장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성 류희정

전체 글

(1)J Korean Soc Food Sci Nutr 48(4), 410～417(2019). 한국식품영양과학회지 https://doi.org/10.3746/jkfn.2019.48.4.410. 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성 류희정․송현지․이승욱 계명대학교 식품가공학과. Enzymatic Preparation and Antioxidant Activities of Protein Hydrolysates from Allomyrina dichotoma Larvae Hee-Jeong Ryu, Hyun-Ji Song, and Syng-Ook Lee Department of Food Science and Technology, Keimyung University. ABSTRACT Allomyrina dichotoma larvae (ADL) extracts have been reported to possess multiple biological activities; therefore, this study was conducted to evaluate the antioxidant properties of ADL protein hydrolysates. Protein hydrolysates were prepared from ADL powder by enzymatic hydrolysis using five different proteases (alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, and papain). Evaluation of the peptide contents and SDS-PAGE analyses revealed that ADL treated with alcalase, neutrase, and flavourzyme showed a high degree of hydrolysis (HD), whereas the HD value of those treated with bromelain and papain was minimal. The RC50 values of the protein hydrolysates (<3 kDa) obtained from three different antioxidant analyses revealed that they had similar antioxidant activities. In addition, the alcalase hydrolysate showing the highest production yield of low molecular weight protein hydrolysate was further tested for its inhibitory effect on peroxidation of linoleic acid by measuring the thiobarbituric acid values and the results showed that treatment with the alcalase hydrolysate (100∼400 μg/mL) significantly inhibited linoleic acid peroxidation during five days of incubation. These findings suggest that protein hydrolysates from ADL represent potential sources of natural antioxidants. Key words: Allomyrina dichotoma larva, protein hydrolysates, enzymatic hydrolysates, antioxidant activities. 서. 론. 뎅이 유충에 대한 영양학적 성분분석 결과에서 필수불포화 지방산의 함량이 높은 것으로 알려져 건강식품으로써의 가. 곤충은 지구상에서 가장 크고 다양한 종을 가지고 있으. 능성이 보고된 바가 있으며(Wang과 Leger, 2005; Youn 등,. 며, 뛰어난 환경 적응력으로 전 세계에 널리 분포하고 있다.. 2012), 그 밖에도 간 보호 및 항암 효과(Lee 등, 2015), 항. 이러한 특징들은 곤충을 유용한 생물자원으로 인식하게 하. 치매 효과(Kim 등, 2014), 항비만(Chung 등, 2014), 대장균. 였고, 이와 함께 국제식량농업기구(FAO)에서는 미래 식량. 감염에 미치는 영향(Yamada 등, 2004) 등 장수풍뎅이 유충. 난에 대비하기 위한 정책으로 식용 곤충의 활성화 방안을. 의 다양한 기능성에 대한 연구가 보고되고 있다. 하지만 장. 발표하였다. 이에 전 세계적으로 곤충에 대한 관심이 증대되. 수풍뎅이 유충의 생리활성 펩타이드에 대한 연구는 부족한. 고 있을 뿐만 아니라, 곤충을 대상으로 생리활성 물질 발굴. 실정이다.. 을 위한 연구에도 많은 주목을 하고 있다(Cudjoe 등, 2005;. 생리활성 펩타이드는 보통 3~20개의 아미노산으로 이루. van Huis 등, 2013). 고서에는 약 95종의 약용곤충이 기록되. 어져 있으며 아미노산의 조성이나 서열에 따라 다양한 기능. 어 있으며 한약재로 자주 이용되어 온 곤충으로는 주로 굼벵. 적 특성을 갖는 장점이 있다(Pihlanto-Leppälä, 2000; Ari-. 이, 누에 등 30여종이 있다(Kang 등, 2001; Wang과 Leger,. hara 등, 2001). 지금까지 연구된 생리활성 펩타이드의 효과. 2005). 딱정벌레목(Coleoptera) 풍뎅이과(Scarabaeidae). 로는 항혈전(Chabance 등, 1995), 항고혈압(Lee와 Song,. 에 속하는 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 한국, 일. 2003), 우유단백질 가수분해물의 체내 항산화 기능 향상과. 본, 중국, 대만 등지에 서식하는 것으로 알려져 있고, 장수풍. 가공식품에서의 산화반응 방지(Pihlanto, 2006) 등 기능성 연구가 활발하게 진행되고 있어 단백질 함량이 높은 장수풍. Received 20 Novemver 2019; Accepted 29 March 2019 Corresponding author: Syng-Ook Lee, Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 42601, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-53-580-5570 Author information: Hee-Jeong Ryu (Graduate student), Hyun-Ji Song (Graduate student), Syng-Ook Lee (Professor). 뎅이의 효소적 가수분해를 통한 생리활성 펩타이드 생산이 주목받고 있다(Chung 등, 2013). 본 연구에서는 곤충의 식･약용 소재화 연구의 한 방안으 로 단백질 분해 효소원을 이용하여 장수풍뎅이 유충으로부.

(2) 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성. 411. 터 단백가수분해물을 제조하고, 그중 가수분해도가 높은 단. 며, 각 가수분해물은 3,000×g, 4°C, 10분 원심분리 후 얻은. 백가수분해물을 선택하여 2,2-diphenyl-β-picryhydrazyl. 상등액 20 μL를 gel에 loading 하여 80 V에서 약 2시간 전기. (DPPH) 라디칼, 2,2’-azino-bis(3-ethylbemzthiazoline-. 영동한 후, Coomassie Brilliant Blue를 사용하여 염색하고. 6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼, hydrogen peroxide(H2O2). 10% acetic acid가 함유된 30% 메탄올을 이용하여 탈색시. 소거 활성 및 지질과산화 억제 활성 평가를 하였다. 또한 선. 켰다. 단백질 패턴의 분석은 Gel Logic 2200 PRO Imaging. 행연구들을 통해 항산화 활성이 보고된 바 있는 일부 식용곤. System(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA). 충들(갈색거저리 유충과 흰점박이꽃무지 유충)로부터 단백. 을 이용하여 polyacrylamide gel을 스캐닝한 후 이미지로. 가수분해물을 제조한 후 이들과 장수풍뎅이 유충 단백가수. 영상화시켰다. 이때 molecular weight maker는 Bio-Rad. 분해물 간의 항산화 활성을 비교 및 유리 아미노산 분석을. Laboratories(Carlsbad, CA, USA)의 제품을 사용하였다.. 시행하였다.. 단백질의 가수분해도 측정. 재료 및 방법. 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 가수분해도 측정은 Folin phenol 시약과 TNBS 방법(G-Biosciences Co.)을. 실험재료. 이용하여 효소제 처리 시간에 따른 장수풍뎅이 유충 단백가. 본 실험에서 사용한 주 시료는 2017년 2월 17일에 농업. 수분해물의 tyrosine 함량을 측정하였다(Choi 등, 2013).. 법인회사 예천곤충나라(경북 예천군)에서 생산, 판매된 것. Folin 시약을 이용하여 Matsushita 등(1966)의 방법에 따. 으로 진공 건조된 장수풍뎅이 유충을 구입하여 -20°C 동결. 라 효소별 단백가수분해물을 증류수로 10배 희석하고 동량. 고에 저장하여 두고 실험에 사용하였다. Alcalase, flavour-. 의 20% trichloroacetic acid(TCA)를 첨가 후 37°C에서 30. zyme, neutrase, bromelain 및 papain 단백질 분해효소는. 분간 반응시켰다. 이후 15,000×g에서 10분 동안 원심분리. Novo사 제품을 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다.. 하여 침전물을 제거하고 상등액 200 μL에 0.55 M Na2CO3. 가수분해도 측정을 위해 사용된 2,4,6-trinitrobenzene sul-. 500 μL와 Folin phenol 시약 100 μL를 차례대로 넣어 37°C. fonic acid picrylsulfonic acid(TNBS)는 G-Biosciences사. 에서 30분간 반응시킨 다음, microplate spectrophotometer. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 특별한 언급이. (Bio Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용. 없는 한 그 밖의 분석용 시약 및 유기용매는 Sigma-Aldrich. 하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, TNBS 방법. 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.. 은 10 mM sodium bicarbonate(pH 8.5) 990 μL와 1% TNBS 10 μL를 혼합(v/v)하여 0.01% TNBS를 제조하고,. 장수풍뎅이 유충 단백질 가수분해물 제조. TNBS 50 μL와 시간별로 취한 반응혼합액 100 μL를 섞어. 동결 건조된 장수풍뎅이 유충 분말을 10 mM sodium. 37°C에서 2시간 반응시킨 후 반응을 정지시키기 위해 10%. phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 4%(w/v)의 기질용. sodium dodecyl sulfate와 1 N hydrogen chloride를 첨가. 액으로 제조한 후, 90°C에서 20분 동안 항온수조 내에서 자. 했다. 그 후 335 nm에서 흡광도를 측정하였다.. 가 효소를 불활성화하였다. 단백질 가수분해효소(alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, papain)를 각각 기질. DPPH 라디칼 소거 활성 측정. 대비 1%(w/w)가 되도록 첨가한 후, 55°C 100 rpm에서 0~. DPPH 자유라디칼 소거 활성은 Ham 등(2015)의 방법에. 24시간 동안 가수분해 하였고 90°C에서 20분간 가열하여. 따라 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올을. 효소를 불활성화하였다. 방랭한 후 가수분해물을 13,000×. 이용하여 시료를 0, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL로 희석하. g에서 20분 동안 원심분리 하여 상등액을 얻었으며, 상등액. 고 희석된 시료를 96-well plate에 160 μL씩 분주하였다.. 은 저분자 펩타이드의 분리를 위해서 membrane filter(Ami-. 메탄올에 녹인 0.2 mM DPPH 용액 40 μL를 시료가 분주된. con Ultra-15, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA,. well에 분주하여 실온에 30분간 방치한 후 microplate. USA)를 이용하여 2시간 동안 원심분리(5,000×g) 함으로. spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도로 측. 써 최종적으로 분자량 3 kDa 이하의 단백가수분해물을 얻. 정하였다. 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 흡광. 었다. 단백가수분해물은 동결 건조한 후 -20°C에 보관하면. 도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도인 RC50값으. 서 실험에 사용하였다.. 로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위한 양성대조군으로 Trolox를 사용하였다.. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). ABTS 라디칼 소거 활성 측정. 효소별 장수풍뎅이 유충의 단백질 가수분해 특성을 확인. ABTS 라디칼 소거 활성 실험은 Re 등(1999)의 방법을. 하기 위하여 SDS-PAGE를 이용하여 가수분해물의 단백질. 변형하여 측정하였다. 최종 농도가 7 mM인 ABTS와 2.45. 패턴을 측정하였다. SDS-PAGE는 15% gel을 사용하였으. mM potassium persulfate를 각각 혼합한 후 실온인 암소에.

(3) 412. 류희정 ․ 송현지 ․ 이승욱. 서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시킨 다음 ABTS. 통계분석. 용액의 농도는 사용하기 직전에 734 nm에서 흡광도 값이. 모든 데이터는 최소 3번 반복하여 평균과 표준오차(mean. 0.70±0.02가 되도록 phosphate buffered saline(PBS, pH. ±SE)로 나타내었으며, 통계 분석에는 SPSS Statistics. 7.4)으로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 180 μL에 시료. (Version 23.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)가 사용되었. 20 μL를 가하여 1분 동안 30°C에 방치한 후 734 nm에서. 다. 또한 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원배치 분산분. 흡광도를 측정하였다. 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분. 석(one-way ANOVA)을 사용하였으며, Duncan’s multi-. 해물의 흡광도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도. ple range test를 통한 사후 검증을 시행하였다. 유의확률. 인 RC50값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위한 양성대. (P-value)이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로. 조군으로 Trolox를 사용하였다.. 판단하였다.. H2O2 소거 활성 측정. 결과 및 고찰. H2O2 소거 활성 측정은 Müller(1985)의 방법에 따라 증 류수에 농도별로 희석한 시료 20 μL, PBS 100 μL, 1 mM. 효소별 장수풍뎅이 유충의 단백질 가수분해물 제조 특성. H2O2 20 μL를 96-well plate에 가한 후 37°C incubator에. 장수풍뎅이 유충의 생리활성을 가지는 펩타이드를 제조. 서 5분간 반응시켰다. 이후 1.25 mM ABTS 30 μL와 1. 하고자 일반적으로 사용되는 상업적 단백질 가수분해효소. U/mL peroxidase 30 μL를 가하고 37°C에서 10분간 반응. 인 alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, papain을. 시킨 후, microplate spectrophotometer를 이용하여 405. 이용하여 가수분해를 하고 그 특성을 조사하였다. 효소별로. nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위한 양성. 24시간 반응시킨 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 특성. 대조군으로 Trolox를 사용하였다.. 을 확인하고자 SDS-PAGE를 통해 단백가수분해물의 패턴 을 조사하였으며 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 비효소군. Linoleic acid에 대한 산화 방지 효과. 과 효소별 단백가수분해물을 비교한 결과, 비효소군보다 al-. Linoleic acid에 대한 산화 억제 효과를 확인하기 위해. calase 및 neutrase 단백가수분해물이 15 kDa 이하로 모두. 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 2 mL와 5% lin-. 분해되어 15 kDa 이상의 단백질은 거의 나타나지 않았다.. oleic acid 1 mL, absolute alcohol 1 mL, 시료 1 mL를. Flavourzyme 단백가수분해물의 경우는 alcalase와 neu-. 혼합한 후 40°C에서 100 rpm으로 진탕하며 하루 간격으로. trase 단백가수분해물들에 비해 20 kDa 이상의 분자량에서. 각 시료의 linoleic acid에 대한 산화 억제 효과를 측정하였. 단백질이 다수 관찰되었으나 비효소군과 비교하였을 때 가. 다. 20% TCA(w/v) 100 μL, 0.8% thiobarbituric acid(TBA,. 수분해가 활발하게 일어났음을 확인할 수 있었다. 이는 이들. w/v) 100 μL와 linoleic acid 반응기질 용액 50 μL를 잘. 세 단백가수분해물의 경우 전반적으로 모든 분자량에서 밴. 혼합하여 95°C 이상에서 20분 반응시킨 후, 실온에서 10분. 드가 관찰되는 bromelain과 papain 단백가수분해물에 비해. 간 냉각시키고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 180 μL의 상등액을 흡광도 532 nm에서 측정하였다. 이때 활성 비교를 위한 양성대조군으로 Trolox를 사용하였다.. 유리 아미노산 조성 분석 건조시킨 시료를 실온에서 phenylisothiocyanate(PITC). (kDa) Marker 100 75 50 37. 용액 20 μL(MeOH : H2O : triethylamine(TEA) : PITC＝. 25. 7:1:1:1)에 30분 동안 유도체화하여 건조시킨 후, HPLC의. 20. A 용매와 함께 혼합하여 원심분리 하였다. 상등액을 0.45 μM syringe filter로 여과하여 분석 시료로 사용하였으며. 15. 유리 아미노산 분석은 Agilent 1260 Series HPLC(Agilent Technologies, Wilmington, NC, USA)를 이용하였고, col-. 10. umn은 Nova-Pak C18 column(3.9×300 mm, 4 μM, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. 이동상은 A 용매 (140 mM NaHAc, 0.15% TEA, 0.03% EDTA, 6% CH3CN, pH 6.1)와 B 용매(60% CH3CN, 0.015% EDTA)를 이용하 였으며 flow rate는 1 mL/min이었다.. [1]. [2]. [3]. [4]. [5]. [6]. Fig. 1. Effect of five different proteases on SDS-PAGE profile of Allomyrina dichotoma larvae protein hydrolysates. SDS-PAGE patterns on 15% gel of Allomyrina dichotoma larvae hydrolysate. Lane [1]: no enzyme, Lane [2]: alcalase, Lane [3]: bromelain, Lane [4]: flavourzyme, Lane [5]: neutrase, Lane [6]: papain..

(4) 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성. 저분자 펩타이드가 더 많이 생산된 것으로 판단된다.. 413. 여 가수분해물의 primary amino groups를 측정하는 TNBS. 단백질이 가수분해 되면서 가수분해도에 비례하여 free. assay를 통해 가수분해도를 재확인하였다(Fig. 2B). 가수분. amino group이 증가하므로 펩타이드의 함량을 나타내는 지. 해도가 높은 3종의 단백가수분해물 제조 시 적절한 가수분. 표가 될 수 있다(Torres-Fuentes 등, 2011). 5종의 효소에. 해 시간은 8시간 이하로 판단하여 8시간 반응 후 가수분해. 대하여 가수분해 시간에 따른 가수분해도를 평가하기 위해. 도를 tyrosine 함량으로 환산한 결과, primary amino group. Folin phenol 시약과 TNBS assay를 이용하였다. 가수분해. 농도는 alcalase 10.33 mg/mL, flavourzyme 9.44 mg/mL,. 된 free amino group 함량을 간접적으로 측정하는 방법(Oh. neutrase 7.65 mg/mL로 확인할 수 있었다. 이는 Folin. 등, 2005)으로 펩타이드에 포함된 방향족 아미노산인 ty-. phenol 시약을 이용하여 free amino group 함량을 측정한. rosine의 페놀 잔기와 Folin phenol 시약의 반응을 통해. 결과와 유사하게 alcalase 단백가수분해물의 가수분해도가. free amino group 농도를 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간. 가장 우수한 것을 알 수 있었으며, Folin phenol 시약을 이용. 별로 측정하고 Fig. 2A에 나타내었다. Alcalase 1,461.20. 한 방법과 TNBS assay를 이용한 가수분해도 측정 결과에. μg/mL, neutrase 972.53 μg/mL, flavourzyme 625.87 μg/. 서 neutrase, flavourzyme 단백가수분해물의 가수분해도. mL 순으로 alcalase 단백가수분해물의 free amino group. 차이는 측정법에 따라 영향을 받는 것으로 판단된다. SDS-. 함량이 가장 높은 것으로 나타났으며 alcalase, neutrase. PAGE와 가수분해도 측정 결과를 미루어 보아 장수풍뎅이. 및 flavourzyme 단백가수분해물은 0~6시간 동안 free. 유충의 단백질 가수분해는 8시간이 지나면서 가수분해가 충. amino group 함량이 급격히 증가하였고 그 이후부터 증가. 분히 이루어지며, alcalase가 flavourzyme과 neutrase에. 폭이 감소하는 것을 알 수 있다. 반면 bromelain 및 papain. 비해 상대적으로 많은 저분자 펩타이드를 생산하는 것을 확. 단백가수분해물은 24시간 처리에도 불구하고 유의적인. 인할 수 있었다.. free amino group 함량의 증가를 보이지 않았으며 alca-. 단백질 가수분해물의 경우 1∼5 kDa의 저분자량 펩타이. lase, neutrase 및 flavourzyme 단백가수분해물에 비해 함. 드가 체내로 쉽게 흡수되고 체내 이용률도 높다는 보고. 량이 현저히 낮은 것으로 나타났다. 가수분해도가 높은 것으. (Matsushita 등, 1966)에 따라 가수분해가 활발히 일어났던. 로 판단되는 alcalase, neutrase와 flavourzyme을 이용하. alcalase, flavourzyme, neutrase 단백가수분해물을 3 kDa 이하로 한외여과 한 후 동결 건조하여 항산화 실험에 이용하. Alcalase Bromelain. A Available amino group . concentration (μg/mL) .. 1,600. Neutrase Papain. 1,400 1,200 a. 1,000 800 600 400 200. a. a. a. b. Flavourzyme No enzyme. 확인하기 위해 전체 기질의 고형분 함량에 대하여 3 kDa a. a. a. 였다. 각 단백가수분해물의 저분자 펩타이드 생산 효율을. 다(Table 1). 효소를 처리하지 않았을 때의 3 kDa 이하 고형. b c. b c. b c. a b c b b b c c c d de d d e e d e e f f f f f f. d. d e f. e f. 0 0. 2. 4. 6. 8. 이하로 분리한 고형분의 무게를 측정하여 수율을 나타내었. 10. 12. 14. 16. 18. 20. 22. 24. Hydrolysis period (h). 분 수율은 17.51%인데 반해, alcalase, neutrase 및 flavourzyme 단백가수분해물의 경우 각각 50.70%, 33.39% 와 25.07%로 나타나 alcalase 단백가수분해물이 유의적으 로 3 kDa 이하의 수율이 가장 높은 것을 알 수 있었다(P< 0.05). 이러한 결과를 종합해볼 때 3 kDa 이하의 펩타이드 생산에는 alcalase 효소가 적합할 것으로 판단되며, 갈색거. 15,000. Available amino group . concentration (μg/mL) .. 저리 유충과 흰점박이꽃무지 유충의 alcalase 단백가수분해. B. 12,000. Alcalase. Flavourzyme. Neutrase. 물의 3 kDa 이하 수율이 각각 42.05%와 52.91%인 것을 고려할 때 장수풍뎅이 유충 alcalase 단백가수분해물의 수. a a. a. 9,000. b 6,000. ab. a. b. b. c. Table 1. Yields of protein hydrolysates (<3 kDa) prepared from vacuum dried Allomyrina dichotoma larvae using different proteases Enzymes. 3,000. Alcalase Flavourzyme Neutrase No enzyme. 0 0. 2. 4. 6. 8. Hydrolysis period (h). Fig. 2. Degree of hydrolysis of Allomyrina dichotoma larvae by different proteases at 55°C. A, Folin phenol assay. B, TNBS assay. Each value is mean±SE (n≥3) and different letters (a-f) at the same time are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.. 1). 1). Yields. of protein hydrolysates (%) 50.70±2.37a2) 25.07±0.51c 33.39±1.50b 17.51±2.31d. Yields (%)＝[Total solid content of protein hydrolysate－total solid content of blank (without substrate)] ÷ total substrate content×100. 2) Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-d) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

(5) 414. 류희정 ․ 송현지 ․ 이승욱. Table 2. DPPH free radical scavenging activities of the hydrolysates from Allomyrina dichotoma larvae with different proteases 1) 2) Enzymes RC50 (μg/mL) TEAC (mg TE/g protein) a3) b Alcalase 757.31±14.88 2.22±0.02 Flavourzyme 652.40±11.75b 2.45±0.02a b Neutrase 644.44±37.88 2.46±0.10a Trolox 1.77±0.06 － 1) Concentration required for 50% reduction of DPPH･ at 30 min after starting the reaction. 2) Trolox equivalent antioxidant capacity. 3) Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a,b) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.. 율 또한 이들과 유사한 것을 알 수 있었다(Lee 등, 2017; Yu 등, 2017).. Table 3. ABTS+ free radical scavenging activities of the hydrolysates from Allomyrina dichotoma larvae with different protease Enzymes Alcalase Flavourzyme Neutrase. Table 4. Hydrogen peroxide radical scavenging activities of the hydrolysates from Allomyrina dichotoma larvae with different proteases. 할 수 있는 능력을 평가할 때 사용되는 물질로서 수소 혹은. 이를 이용하여 효소별 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소 거능을 측정한 결과를 Table 2에 나타내었다. 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 50% 라 디칼 저해율을 나타내는 RC50값으로 나타냈을 때 alcalase. 73.38±0.68a 52.48±0.89c 60.85±0.62b. Trolox 5.57±0.10 － Concentration required for 50% reduction of ABTS+･ at 1 min after starting the reaction. 2) Trolox equivalent antioxidant capacity. 3) Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.. DPPH 라디칼은 항산화 물질이 수소 원자나 전자를 공여. 칼 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변한다(Ham 등, 2015).. 50.83±0.46c3) 65.19±0.61a 53.18±0.31b. 1). 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 ROS 소거 활성. 전자를 받음으로써 안정한 형태의 화합물로 전환되어 라디. 1) 2) RC50 (μg/mL) TEAC (mg TE/g protein). Enzymes. 1) RC50 (μg/mL). TEAC (mg TE/g protein)2). Alcalase Flavourzyme Neutrase. 50.15±3.69a3) 31.95±0.42b 48.08±0.17a. 372.52±22.66c 565.46±18.25a 453.99±16.74b. Trolox 4.89±0.13 － Concentration required for 50% reduction of ABTS+･ at 10 min after starting the reaction. 2) Trolox equivalent antioxidant capacity. 3) Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. 1). 757.31 μg/mL, flavourzyme 652.40 μg/mL, neutrase 644.44 μg/mL로 나타나 alcalase 단백가수분해물에 비해. 단백가수분해물의 H2O2 소거 활성을 측정하였다(Table 4).. flavourzyme과 neutrase 단백가수분해물의 DPPH 라디칼. H2O2 소거 활성을 RC50값으로 나타내었을 때 alcalase. 소거 활성이 유의적으로 높았다(Table 2).. 50.15 μg/mL, flavourzyme 31.95 μg/mL와 neutrase 48.08. ABTS 라디칼 소거 활성법은 ABTS와 potassium per-. μg/mL로 확인되었으며 flavourzyme 단백가수분해물이 al-. sulfate의 24시간 반응으로부터 생성된 ABTS 자유라디칼. calase와 neutrase 단백가수분해물에 비해 소거 활성이 높. 이 항산화 물질에 의해 제거되면서 라디칼의 짙은 청록색이. 았다.. 무색으로 탈색되는 원리를 이용한 항산화 활성 측정법으로. 단백가수분해물별 ROS 소거 활성을 종합해보면, DPPH. 측정이 빠르고 pH 변화에 다소 민감하지 않다는 장점이 있. 라디칼 소거능에서 flavourzyme 및 neutrase 단백가수분. 어 in vitro에서 항산화능을 측정하기 위한 방법으로 널리. 해물의 활성이 상대적으로 높았으며(P<0.05), ABTS 라디. 이용되고 있다(Re 등, 1999). ABTS 라디칼 소거 활성에. 칼 저해 활성은 alcalase 단백가수분해물이, H2O2 소거 활. 대한 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 영향을 RC50값으. 성은 flavourzyme 단백가수분해물이 유의적으로 높았다. 로 나타낸 결과(Table 3), alcalase 단백가수분해물의 RC50. (P<0.05). 이는 효소별 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의. 값은 50.83 μg/mL였고, flavourzyme과 neutrase 단백가. DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거 활성 및 H2O2. 수분해물의 RC50값은 각각 65.19 μg/mL와 53.18 μg/mL로. 소거 활성이 상관관계가 없다는 것을 보여주며, Pihlanto. alcalase 단백가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 가. (2006)와 Kim 등(2000)의 보고처럼 단백질 가수분해 펩타. 장 높았다.. 이드의 항산화 활성은 항산화 활성 측정법에 따라 차이가. Hydrogen peroxide는 산소의 환원 대사물질로서 반응. 있고 각 효소가 기질에 작용하는 절단 부위가 달라 각 단백. 성이 매우 강하여 생체 산화에 주된 역할을 하며, DNA 및. 가수분해물을 구성하는 펩타이드들의 아미노산 서열이 다. 단백질 손상을 유발하거나 불포화지방산과 같은 생체막의. 양해지기 때문에 ROS 종류에 따라 소거 활성이 다르게 나타. 구성성분을 공격하여 과산화지질을 생성함으로써 생체 기. 난다는 결과와 유사한 결과를 보였다.. 능의 저하, 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다(Chung. Ha와 Yoo(2017)는 선행연구에서 한외여과막과 TCA를. 등, 1997; Martindale과 Holbrook, 2002). 본 연구에서는. 이용한 해삼 단백가수분해물 분획물의 DPPH 라디칼 소거. peroxidase의 기질인 ABTS를 이용하여 장수풍뎅이 유충. 능(IC50)을 각 3.40 mg/mL와 2.40 mg/mL로 보고하였으며,.

(6) 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성. 분해물을 표준물질인 Trolox로 환산하여 나타내었을 때 Han 등(2014)은 1 g/mL의 농도에서 4 μg TE에 해당하는 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다. 그리고 장수풍뎅이 유 충의 alcalase, flavourzyme 및 neutrase 단백가수분해물 은 1 g/mL에서 2.22 mg TE, 2.45 mg TE 및 2.46 mg. Absorbance at 532 nm .. 소거 활성이 우수한 것을 알 수 있다. 또한 돼지의 비장 가수. control 200 μg/mL Trolox 1.25 μg/mL. 1.0. 이와 비교할 때 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 DPPH. 0.8. 품종 메탄올 추출물의 IC50값을 350.77 μg/mL로 보고하였 으며, 이와 비교해서도 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 상대적으로 우수한 것으로 나타. a. a. b. b c d d. a. 0.4 a. 0.2. b. b 0.0 0. 1. 폴리페놀 성분이 함유된 식물성 시료에서 ABTS 라디칼 소 거 활성을 보고한 Kim과 Ahn(2014)은 방울토마토 betatini. 100 μg/mL 400 μg/mL. 0.6. TE로 나타나 돼지 비장 가수분해물보다 장수풍뎅이 단백가 수분해물의 DPPH 라디칼 소거능이 우수한 것을 알 수 있다.. 415. 2. 3. 4. 5. Time (day). Fig. 3. Inhibitory effects of the alcalase hydrolysates from Allomyrina dichotoma larvae on linoleic acid peroxidation. Each value is mean±SE (n≥3) and different letters (a-d) at the same day are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.. 났다. 또한 Bousopha 등(2016)의 연구에 따르면 갑오징어 피부에서 분리한 콜라겐 단백가수분해물의 ABTS 소거 활. 단백가수분해물보다 linoleic acid에 대한 산화 억제 활성이. 성이 0.06 mg TE/g protein으로 보고되었다. 이는 장수풍. 높음을 알 수 있다.. 뎅이 유충의 alcalase, flavourzyme, neutrase 단백가수분 해물의 경우 각각 73.38 mg TE/g protein, 52.48 mg TE/g. 식용곤충 3종의 ROS 소거 활성 비교. protein과 60.85 mg TE/g protein으로 갑오징어의 콜라겐. Yu 등(2017)과 Lee 등(2017)의 선행연구를 살펴보면 갈. 단백가수분해물보다 훨씬 우수한 것을 알 수 있다. 오징어에. 색거저리와 흰점박이꽃무지 유충으로부터 제조한 alcalase. alcalase 효소 처리한 단백가수분해물의 H2O2 소거능을 측. 단백가수분해물의 수율은 각각 42.05%와 52.91%이며,. 정한 연구 결과(Choi 등, 2015)에서는 IC50이 111.5 μg/mL. flavourzyme과 neutrase를 처리한 단백가수분해물의 경우. 로 확인되었으며, 이 또한 장수풍뎅이 유충 alcalase 단백가. 는 수율이 26.27~39.35% 범위로 보고되고 있다. 이는 장수. 수분해물에 비해 H2O2 소거 활성이 많이 낮았다.. 풍뎅이 유충 alcalase 단백가수분해물의 수율이 50.70%로 flavourzyme과 neutrase 단백가수분해물들에 비해 높게. Linoleic acid에 대한 산화 억제 활성. 나타난 결과와 유사한 경향이다.. 지질 산화 초기에 발생하는 과산화물은 ferrous chloride. 따라서 이들 세 가지 식용곤충에서 전반적으로 수율이 높. 와 반응하여 빨간색에 가까운 ferric chloride 색소를 생성. 았던 alcalase를 이용해 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지. 하고 지질 산화가 계속되면 malonaldehyde와 같은 저분자. 유충 및 장수풍뎅이 유충으로부터 각각의 단백가수분해물. 의 화합물이 생기는데 이것은 TBA와 결합하여 빨간색의. 을 제조한 후 3가지의 ROS에 대한 소거 활성을 비교하였으. 화합물을 형성한다(Lee 등, 2017). 따라서 본 실험에서는. 며, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다.. 불포화지방산인 linoleic acid를 기질로 하여 장수풍뎅이 유 충 단백가수분해물의 산화 방지 효과를 알아보았다.. 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지 유충과 장수풍뎅이 유 충 단백가수분해물을 400과 800 μg/mL의 농도로 처리한. Alcalase, flavourzyme 및 neutrase 단백가수분해물들. 후 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 400 μg/mL에서. (<3 kDa)의 linoleic acid에 대한 산화 억제 활성을 확인해. 각각 26.85%, 74.76%와 35.37%, 그리고 800 μg/mL에서. 본 결과 단백가수분해물 간에 유의적인 차이가 나타나지 않. 각각 49.92%, 89.00%와 76.06%의 저해율을 나타내었다.. 았으며(data not shown), 따라서 3종의 장수풍뎅이 유충. 3종의 단백가수분해물이 두 농도 구간에서 유의적인 차이를. 단백가수분해물 중 수율이 가장 높았던 alcalase 단백가수. 보였으며, 흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이 및 갈색거저리 유충. 분해물을 이용하여 100∼400 μg/mL의 농도로 처리한 후. 의 단백가수분해물 순으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 상대. 산화 억제 활성을 시간별로 측정하였다(Fig. 3). 대조구의. 적으로 우수한 것을 확인하였다.. 경우 시간이 지날수록 지질과산화물이 증가하였으며, 대조. ABTS 라디칼 소거 활성을 40과 80 μg/mL 농도에서 측. 구의 5일째 흡광도 값을 100%로 봤을 때, alcalase 단백가. 정하여 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지 유충과 장수풍뎅. 수분해물은 처리 농도가 높아짐에 따라 지질과산화물이 각. 이 유충 순으로 비교하였을 때, 40 μg/mL 농도에서 각각. 각 63, 68, 73%로 산화가 유의적으로 억제되는 경향을 보였. 52.54%, 40.42%와 51.06%, 그리고 80 μg/mL에서는 각각. 다. 이는 Lee 등(2017)과 Yu 등(2017)의 선행 연구들과 비. 72.85%, 62.20%와 73.59%로 나타났다. 이는 장수풍뎅이. 교해볼 때 장수풍뎅이 유충의 alcalase 단백가수분해물의. 유충과 갈색거저리 유충 간에 유의적인 차이는 없었지만,. 경우 흰점박이꽃무지 유충 및 갈색거저리 유충의 alcalase. 흰점박이꽃무지 유충과 비교해서는 이들 두 유충이 우수한.

(7) 류희정 ․ 송현지 ․ 이승욱. 416. 었지만, 흰점박이꽃무지 유충과 비교해서는 이들 두 유충이 우수한 소거 활성을 보이는 것을 알 수 있었다.. 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 유리 아미노산 함량 장수풍뎅이 유충의 가수분해 전과 후의 아미노산 조성과 함량의 변화를 알아보기 위해 가수분해도가 가장 높았던 alcalase를 선발하여 단백가수분해물을 제조한 후 가수분해 전의 건조된 장수풍뎅이 유충과의 차이를 비교하였다. 먼저 총 유리 아미노산 함량의 경우 건조 유충과 alcalase 단백가 수분해물이 각각 38.97 μg/mg과 143.76 μg/mg으로 확인되 었으며, 단백가수분해를 통해 20종 아미노산의 함량이 대체 로 증가한 것을 알 수 있었다(Table 5). Alcalase 단백가수 Fig. 4. DPPH, ABTS, and H2O2 radical scavenging activities of the alcalase hydrolysates from Tenebrio molitor larvae, Protaetia brevitarsis larvae, and Allomyrina dichotoma larvae. Each value is mean±SE (n≥3) and different letters (a-c) at the same concentration are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. ABTS 라디칼 소거 활성을 보이는 것을 알 수 있었다.. 분해물의 경우 특히 glutamine, arginine, alanine 및 proline이 총 아미노산 함량 대비 10% 이상의 높은 함량을 보이 는 것으로 나타났다.. 요. 약. 장수풍뎅이 유충 분말을 4%(w/v)의 기질용액으로 제조하. H2O2 소거 활성의 경우 40 μg/mL 농도에서 갈색거저리. 여 기질 대비 단백질 가수분해효소(alcalase, flavourzyme,. 유충, 흰점박이꽃무지 유충과 장수풍뎅이 유충이 각각 40.44. neutrase, bromelain 및 papain)를 각 1%(w/v) 첨가한 후. %, 35.70%와 55.02%, 그리고 80 μg/mL에서 각각 59.20%,. 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물을 제조하였다. 효소별 가. 50.65%와 60.98%로 나타났다. 40 μg/mL 처리 농도에서는. 수분해물의 특성을 SDS-PAGE와 free amino group의 농. 장수풍뎅이 유충의 단백가수분해물이 다른 두 종에 비해 유. 도를 측정하여 확인한 결과, alcalase가 가장 높은 가수분해. 의적으로 높은 소거 활성을 보였으며, 80 μg/mL에서는 장. 도를 보인 데 반해 bromelain과 papain은 상대적으로 아주. 수풍뎅이 유충과 갈색거저리 유충 간에 유의적인 차이는 없. 낮은 가수분해도를 보였다. 가수분해도가 높았던 3종의 효 소를 이용하여 제조한 단백가수분해물을 각각 한외여과막. Table 5. Free amino acid patterns in dried Allomyrina dichotoma larvae and its alcalase hydrolysate (μg/mg) Free amino acids. ADL. 1). Cysteine 0.22 Aspartic acid 0.20 4.43 Glutamic acid 0.19 Asparagine 0.54 Serine Glutamine 1.56 Glycine 2.96 0.27 Histidine 2.83 Arginine 0.39 Threonine 2.87 Alanine Proline 8.72 Tyrosine 1.85 3.84 Valine 0.13 Methionine 1.59 Isoleucine Leucine 0.92 Phenylalanine 1.24 2.51 Tryptophan 1.72 Lysine Total 38.97 1) ADL: Allomyrina dichotoma larvae. 2) ADL-AH: ADL alcalase hydrolysate.. ADL-AH2) 0.29 1.37 14.35 0.43 1.43 1.43 8.99 1.53 14.42 1.01 15.31 18.50 10.90 12.39 1.87 12.19 7.56 4.91 8.09 6.78 143.76. 을 통해 분자량 3 kDa 이하로 분리한 후 항산화 실험을 수행 하였다. DPPH 라디칼 소거 활성의 경우 neutrase와 flavourzyme 단백가수분해물이 alcalase 단백가수분해물에 비해 상대적으로 높게 나타났으며, ABTS 라디칼 소거 활성 은 alcalase, neutrase, flavourzyme 단백가수분해물 순으 로 높게 나타났다. H2O2 소거 활성은 flavourzyme 단백가 수분해물이 다른 두 가수분해물에 비해 월등히 높았으며, 저분자 펩타이드 생산 효율이 가장 높았던 장수풍뎅이 alcalase 단백가수분해물을 대상으로 농도별 linoleic acid 과 산화 억제 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 유의적인 과산화 억제 활성을 보였다. 한편, 장수풍뎅이 유충 alcalase 단백가수분해물의 ROS 소거 활성을 다른 2종의 식용 곤충 즉 갈색거저리 유충과 흰점박이꽃무지 유충으로부터 제조한 각각의 alcalase 단백가수분해물과 비교한 결과, 장 수풍뎅이 유충 단백가수분해물이 상대적으로 우수한 ROS 소거 활성을 보이는 것을 확인하였다. 최종적으로 본 연구를 통해 여러 단백 분해 효소원들을 이용하여 장수풍뎅이 유충 의 단백가수분해물 제조 특성을 조사하였으며, 이들 단백가 수분해물들(<3 kDa)의 우수한 항산화 활성을 확인할 수 있 었다. 이는 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물을 활용한 항산 화 소재 개발의 가능성을 시사하며, 나아가 새로운 기능성.

(8) 장수풍뎅이 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성. 식품 개발에도 장수풍뎅이 유충이 활용될 수 있을 것으로 기대된다.. 감사의 글 본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ01228401 2018)의 지원에 의해 이루어진 것임.. REFERENCES Arihara K, Nakashima Y, Mukai T, Ishikawa S, Itoh M. Peptide inhibitors for angiotensin Ⅰ-converting enzyme from enzymatic hydrolysates of porcine skeletal muscle proteins. Meat Sci. 2001. 57:319-324. Bousopha S, Nalinanon S, Sriket C. Production of collagen hydrolysate with antioxidant activity from Pharaoh cuttlefish skin. J Nat Sci. 2016. 15:151-162. Chabance B, Jollès P, Izquierdo C, Mazoyer E, Francoual C, Drouet L, et al. Characterization of an antithrombotic peptide from α-casein in newborn plasma after milk ingestion. Br J Nutr. 1995. 73:583-590. Chung MY, Kwon EY, Hwang JS, Goo TW, Yun EY. Establishment of food processing methods for larvae of Allomyrina dichotoma, Korean horn beetle. J Life Sci. 2013. 23:426-431. Chung MY, Yoon YI, Hwang JS, Goo TW, Yun EY. Anti-obesity effect of Allomyrina dichotoma (Arthropoda: Insecta) larvae ethanol extract on 3T3-L1 adipocyte differentiation. Entomol Res. 2014. 44:9-16. Chung YC, Huang C, Tseng CP. Removal of hydrogen sulphide by immobilized Thiobacillus sp. strain CH11 in a biofilter. J Chem Technol Biotechnol. 1997. 69:58-62. Choi JH, Kim KT, Kim SM. Biofunctional properties of enzymatic squid meat hydrolysate. Prev Nutr Food Sci. 2015. 20: 67-72. Choi DW, Kim NH, Song KB. Isolation of iron-binding peptides from sunflower (Helianthus annuus L.) seed protein hydrolysates. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013. 42:1162-1166. Cudjoe E, Wiederkehr TB, Brindle ID. Headspace gas chromatography-mass spectrometry: a fast approach to the identification and determination of 2-alkyl-3-methoxypyrazine pheromones in ladybugs. Analyst. 2005. 130:152-155. Ha YJ, Yoo SK. Process optimization of peptides production from protein of sea cucumber and its antioxidant capacity analysis. J Korean Oil Chem Soc. 2017. 34:338-348. Han KH, Shimada K, Hayakawa T, Yoon TJ, Fukushima M. Porcine splenic hydrolysate has antioxidant activity in vivo and in vitro. Korean J Food Sci An. 2014. 34:325-332. Ham H, Woo KS, Lee B, Park JY, Sim EY, Kim BJ, et al. Antioxidant compounds and activities of methanolic extracts from oat cultivars. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015. 44:16601665. Kang IJ, Chung CK, Kim SJ, Nam SM, Oh DH. Effects of Protaetia orientalis (Gory et Perchlon) larva on the lipid metabolism in carbon tetrachloride administered rats. Korean J Electron Microscopy. 2001. 31:9-18. Kim HR, Ahn JB. Antioxidative and anticancer activities of the betatini cultivar of cherry tomato (Lycopersicon esculentum var. cerasiforme) extract. Food Eng Prog. 2014. 18:359-365. Kim M, Youn K, Yun EY, Hwang JS, Ahn MR, Jeong WS, et. 417. al. Effects of solvent fractions of Allomyrina dichotoma larvae through the inhibition of in vitro BACE1 and β-amyloid(25－ 35)-induced toxicity in rat pheochromocytoma PC12 cells. Entomol Res. 2014. 44:23-30. Kim SK, Choi YR, Park PJ, Choi JH, Moon SH. Purification and characterization of antioxidative peptides from enzymatic hydrolysate of cod teiset protein. J Korean Fish Soc. 2000. 33:198-204. Lee HS, Ryu HJ, Song HJ, Lee SO. Enzymatic preparation and antioxidant activities of protein hydrolysates from Protaetia brevitarsis larvae. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2017. 46:11641170. Lee SH, Song KB. Isolation of an angiotensin converting enzyme inhibitory peptide from irradiated bovine blood plasma protein hydrolysates. J Food Sci. 2003. 68:2469-2472. Lee JE, Jo DE, Lee AJ, Park HK, Youn K, Yun EY, et al. Hepatoprotective and anticancer activities of Allomyrina dichotoma larvae. J Life Sci. 2015. 25:307-316. Matsushita S, Iwami N, Nitta Y. Colorimetric estimation of amino acids and peptides with the Folin phenol reagent. Anal Biochem. 1966. 16:365-371. Müller HE. Detection of hydrogen peroxide produced by microorganisms on an ABTS peroxidase medium. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A. 1985. 259:151-154. Martindale JL, Holbrook NJ. Cellular response to oxidative stress: signaling for suicide and survival. J Cell Physiol. 2002. 192: 1-15. Oh SM, Seo JH, Lee SP. Production of fibrinolytic enzyme and peptides from alkaline fermentation of soybean curd residue by Bacillu firmus NA-1. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2005. 36:904-909. Pihlanto A. Antioxidative peptides derived from milk proteins. Int Dairy J. 2006. 16:1306-1314. Pihlanto-Leppälä A. Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioid and ace-inhibitory peptides. Trends Food Sci Technol. 2000. 11:347-356. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, RiceEvans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med. 1999. 26:1231-1237. Torres-Fuentes C, Alaiz M, Vioque J. Affinity purification and characterisation of chelating peptides from chickpea protein hydrolysates. Food Chem. 2011. 129:485-490. van Huis A, Van Itterbeeck J, Klunder H, Mertens E, Halloran A, Muir G, et al. Edible insects: future prospects for food and feed security. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. 2013. p 67-80. Wang C, St. Leger RJ. Developmental and transcriptional responses to host and nonhost cuticles by the specific locust pathogen Metarhizium anisopliae var. acridum. Eukaryot Cell 2005. 4:937-947. Yamada M, Nakamura K, Saido-Sakanaka H, Asaoda A, Yamakawa M, Sameshima T, et al. Effect of modified oligopeptides from the beetle Allomyrina dichotoma on Escherichia coli infection in mice. J Vet Med Sci. 2004. 66:137-142. Youn K, Kim JY, Yeo H, Yun EY, Hwang JS, Jun M. Fatty acid and volatile oil compositions of Allomyrina dichotoma larvae. Prev Nutr Food Sci. 2012. 17:310-314. Yu MH, Lee HS, Cho HR, Lee SO. Enzymatic preparation and antioxidant activities of protein hydrolysates from Tenebrio molitor larvae (mealworm). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2017. 46:435-441..

(9)