고구마의 품종별 페놀 함량과 항산화 활성 분석 및 습열 조리과정에 따른 항산화 활성 변화 비교
서보영1․김지상2․박은주2
1창신대학교 식품영양학과
2경남대학교 식품영양생명학과
Comparison of Phenolic Compounds and Antioxidant Properties of Sweet Potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) according to Variety and Moist Heat Cooking
Bo-Young Seo1, Ji-Sang Kim2, and Eunju Park2
1Department of Food and Nutrition, Changshin University
2Department of Food and Nutrition, Kyungnam University
ABSTRACT Sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam] is usually cooked by steam treatment. Various cooking proc- esses using heat could certainly induce changes in physical characteristics and chemical composition. Therefore, this study was performed to investigate the total polyphenol contents (TPCs), phenolic composition, antioxidant activities [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity (RSA), total radical trapping antioxidant potential (TRAP), oxygen radical absorbance capacity (ORAC), and cellular antioxidant capacity (CAC)], and antigenotoxic activities by comet assay of three sweet potato varieties (general Ipomoea batatas: GIB, yellow Ipomoea batatas: YIB, and purple Ipomoea batatas: PIB) subjected to ethanol and hot water extractions in order to identify changes in biological activities under fresh and steamed conditions. The highest TPC was observed for PIB under fresh and steamed conditions.
After steaming, TPCs of YIB [0.5 vs 0.6 mg/100 g garlic acid equivalents (GAE)] and PIB (1.4 vs 6.9 mg/100 g GAE) were elevated in ethanol extract, and TPC of GIB hot water extract was significantly changed. The extracts showed great variation in phenolic composition, including phenolic acids (chlorogenic acid, caffeic acid, and vanillic acid etc.) and flavonoids (morin, quercetin, and quercitrin etc.) in their high-performance liquid chromatography profiles.
Under steamed condition, chlorogenic acid, vanillic acid, and morin compounds were reduced compared to fresh sweet potatoes. Especially, p-coumaric acid, ferulic acid, and resveratrol compounds were detected in PIB and decreased in steamed condition. In the DPPH RSA result, PIB showed the highest level among all extracts. At the same time, the DPPH RSA value under steamed conditions significantly increased. TRAP activity, ORAC, and CAC values of PIB were the highest among the three kinds of fresh sweet potatoes. However, under steamed conditions, TRAP activity of PIB significantly increased. In the comet assay, PIB under fresh and steamed conditions showed the highest inhibitory capacity against H2O2-induced DNA damage, followed by YIB>GIB. There were no differences between fresh and steamed conditions. This study shows that antioxidant and antigenotoxic capacities were affected by sweet potato varieties and steamed conditions.
Key words: sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam), total polyphenol, antioxidant activity, antigenotoxic effect
Received 27 September 2017; Accepted 7 November 2017 Corresponding author: Eunju Park, Department of Food and Nutrition, Kyungnam University, Changwon, Gyeongnam 51767, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-55-249-2218
서 론
고구마(Ipomoea batatas (L.) Lam.)는 메꽃과에 속하는 쌍떡잎식물로 멕시코지역에서 처음 재배되기 시작하여 현 재는 아시아와 아프리카 전역에서 재배되고 있다(1). 우리나 라에는 조선 영조 39년 일본을 통해 유입된 이후 구황작물 로 널리 이용되었으나 쌀 자급률이 높아지면서 고구마의 섭
취량이 감소하였다(2). 이후 2000년대 웰빙 붐과 함께 건강 에 대한 욕구가 높아지면서 식이섬유소와 무기질 및 비타민 등이 다량 함유된 고구마가 영양학적으로 중요한 식품으로 인식되기 시작하였다(3). 고구마는 수분 70%, 탄수화물 26.4
%, 단백질 1.8%, 지방 0.6% 등으로 구성되어 있으며, 폴리 페놀, 강글리오사이드 등의 유효성분이 함유되어 있고 유색 품종에는 β-carotene, 안토시아닌과 같은 파이토케미컬 (phytochemical) 성분이 다량 함유된 것으로 알려져 있다 (4). 파이토케미컬은 phenolic hydroxyl 그룹과 단백질, 효 소, 2가 금속이온 및 거대분자들 사이의 강력한 결합 성질에 의해 항산화력을 나타낸다(5).
Table 1. Extraction yields of fresh and steamed conditions in three types Ipomoea batatas extracted with ethanol and hot wa-
ter (%)
Fresh Steamed Ethanol
GIB1) YIB
PIB
4.7 3.8 1.9
8.8 6.5 8.9 Hot water
GIB YIB PIB
17.0 24.0 21.5
12.4 22.4 21.2
1)GIB, general Ipomoea batatas; YIB, yellow Ipomoea batatas;
PIB, purple Ipomoea batatas.
항산화란 인체에 유입되는 산화물에 대항하는 세포의 방 어체계와 세포 신호전달 체계의 생리적 기전을 뜻하는 것으 로 최근 인체와 질병 사이에 밀접하게 관여하는 독립적인 기전으로 인정받고 있다(6). Superoxide anions(O2･-), hy- droxyl radicals(OH･), alkoxyl radicals(RO･) 그리고 per- oxyradicals(ROO･), hydrogen peroxide(H2O2), hypo- chlorous acid(HOCl), singlet oxygen(1O2) 등의 활성산소 종(reactive oxygen species, ROS)은 산화적 스트레스를 유발하여 세포 내 DNA 손상을 일으키고, 당뇨, 심혈관질환, 대사증후군 등의 만성질환 발병 초기 단계에서도 중요한 작 용을 하는 것으로 알려져 있다(7). 이러한 이유에서 산화적 스트레스에 대한 방어능력을 키우기 위해 일상생활에서 쉽 게 접할 수 있는 식품을 이용한 항산화 활성 및 생리활성 분석 연구와 건강기능식품 소재로서의 가능성 연구에 대한 노력이 증가하는 추세이다.
고구마는 2013년 약 22,000 ha에서 33만 톤이 생산될 만큼 우리의 식생활에서 다양한 식품원료로 활용되고 있으 며, 굽기, 튀기기, 찌기 등의 간단한 조리를 이용한 편의 식품 으로 활용되고 있다(8). 최근 건강에 대한 관심 증대와 함께 유색 고구마의 기능성이 주목받고 있으며, 항산화 및 항돌연 변이 활성, 성인병 예방 등의 효과가 확인되면서 기능성 식 품 소재로의 활용 비중이 높아졌다(9). 고구마 유색 품종들 에 대한 연구는 육질의 색에 따른 기능성에 대한 연구가 활 발하게 진행되고 있으며, 조리 전후에 의한 분석은 고구마 함유 영양소의 변화를 분석한 비타민 C 함량(9)과 당 함량 변화(10) 등의 연구 결과가 있다. 또한, 조리에 의한 생리활 성 변화 연구는 Jung과 Im(11)에 의해 Yulmi종의 조리 전후 생리활성 변화 분석이 이루어졌으며, Lee 등(12)은 네 가지 고구마 품종을 이용하여 찌기와 굽기의 조리방법에 의한 생 리활성 변화를 분석하였다. 그러나 이 연구들은 품종의 제한 이나 각 조리방법에 따른 비교만 있을 뿐 조리 후 품종 간의 비교는 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 다양한 in vitro 방법을 통해 고구마 생시료의 품종별 페놀성분 종류 와 함량, 항산화력, 항유전독성을 분석하였으며, 조리 후의 활성 변화 비교 및 품종별 비교 분석을 시행하였다.
재료 및 방법
재료
일반고구마(general Ipomoea batatas, GIB)는 대유미, 호박고구마(yellow Ipomoea batatas,YIB)는 땅끝누리, 자 색고구마(purple Ipomoea batatas,PIB)는 퍼플스위트 품 종으로 전라남도 해남에서 생산된 것을 시중에서 구입하여 분석에 이용하였다.
시료의 추출
시료 추출을 위하여 일반고구마, 호박고구마, 자색고구마 를 찬물에 깨끗이 씻은 다음 생고구마와 조리 후 고구마로
나누어 에탄올과 열수 추출하였다. 생고구마는 껍질을 벗긴 상태에서 0.5×0.5 cm 크기로 잘라 추출에 이용하였고, 조 리 후 활성 변화를 알아보기 위하여 수세한 고구마 200 g을 찜기에 넣고 20분간 증기로 조리 후 생고구마와 동일한 크 기로 잘라 추출에 이용하였다. 조리 전 시료와 동일한 무게 를 사용하기 위해 조리 전과 후의 중량을 환산하여 추출에 이용하였다. 추출 조건은 조리 전 시료의 처리방법과 동일하 게 시행하였다.
에탄올 추출은 각 시료 10 g을 에탄올 100 mL에 침치한 후 실온에서 72시간 동안 추출하였다. 추출물은 여과지 (Whatman No.1, Whatman, Maidstone, UK)로 여과한 후, 회전진공농축기(Eyela N-1000, Tokyo Rikakikai Co., To- kyo, Japan)를 이용하여 37°C에서 농축하였으며, 각 농축 물은 50 mg/mL의 농도로 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 분석 시까지 -20°C에 보관하였다.
열수 추출은 생고구마 10 g을 채취하여 에탄올 추출물과 동일한 비율의 3차 증류수에 침지 후 121°C, 15분간 고온고 압멸균기에서 처리하였다. 이렇게 얻어진 추출물은 여과 후 동결 건조하고 질소 치환하여 -20°C에 보관하였다. 분석을 위한 시료는 50 mg/mL의 농도로 DMSO에 녹여 -20°C에 보관하였다. 조리 후 시료는 에탄올 추출방법과 동일하게 중량을 환산하여 추출에 이용하였다.
수율을 분석하기 위하여 원시료 무게를 추출하여 시료 무 게로 나눈 후 100%로 환산하여 표시하였다. 그 결과는 Table 1에 제시하였다.
총 페놀 함량 분석
총 페놀 함량은 시료 1 mL를 취하여 증류수 1 mL를 가해 희석하고 1 N Folin-Ciocalteu 시약 2 mL를 가해 실온에서 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 용액 2 mL를 가하여 잘 섞은 다음 상온에서 암실조건으로 방치하였다. 1시간 후 시료를 원심 분리한 다음 상층액을 취하여 ELISA reader(Sunrise, Tecan Co., Ltd., Gröodig, Austria)를 사용하여 700 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 이용 하여 작성한 표준곡선으로 mg gallic acid equivalents (GAE)/100 g 단위로 나타내었다.
페놀성분(phenolic composition) 분석
품종별 고구마 추출물의 페놀성분 분석은 Agilent 1260 infinity quaternary liquid chromatography(Hewlett Pack- ard, Wilmington, NC, USA)를 사용하여 정량 분석하였다.
이때 사용된 칼럼은 Agilent zorbax rapid resolution high definition SB-C18 column(2.1×100 mm I.D., 1.8 μm particle size, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)이었으며, 30°C에서 0.3 mL/min의 유속으로 설정하 였다. 사용된 용매는 solution A에 0.1% formic acid 함유 증류수, solution B에 0.1% formic acid 함유 acetonitrile을 이용하였다. 이동상의 조건은 0%(0분), 5%(0~3.5분), 15%
(3.5~7.1분), 40%(7.1~25분), 40%(25~26분), 100%(26~
27분), 100%(27~29분), 그리고 0%(29~35분)로 설정하여 280 nm에서 분석하였다. 또한, 데이터 분석은 Chemstation software(Hewlett Packard)를 사용하였으며 표준시약은 p-hydroxybenzoic acid, gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, m-coumaric acid, o-coumaric acid, vanillic acid, catechin, epicate- chin, epigallocatechin gallate, quercitrin, myricetin, re- sveratrol, morin, quercetin, naringenin, apigenin 등을 이용하였다.
DPPH 라디칼 소거능(radical scavenging activity, RSA) 측정
DPPH 라디칼 소거능은 80 μL의 에탄올에 녹인 0.2 mM DPPH 용액을 1.0 mg/mL 농도의 시료와 잘 혼합한 다음 상온에서 10분간 반응시켜 492 nm에서 흡광도를 분석하였 다(Sunrise, Tecan Co., Ltd.). 각 시료의 DPPH 라디칼 소 거능은 아래의 식에 의해 계산하여 나타내었다. 대조구는 시료 대신 DMSO를 처리하여 흡광도를 측정하였다.
Radical scavenging activity (%)=(1－A/B)×100 A: 시료 첨가구의 흡광도, B: 대조구의 흡광도
총 항산화능(total radical trapping antioxidant potential, TRAP) 측정
이 방법은 ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazo- line-6-sulfonate), 150 μM]와 met-myoglobin(2.5 μM)을 H2O2(75 μM)로 활성화함으로써 생성된 ferryl myoglobin radical species와의 상호작용에 의해 형성된 ABTS radi- cal cation의 absorbance를 측정하는 데 기초를 두고 있으 며, 그 absorbance의 억제 정도는 시료(0.84% extracts)에 들어 있는 antioxidant capacity에 비례하게 된다. 10.0 mg/
mL의 시료를 6분 동안 30°C에서 배양한 후 UV/VIS spec- trophotometer(UV 1601, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 로 740 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 TRAP 농도는 Trolox의 calibration curve를 이용하여 계산하였 으며 Trolox equivalent antioxidant capacity(mM)로 표 현하였다.
Oxygen radical absorbance capacity(ORAC) 측정 조리 전후의 일반고구마, 호박고구마, 자색고구마 추출물 에 대하여 ORAC assay를 이용한 항산화 활성 측정은 Kur- ihara 등(13)의 방법을 이용하여 측정하였다. Peroxyl rad- ical generator로 2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH)를 사용하여 최종 반응 농도가 20 nM이 되도록 처리하였다. 형광 표준용액인 fluorescein의 최종 반응 농도는 Ou 등(14)의 방법에 따라 40 nM이 되도 록 처리하였으며, 최종 반응 농도 1 μM의 Trolox를 control standard로 사용하였다. AAPH는 매일 신선하게 제조하여 실험에 사용하였다. Free radical에 의한 fluorescein의 감 소는 Tecan GENios multi-functional plate reader(GENios, Tecan Trading AG, Salzbrug, Austria)를 이용하여 ex- citation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 2분 주기로 2시간 동안 측정하였다. 50 μg/mL 농도 의 GIB, YIB, PIB 추출물 ORAC value는 각 시료의 형광이 감소하는 곡선 아랫부분의 총면적(net area under the curve) 을 산출하여 1 μM Trolox equivalents(TE)로 나타내었으 며, 각 시료에 대한 실험은 3회 반복 실험 결과의 평균을 이용 하였다.
Net area under the curve (net AUC)＝AUCsample－AUCblank ORAC value＝net AUCsample/net AUCTrolox
ROS 소거능(cellular antioxidant capacity, CAC) 분석 살아 있는 세포 내에서 시료의 항산화 활성을 검색하기 위해 HepG2 세포를 이용하여 CAC assay를 실시하였다.
HepG2(ATCC 8065, human liver adenocarcinoma cell- line) 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. HepG2 세포는 비 활성화한 fetal bovine serum 10%와 1% 항생제(penicil- lin/streptomycin)를 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 환경에서 배양하 였다.
CAC assay는 항산화 시스템이 잘 발달한 특징을 지녀 산 화적 스트레스와 관련된 연구에 널리 사용되는 HepG2 세포 를 이용(15)하여 변형된 DCFH-DA 방법(16)으로 측정하였 다. 96-well plate에 세포 수를 5×105 cells/mL로 계산하여 100 μL씩 가하여 37°C, 5% CO2에서 배양하였으며, 24시간 후 배지를 제거하고 형광에 안정한 Hank’s balanced salt solution(HBSS)을 각 well에 200 μL 분주하였다. 추출물은 예비실험을 통해 세포독성이 나타나지 않는 최고 농도인 100 μg/mL가 되도록 각 시료 2 μL를 처리하여 30분 동안 배양하였다. HBSS 50 μL로 각 well을 세척하고 다시 HBSS 를 200 μL 분주한 후 peroxyl radical generator로 8 mM AAPH 2 μL를 가하여 30분 동안 배양하였다. 형광 probe로 40 mM DCFH-DA 2 μL를 가한 후 30분 동안 배양한 다음 Tecan GENios multi-functional plate reader(GENios, Tecan Trading AG)를 이용하여 excitation wavelength
Table 2. Total phenolic contents of fresh and steamed conditions in three types Ipomoea batatas extracted with ethanol and hot water (mg GAE/100 g)
Fresh Steamed Ethanol
GIB1) YIB PIB
0.49±0.04a2)3) 0.53±0.01b 1.37±0.02d
0.46±0.02a 0.60±0.00b***
6.90±0.03d***
Hot water
GIB YIB PIB
0.69±0.01b**
1.06±0.02c 5.67±0.04e
0.57±0.02b 1.05±0.01c 8.15±0.09e***
1)GIB, general Ipomoea batatas; YIB, yellow Ipomoea batatas;
PIB, purple Ipomoea batatas.
2)Values are mean with standard deviation.
3)Values not sharing the same letter are significantly different from one another (P<0.05) by Tukey b range test.
**P<0.01, ***P<0.001; Significantly different between fresh and steamed conditions are indicated by Student’s t-test.
485 nm, emission wavelength 535 nm에서 형광의 발생 정도를 측정하였다. Control은 DCFH-DA만을 처리하였으 며, AAPH와 DCFH-DA를 처리하여 positive control로 하 였다. Control의 형광값을 100%로 하여 각 시료와 positive control인 AAPH의 상대적인 형광값을 비교하였다. 각 시료 에 대한 실험은 최소 3회 반복 실험하였다.
DNA 손상 보호능(comet assay) 측정
백혈구의 DNA 손상을 측정하기 위하여 건강한 성인남성 으로부터 채혈한 신선한 전혈을 Histopaque 1077(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 이용해 백혈구를 분리 한 후 본 실험에 사용하였다. 전신을 순환하는 백혈구는 체 내에 유입되는 유해물질에 대한 감시와 신호 전달 체계를 가지고 있어 화학적 암예방(chemoprotective) 효과 분석을 위한 효율적인 지표로 이용될 수 있다(17). 본 연구 수행에 앞서 경남대학교 기관생명윤리위원회 승인을 받았다(KUIRB 2013-14). Singh 등(18)의 alkaline comet assay 방법에 따라 분리해 놓은 백혈구에 시료 50 μg/mL의 농도로 처리 하여 37°C에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 백혈구 를 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후 인위적 인 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 μM의 H2O2를 처리하여 4°C에 5분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다.
Positive control을 위해 시료 대신 1% DMSO를 처리한 후 200 μM H2O2를 처리하였고, negative control은 DMSO 만을 처리하였다. 시료의 농도는 예비실험을 통해 세포독성 이 없는 최고 농도로 처리하여 시행하였다.
반응을 끝낸 백혈구를 75 μL의 0.7% low melting agar- ose gel(LMA)과 섞은 후, 1.0% normal melting agar- ose(NMA)가 미리 처리된 슬라이드 위로 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버글라스로 덮어 4°C에 방치하였다. NMA 가 굳으면 cover glass를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75 μL로 덮은 후 4°C에 방치하였다. Gel이 굳으면 차 가운 alkali lysis buffer(2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% sodium lauryl sarcosine, 1% Triton X- 100, 10% DMSO)에 슬라이드를 담가 암실에 1시간 동안 침지시켜 백혈구를 용해해 핵막을 제거하였다. 이 과정이 끝 난 후 슬라이드를 전기영동 수조에 배열하고 4°C의 차가운 electrophoresis buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)를 채워 20분 동안 방치하여 DNA의 이중가닥을 풀 어주어 alkali labile sites가 드러나게 한 다음 25 V/300±3 mA의 전압으로 20분간 전기영동을 실시하였으며, 빛에 의 한 DNA의 부가적 손상을 막기 위해 암실조건에서 실시하였 다. 전기영동이 끝난 후 차가운 중성용액(0.4 M Trizma base, Sigma-Aldrich Co., pH 7.5)에 5분간 3회 세척하여 중화시켰으며, 고정을 위하여 에탄올에 5분간 세척한 후 slide를 건조했다. 20 μg/mL ethidium bromide로 염색한 slide를 형광현미경(LEICA DMLB, Wetzlar, Germany)의 CCD camera(Nikon, Tokyo, Japan)를 통해 세포핵 형상을
확인하고, comet image analyzing system(Komet version 5.0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)을 이용해 분석하였 다. 백혈구의 200 μM H2O2에 의해 유도된 DNA의 손상 정 도는 핵으로부터 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA 함량(% tail intensity)으로 나타내었다.
통계처리
모든 데이터의 통계처리는 SPSS, Windows 14.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였고 결과는 평균±
표준편차로 나타내었으며, 신뢰수준 95%(P<0.05)에서 평 균값들에 대해 유의성을 검증하였다. 각 항목은 일원배치분 산분석(one-way ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고, Tukey b range test를 이용하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였 다. 조리 전과 후의 활성 변화 비교를 위해 Student’s t-test 를 시행하였으며, 유의수준은 P<0.05로 검증하였다.
결과 및 고찰
총 페놀 함량
품종별 고구마의 조리 전후 총 페놀 함량 분석 결과는 Table 2와 같다. 본 연구 결과 생시료와 조리 후 시료 추출물 별 총 페놀 함량 모두 PIB>YIB>GIB 순으로 나타났다. PIB 의 페놀 함량은 추출 용매의 종류와 상관없이 높은 결과를 보였다. 조리 전후 비교 결과에서는 에탄올 추출물의 경우, YIB와 PIB에서 조리 후 총 페놀 함량이 증가하는 것으로 나타났으며, 열수 추출물에서는 GIB가 조리 후 유의적으로 함량이 감소하였으며, PIB는 조리 전보다 조리 후 30% 증가 한 것으로 나타났다. Kim 등(8)에 의한 육질색 종류별 고구 마 추출물의 항산화 활성 연구의 총 페놀 함량 분석 결과에 서는 white, orange, purple이 각각 18.5, 17.6, 49.5 μg GAE/mg으로 purple이 가장 높게 나와 PIB가 높은 것은 동일하나, GIB와 YIB의 결과는 다른 것으로 나타났다. 시료 의 처리방법 및 추출방법 차이에 의한 것으로 판단된다.
Table 3. The phenolic composition of fresh and steamed conditions in three types Ipomoea batatas Concentrations (μg/g of sample, dry matter basis)
GIB1) YIB PIB
Fresh Steamed Fresh Steamed Fresh Steamed
Phenolic acids
p-Hydroxybenzoic acid
Gallic acid Chlorogenic acid Catechin Caffeic acid p-Coumaric acid Epicatechin Epigallocatechin
gallate Ferulic acid m-Coumaric acid o-Coumaric acid Vanillic acid
－
－ 819.5±5.1c2)3)***
－
－
－
－
－
－
－
－ 1,328.9±33.6d***
－
－ 334.2±2.0c
－ 1,244.6±1.4f
－
－
－
－
－
－ 354.8±8.5d
－
－ 529.6±10.0c***
－
－
－
－
－
－
－
－ 1,105.5±12.7d***
－
－ 376.2±5.1c
－ 1,305.1±21.5f
－
－
－
－
－
－ 557.2±18.5d
－
－ 2,220.3±5.9h***
－
－ 476.5±16.2e***
179.7±2.4b
－ 354.9±3.4d***
－
－ 4,639.2±15.1i***
－
－ 1,334.1±12.0f
－ 1,346.3±82.5f 214.2±5.0c
－
－ 54.7±3.7b
－
－ 1,496.8±19.5g
Flavonoids
Quercitrin Myricetin Resveratrol Morin Quercetin Naringenin Apigenin Kaempferol
－
－
－ 134.3±1.8b 29.3±3.5a
－
－
－
442.0±3.0e
－
－ 135.2±2.2b 37.9±1.3a***
－
－
－
－
－
－ 152.0±5.8b 24.9±2.9a
－
－
－
599.6±8.1e
－
－ 157.4±5.7b 34.2±3.4a**
－
－
－
620.41±3.95f
－ 690.4±2.6g***
278.8±2.8c 38.0±0.9a
－
－
－
1,470.1±5.2g***
－ 605.4±16.6e 464.7±2.2d***
40.6±4.0a
－
－
－
1)GIB, general Ipomoea batatas; YIB, yellow Ipomoea batatas; PIB, purple Ipomoea batatas.
2)Value are mean±SD (n=5); －, not detected (limit of detection: 10 μg/g).
3)Values not sharing the same letter are significantly different from one another (P<0.05) by Tukey b range test.
**P<0.01, ***P<0.001; Significantly different between fresh and steamed conditions are indicated by Student’s t-test.
페놀성분 분석
품종별 고구마의 조리 전후 페놀성분 분석 결과는 Table 3과 같다. 품종별 조리 전후 페놀성분의 함량은 PIB>YIB>
GIB 순으로 나타났으며 이는 총 페놀 함량과 일치하는 결과 이다.
품종별 고구마의 조리 전후 페놀성분 분석 결과는 Table 3과 같다. 품종에 따른 페놀성분 비교 시 조리 전 모든 품종 에서 phenolic acids는 vanillic acid의 함량이 가장 높게 나타났으며, 조리 후에는 GIB와 YIB에서 caffeic acid가, PIB에서 vanillic acid 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
조리로 인해 chlorogenic acid와 vanillic acid는 세 품종 모두에서 감소하였고, 조리 전 검출되지 않은 caffeic acid 는 조리 후에만 분석되었다. 또한, p-coumaric acid와 ferulic acid는 PIB에서만 분석되었으며, 그 함량이 조리 후 감소하는 것으로 나타났다. Flavonoids는 조리 전 GIB와 YIB에서 morin 함량이, PIB에서는 resveratrol의 함량이 가장 높은 것으로 나타났으며, morin과 quercetin은 조리 후 함량이 증가하는 것으로 확인되었다. Quercitrin은 GIB 와 YIB의 경우 조리 후에만 검출되었고, PIB의 경우 조리 전에 비해 조리 후 42% 증가하였다. 특이하게 resveratrol 은 PIB에서만 확인되었으며, 조리 후 그 함량이 감소하였다.
Rice-Evans 등(19)은 가열처리에 의한 flavonoid type의
차이는 가열 과정 중 flavonoid 내 존재하는 OH기의 재배열 과 수의 변화에 의해 나타나며, 일반적으로 3번과 4번 위치 의 OH기의 dihydroxylation에 의해 나타난다고 보고하였 다. 또한, flavan-3-ols catechin, epicatechin, galloca- techin, epigallocatechin과 같은 flavonoids는 열 안정성이 크다고 하였다(20). 게다가 Dewanto 등(21)과 Kim 등(22) 은 과일과 채소류를 가열처리 하였을 때 가열처리 동안 다양 한 화학적 변화에 의해 생리활성이 높아진다고 보고하였으 며 가열처리는 식물세포의 셀룰로오스 구조의 붕괴로 생리 활성 물질의 이용성을 증가시킨다고 하였다(23). 따라서 본 연구의 결과에서 가열처리는 고구마의 flavonoid 함량을 증 가시키는 페놀성분의 변화를 초래하며 품종에 따라 다른 양 상을 나타낸다는 것을 밝혔다.
항산화 능력 분석
본 연구에서는 품종별 고구마의 조리 전과 후 DPPH 라디 칼 소거능(RSA)을 알아보기 위하여 시료 1.0 mg/mL 농도 의 RSA 분석 결과를 Table 4에 나타내었다. 그 결과 생고구 마는 에탄올 추출물과 열수 추출물 모두 GIB와 YIB가 동일 한 수준의 소거능을 보였으며, PIB에서만 에탄올 추출물이 49.8±1.5%, 열수 추출물이 71.1±1.7%로 유의적으로 높은 활성을 보였다. 이러한 결과는 자색고구마의 DPPH 라디칼
Table 4. DPPH radical scavenging activity (RSA), total radical trapping antioxidant potential (TRAP), and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) of fresh and steamed conditions in three types Ipomoea batatas extracted with ethanol and hot water
RSA (%) TRAP (TEAC) ORAC (TE)
Fresh Steamed Fresh Steamed Fresh Steamed
Ethanol
GIB1) YIB PIB
26.6±0.4a2)3) 25.2±2.0a 49.8±1.5b
24.3±1.2b*
19.5±0.4a**
82.7±0.6d***
0.6±0.0b 0.7±0.0d 1.4±0.0f
0.5±0.0a*
0.6±0.0b**
1.5±0.0d***
3.7±0.3a 5.6±0.2b 16.7±0.6e
4.7±0.3ab*
5.6±0.1b 22.4±0.9c**
Hot water
GIB YIB PIB
26.6±0.8a 22.9±3.3a 71.1±1.7c
22.4±2.2ab*
28.1±2.0c 85.7±0.6d***
0.5±0.0a 0.6±0.0c 1.2±0.0e
0.5±0.0a 0.6±0.0b 1.3±0.0c***
7.0±0.5c 8.1±0.2d 22.3±0.3f
3.8±0.2a***
5.3±0.1b***
22.7±0.2c
1)GIB, general Ipomoea batatas; YIB, yellow Ipomoea batatas; PIB, purple Ipomoea batatas.
2)Values are mean with standard deviation.
3)Values not sharing the same letter are significantly different from one another (P<0.05) by Tukey b range test.
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; Significantly different between fresh and steamed conditions are indicated by Student’s t-test.
소거능 활성이 일반고구마와 주황고구마보다 월등히 높게 나타난 Kim 등(8)의 연구 결과와 일치하였다. 또한, 품종별 부위별 RSA 분석 결과(11)에서 자색고구마 품종인 신자미 에서 부분별로 각각 앞부분 25.5%, 중간부분 20.3%, 끝부 분이 21.3%로 품종 간의 비교에서 가장 높은 활성을 보였 다. 조리 전후의 비교에서는 에탄올 추출물 GIB와 YIB가 조리 후 소거능이 유의적으로 감소한 데 반해, PIB는 소거능 이 40% 증가하였다. 열수 추출물 GIB는 에탄올 추출물과 동일하게 조리 후 유의적으로 감소하였으나, YIB는 조리 전 과 후가 동일한 수준으로 나타났으며, PIB는 조리 후에 17%
증가하였다. 자색고구마의 색소 성분인 안토시아닌은 phe- nolic hydroxyl 그룹에 의한 강력한 항산화력을 가지나, 수 용성 색소라는 특징 때문에 품질의 이화학적 특성에 영향을 받는다는 연구가 선행된 바 있다(5,24). 반면에 자색 품종인 진홍미와 황색 품종인 주황미가 찌기 조리 후 DPPH 라디칼 과 ABTS 라디칼 소거 활성 증가를 보였으며, 열에 의해 안 정한 상태로 전환된 안토시아닌과 카로티노이드가 습열 조 리 후 생리활성 성분의 효율을 증대시켜 항산화 활성 증가에 기여한다는 해석도 있으며(12), 이는 본 연구와 일치하였다.
조리 전후의 추출 용매에 따른 고구마 추출물의 총 항산화 능(TRAP)은 Table 4에 나타내었다. 생시료의 경우 에탄올 추출물과 열수 추출물 모두 PIB>YIB>GIB의 순으로 나타났 으며, 추출물 간 비교에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물보 다 유의적으로 높게 나타났다. 조리 후 시료에서도 생시료와 동일한 결과를 보였다. 조리 전후 비교에서는 에탄올 추출물 의 경우 GIB와 YIB가 조리 후 그 활성이 유의적으로 감소하 였으며, PIB만 유의적으로 증가하였다. 열수 추출물의 경우 GIB와 YIB의 활성은 유지되었으며, PIB만 유의적으로 증가 하는 것으로 나타났다. 고구마의 항산화 물질로서 chloro- genic acid, gentistic acid, caffeic acid, ganglioside 등이 있는 것으로 알려져 있으며(25), 이 성분들은 항산화 효과 외에도 강력한 면역조절, 항암, 간 해독 등에 효과를 보이는 것으로 보고된 바 있다(26). 자색고구마의 항산화 효과 연구 (27)에서 분석한 FRAP 결과에서도 1.25 mg/mL 농도의 자 색고구마 추출물의 철 이온 환원능력이 100 μM의 α-toco-
pherol 활성 수준의 강력한 항산화력을 나타냈다. TRAP는 추출물 내의 항산화 활성 물질의 복합적인 작용에 의해 활성 을 나타내는 분석법(25)으로, 본 연구의 결과 역시 고구마의 여러 가지 항산화 성분의 복합적 활성에 기인한 것으로 생각 한다.
ORAC 분석법은 peroxyl radical generator에서 유도된 peroxyl radical에 대한 항산화 물질의 저해능을 측정하는 방법으로 peroxyl radical과 형광 probe가 반응하여 형성되 는 비형광 생성물의 양이 시간에 따라 얼마나 감소하는지를 평가하여 항산화 활성을 측정하는 원리이다(13,14). GIB, YIB, PIB 세 가지 품종의 고구마를 50 μg/mL 농도로 처리하 였을 때 peroxy radical이 감소하는 정도를 분석한 결과는 Table 4와 같다. 먼저 생고구마의 경우 에탄올 추출물과 열 수 추출물 모두 PIB>YIB>GIB 순으로 나타났으며, 조리 후 결과도 동일한 경향을 보였다. 이는 본 연구의 다른 항산화 활성 결과와 일치한다. 조리 전후 비교에서는 에탄올 추출물 의 경우 GIB와 PIB에서 조리 후 활성이 높아지는 것으로 나타났으며, 열수 추출물에서는 GIB와 YIB의 활성이 감소 하는 것으로 확인되었다. 비슷한 연구로 콜리플라워의 항산 화 활성이 찌기, 데치기, 삶기 순으로 감소 경향이 확인되었 으며(28), 이는 조리과정 중 다량의 물 사용이 유효성분 용 출에 영향을 미친다는 결과로 해석한 바 있다. 끓이는 시간 이 증가함에 따라 신선한 배추의 β-carotene 함량이 약 38.6% 감소하지만, steaming에 의해서는 오히려 조리시간 이 증가함에 따라 β-carotene 함량이 증가하는 것으로 나 타난 선행연구 결과도 있다(29). 이처럼 조리 중 사용하는 수분의 양과 조리방법이 시료의 유효성분에 지대한 영향을 미치는 것으로 판단된다.
ROS 소거능
세 가지 품종의 고구마에 의한 HepG2 세포 내 활성산소 소거능에 관한 분석 결과는 Fig. 1과 같다. Peroxyl radical generatior인 AAPH를 처리하지 않은 negative control (NC)의 활성을 100%로 환산했을 때 시료를 처리하지 않고 AAPH만을 처리한 positive control(PC)이 152.6%로 나타
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
NC PC GIB YIB PIB GIB YIB PIB
Ethyl alcohol Hot water DCF fluorecence intensity . (% of control) .
a a
b d
a b c c
A
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
NC PC GIB YIB PIB GIB YIB PIB
Ethyl alcohol Hot water DCF fluorecence intensity . (% of control) .
a cd ab bc ab
ab d
e *
* ***
B
Fig. 1. Cellular antioxidant capacity of fresh (A) and steamed (B) conditions in three types Ipomoea batatas extracted with ethanol and hot water (100 μg/mL) against oxidative stress in- duced by AAPH in HepG2 cell model. A: Fresh condition Ipomoea batatas extracts, B: Steamed condition Ipomoea bata- tas extracts. Values are mean with standard deviation. Bars with different letters are significantly different at P<0.05 by Tukey b range test. *P<0.05, ***P<0.001; Significantly different between fresh and steamed conditions are indicated by Student’s t-test.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NC PC GIB YIB PIB GIB YIB PIB
Ethyl alcohol Hot water
% Tail intensity .
a
ab ab ab ab
b ab c
A
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NC PC GIB YIB PIB GIB YIB PIB
Ethyl alcohol Hot water
% Tail intensity .
a a a
ab ab a
b c
*
B
Fig. 2. Effect of supplementation in vitro with 50 μM concen- trations of fresh (A) and steamed (B) conditions in three types Ipomoea batatas extracted with ethanol and hot water on 200 μM H2O2 induced DNA damage in human leukocytes. NC: 1%
DMSO (without oxidative stimulus) treated negative control, PC:
200 μM H2O2 treated positive control. A: Fresh condition Ipomoea batatas extracts, B: Steamed condition Ipomoea bata- tas extracts. Values are mean with standard deviation. Bars with different letters are significantly different at P<0.05 by Tukey b range test. *Significantly different between fresh and steamed conditions are indicated by Student’s t-test (P<0.05).
났다. 반면 생시료 GIB, YIB, PIB 처리군에서는 추출 용매에 상관없이 YIB와 PIB에서 유의적 소거능을 보였으며, 에탄 올 추출물은 YIB에서, 열수 추출물은 PIB에서 가장 높은 ROS 소거능을 보였다. 조리 후 시료들의 분석 결과 생시료 분석 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, 에탄올 추출물에 서는 YIB가 가장 높은 소거 활성을 보였고 열수 추출물에서 는 GIB가 활성이 가장 높은 것으로 나타났다. 특이한 점은 열수 추출물의 GIB의 경우 조리 전에는 ROS 소거능이 전혀 없는 것으로 나타난 데 반해, 조리 후 소거능이 108.9%로 NC와 동일한 수준으로 나타났다. HCT-116과 HT-29 두 세포주에 50 μg/mL의 자색고구마 추출물을 처리했을 때 butylated hydroxytoluene 처리군과 동일 수준의 ROS 저 해능이 확인된 바 있어(30), 고구마의 항산화 활성 물질들이 실제 세포의 산화적 스트레스를 억제할 수 있다는 것을 뒷받 침한다. 조리 후 세포의 ROS 소거능이 증가하였다는 결과는 호화과정을 거치면서 안정한 상태로 전환된 고구마 유효 성 분들이 추출 과정을 통해 셀룰로오스 조직이 붕괴하면서 세 포 내 흡수율이 향상된 것으로 판단되며, 열수 추출방법이 조직 파괴에 있어 더 효율이 높은 것으로 판단된다(23). 이
러한 결과는 페놀성분 분석 결과가 뒷받침한다. 따라서 고구 마 품종별 ROS 소거능은 앞서 분석한 총 페놀 함량 및 페놀 성분 등 다양한 생리활성 물질에 의한 항산화 활성에 기인한 결과로 생각한다. 차후 연구에서는 세포 내 유효성분 실제 유입량을 수준까지의 분석이 필요할 것으로 생각한다.
DNA 손상 보호능
200 μM H2O2로 유도된 산화적 스트레스에 대한 조리 전 후의 세 가지 품종 고구마 추출물의 DNA 손상 보호 효과는 Fig. 2에 제시하였다. 실험 결과에 대한 comet image는 Fig. 3과 같다. 본 연구의 결과 50 μg/mL 농도의 모든 추출 물을 처리 시 200 μM H2O2로 유도된산화적 스트레스에 대해 DNA 손상을 감소시키는 것으로 확인되었다. 생시료와 조리 후 시료 모두 추출 용매에 무관하게 DNA 손상 보호능 을 보였다. 조리 전후의 차이를 비교한 결과 열수 추출물의 PIB에서만 DNA 손상 보호능이 증가하는 것으로 확인되었 다(P<0.05). 따라서 본 연구 결과를 통해 고구마 추출물 처 리에 의해 산화적 스트레스에 대한 DNA 보호 효과를 확인
A B
C D E
F G H
Fig. 3. Micrographs representing images obtained from the comet assay. A: DMSO-treated normal control, B: 200 μM H2O2-treated positive control, C: Fresh GIB+200 μM H2O2, D: Fresh YIB+200 μM H2O2, E: Fresh PIB+200 μM H2O2, F: Steamed IB+200 μM H2O2, G: Steamed YIB+200 μM H2O2, H: Steamed PIB+200 μM H2O2.
할 수 있었으며, 조리에 의해 그 보호능이 감소하는 것은 아닌 것으로 확인되었다. Park 등(31)에 의한 Ames test를 기반으로 한 고구마 품종별 항돌연변이 효과 연구에 의하면 Trp-P-1과 Trp-P-2에 의해 유도된 돌연변이에 대해 대부 분의 고구마 품종에서 돌연변이 억제 효과가 나타났으며, 자색고구마의 항돌연변이 효과가 가장 높은 것으로 확인되 었다. 이는 총 페놀 함량과 높은 돌연변이 억제 효과를 나타 내는 고구마 품종 사이의 연관성에 기인한다고 기술하였다.
고구마의 항산화력 근원이 되는 주성분은 다수 연구를 통해 chlorogenic acid와 isochlorogenic acid라고 보고된 바 있 고(13), 최근 연구들에서 cinnamic acid, anthocyanin, cy- anidin, peonidin aglycon, gallic acid, gentisic acid, caf- feic acid 등이 동정되어 항산화 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(32,33). 이는 앞서 분석한 본 연구의 결과와도 일 맥상통한다.
이상의 연구 결과를 보아 고구마의 항산화력은 일반고구 마 품종보다 유색 품종의 활성이 높은 것으로 나타났으며, 고구마의 조리에 의한 유효 활성 감소는 크지 않고 일반고구 마의 경우 조리 후 활성이 더 높아지는 분석 결과도 확인하 였다. 따라서 본 연구의 결과 고구마는 체내 항산화 활성을 높일 수 있는 천연식품으로서 스팀을 이용한 조리방법은 유
효성분 활성 변화에 영향을 주지 않으며, 오히려 생리활성 성분의 흡수를 돕는 요인이 된다는 것을 보여주었다. 그러나 본 연구에서는 한 가지 조리법을 이용했다는 제한점이 있으 므로 차후 분석에서는 다양한 조리법을 구사하여 조리 시간 및 조리법에 따른 세포의 생리활성 변화 분석 및 조리 후 품종별 비교 분석이 뒷받침되어야 할 것이다. 이를 바탕으로 항산화 활성에 긍정적인 영향을 주는 조리법을 활용한 다양 한 고구마 요리가 개발된다면 식품 자체 기능성을 최대한 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
요 약
본 연구에서는 품종별 고구마의 폴리페놀 성분과 항산화 활 성을 분석하였으며, 조리 전후의 활성 변화를 살펴보고자 하였다. 총 폴리페놀 함량 분석(total polyphenol contents, TPC), 페놀성분을 비롯한 DPPH radical scavenging ac- tivity(RSA), total radical trapping antioxidant potential (TRAP), oxygen radical absorbance capacity(ORAC) 및 CAC 활성(cellular antioxidant capacity)과 DNA 손상 보 호능 등 다양한 방법의 in vitro 분석을 시행하였다. TPC 분석 결과 생시료와 조리 후 모두 시료 추출물별 TPC 함량
이 자색고구마(PIB), 호박고구마(YIB), 일반고구마(GIB) 순 으로 높게 나타났다. 품종별 조리 전후 페놀성분 함량 변화 분석 결과 TPC 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 품종 에 따른 페놀성분 비교 시 조리 전 모든 품종에서 phenolic acids는 vanillic acid의 함량이 가장 높게 나타났다. Phe- nolic acids 중 chlorogenic acid와 vanillic acid는 세 품종 모두에서 감소하였고, 조리 전 검출되지 않은 caffeic acid 는 조리 후에만 분석되었다. 조리 전 flavonoids 분석에서는 GIB와 YIB에서 morin이, PIB에서는 resveratrol 함량이 높 은 것으로 나타났다. 특이하게 PIB에서만 분석된 phenolic acids 중 p-coumaric acid, ferulic acid와 flavonoids의 resveratrol은 조리에 의해 감소하는 것으로 확인되었다.
DPPH RSA를 분석한 결과 생고구마는 추출물에 상관없이 GIB와 YIB가 동일한 수준을 보였으며, PIB에서 가장 높은 RSA 활성을 보였다. 이러한 결과는 조리 후에도 유사하게 나타났다. 조리 전후 비교에서는 PIB에서만 활성이 증가하 였다. TRAP 활성 분석 결과 추출 용매와 조리 여부에 상관 없이 PIB, YIB, GIB의 순으로 나타났으며, 조리 전후 비교에 서는 에탄올 추출물 GIB와 YIB가 조리 후 그 활성이 유의적 으로 감소하는 것으로 나타난 데 반해, PIB는 유의적으로 상승하는 결과를 보였다. 열수 추출물에서는 조리에 의한 변화는 없었으며, PIB는 활성이 증가하였다. ORAC 분석 결 과에서도 추출 용매와 조리 여부에 상관없이 GIB, YIB, PIB 의 순으로 나타났으며, 조리 전후 비교에서 에탄올 추출물의 경우 GIB에서 활성이 감소하였고 PIB는 활성이 증가하였 다. 열수 추출물에서는 GIB와 YIB가 조리 후 소거능이 낮아 지는 것으로 나타났으며, PIB는 그 활성이 유지되는 것으로 확인되었다. 세포 내 ROS 소거능 분석에서는 조리 전 모든 추출물에서 YIB와 PIB가 소거능을 나타내었고, 조리 후에 는 추출 용매에 구분 없이 GIB, YIB, PIB 모두 ROS 소거능 이 있는 것으로 확인되었다. 그 활성은 조리 후 GIB 에탄올 추출물과 YIB, PIB 열수 추출물에서 향상되는 것으로 나타 났다. DNA 손상 보호능 분석 결과에서는 모든 추출물에서 산화적 스트레스에 대한 DNA 손상 보호능이 있는 것으로 나타났으며, 조리 전후 차이를 비교한 결과 열수 추출물의 PIB에서만 그 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과 품종별 항산화력은 유색 품종에서 더 높은 활성을 보였 으며, 조리 전후 활성 변화 분석에서는 일부 분석에서 GIB 활성이 감소하는 결과를 보였으나, 대부분의 분석에서 활성 이 유지되거나 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 고구마를 이용한 다양한 조리법이 개발된 다면 고구마의 식품 자체 기능성을 최대한 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
감사의 글
본 연구는 2018년도 경남대학교 학술연구장려금의 지원으 로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.
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