시험결과 얻어진

19

^{균주 중}

E.

coli

는

16

균주

, K. pneumoniae

는

3

균주였고이중

K. pneumoniae

는

plasmid

^{매개로 전 균주가}

ESBL

^{유전자를 피전달체인}

E.

coli J53

에전달시켰지만

E. coli

는단지

1

개균주만이전달되어 상대적으로

K. pneumoniae

보다전달율이훨씬낮았다

.

Plasmid

매개성

ESBL

생성균주는현재범세계적으로아주흔

하게 임상에서 분리되고 있으며

,

^{이들이생성하는}

ESBL

^유형

역시점돌연변이결과 아주높은빈도로새로운 유형들이보고

되고있다

.

우리나라역시빈번하게분리되고있다

(1, 10).

그러

나현재는

ESBL

생성균주서식처가병원의환자나환자의가검

물에만국한된것은아닌것으로생각되며

,

비록한정된지역이

기는하지만 하수처리장

,

^소하천

,

^{도축장등다양한 생활환경에}

서분리되는것을고려할때

,

부산경남지역의생활환경에널리 확대된것으로생각된다

.

^{현재까지는환경검체에서}

E. coli

와

K.

pneumoniae

등 장내세균

( Enterobacteriaceae )

과의특정 세균속에

국한되어 분리되고 있고 그유형 역시

TEM-1, TEM-52, SHV-

12

등매우단순하지만이들의점돌연변이특성과

plasmid

매개 로쉽게다른종의세균에게내성전달이가능하기때문에가까 운시일내에자연계내서식하고있는세균들에게다양한유형 이분리 될것으로 생각된다

.

생활환경으로부터 분리되는장내 세균들은이미기존의치료약으로쓰이는여러종류의항균제에 내성을획득한상태이며

(12, 13)

이들에게

plasmid

매개성

ESBL

생성능이전달되어사람에게재유입 될가능성은매우높을것 으로생각된다

.

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(Received May 21, 2009/Accepted June 23, 2009)

ABSTRACT : The Types of Extended-Spectrum

^β

-Lactamase (ESBL) Produced by Enteric Bacteria, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli Isolated from Sewage of Wastewater Treat- ment Plant at Minragdong in Busan, Korea

Hun-Ku Lee (Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pukyong National University, Busan 608-737, Republic of Korea)

This study was performed to investigate the type of extended-spectrum

^β

-lactamases (ESBL) produced by bac- teria isolated from the sewage of wastewater treatment plant at Minragdong, Suyong-gu in Busan. The facility is located at sushi restaurants and guides its drain water to the wastewater treatment plant at Yonghodong, Nam-gu in Busan. Samples were collected on January, 2009. A total of 19 strains were selected as potential ESBL pos- itive strains through a double disk synergy test. On the basis of the results from biochemical tests including indole, methyl-red, Voges-Proskauer, Simmon’s citrate, decarboxylase-dihydrolase and sugar-fermentation tests, the 19 strains were identified with 16 strains of Escherichia coli and 3 strains of Klebsiella pneumoniae.

Out of 19 strains, 4 transconjugants against Escherichia coli J53, which is sodium azide resistant recipient strain,

were obtained. The plasmids isolated from transconjugants were used for PCR analysis. The type of each

extended-spectrum

^β

-lactamase (ESBL) produced by the strains was determined on the basis of isoelectric

focusing analysis and DNA sequencing. The results indicated that the types of ESBL from Klebsiella pneu-

moniae were SHV-12 (3 strains), and Escherichia coli was SHV-12/TEM-1 (1 strain), respectively.