Comparative Analysis of Coat Protein Gene of Isolates of Cucumber mosaic virus Isolated from Pepper Plants in Two GMO Environmental Risk Assessment Fields

(1)

Res. Plant Dis. 15(3) : 165-169 (2009)

©The Korean Society of Plant Pathology

GM 격리포장 내 고추에서 분리한 Cucumber mosaic virus

분리주들의 외피단백질 유전자 비교

홍진성¹·박호섭·류기현¹·최장경*

강원대학교 응용생물학과

,

¹^{서울여자대학교} ^{환경생명과학부}

Comparative Analysis of Coat Protein Gene of Isolates of Cucumber mosaic virus Isolated from Pepper Plants in Two GMO Environmental

Risk Assessment Fields

Jin Sung Hong¹, Ho Seop Park,Ki Hyun Ryu¹ and Jang Kyung Choi*

Department of Applied Biology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea

1

Division of Environment & Life Sciences, Seoul Women's University, Seoul 139-774, Korea (Received on November 2, 2009; Accepted on December 2, 2009)

Twelve Cucumber mosaic virus (CMV) isolates were isolated from genetically modified (GM) and non-GM Capsicum annuum in two GM fields, Namyangju and Anseong, and their properties were investigated in this study. Coat protein (CP) gene of the CMV isolates were synthesized by RT-PCR using genus-specific primers which designed to amplify a DNA fragment of 950 bp. Purified cDNA fragments were cloned into the pGEM- T easy vector for sequence determination. Nucleotide sequences (internal 657 bp) of CMV isolates were com- pared with Fny-CMV CP sequences and there were no significant collection site specific sequence similarities found. When predicted amino acid sequences (219 amino acids) were compared with Fny-CMV CP amino acids sequences, there were 96.8% to 97.3% similarities found from Namyangju collections and 95.9% to 96.8% similarities from Anseong collections. The phylogenetic analysis with nucleotide sequences showed def- inite differences in CMVs which have been isolated from the two regions.

Keywords : Coat protein gene, Cucumber mosaic virus , Genetically modified pepper, Nucleotide sequence, Regional difference

고추에서 발생하는 바이러스는 세계적으로 약

60

^여종

이 보고되어 있으며

(Kim

^과

Choi, 2002),

^국내의 ^경우

Cucumber mosaic virus (CMV)

^등

10

^여종이 ^보고되어 ^있

다

(Kim

^등

, 1990;

^{학국식물병리학회}

, 2004; Choi

^등

, 2005).

이들바이러스중

CMV, Pepper mild mottle virus (PMMoV), Pepper mottle virus (PepMoV), Broad bean wilt virus

(BBWV)

^는 ^{전국적으로}^발생하여 ^피해를 ^주고^있다

.

CMV

^는

Bromoviridae

의

Cucumovirus genus

^에^속하는^대

표바이러스이다

(Murphy, 1995).

^바이러스^입자는^직경

30 nm

의구형으로

, 3

^종의^외가닥^게놈

RNA

^를^가지고^있다

(Peden

과

Symons, 1973).

^바이러스^중^가장^넓은^{기주범위를}^가

지고 있는

CMV

^는 ^그 ^범위가

1000

^여 ^종의 ^식물에 ^감염

된다고보고된바있으며

(Douine

^등

, 1979; Peter

^과

Garcia, 2003),

^{고추에서는}^가장^널리^분포하고^있다

(Choi

^등

, 2005;

Cho

^등

, 2006).

^최근^유전자 ^도입^기술의 ^발전에 ^의한^저

항성 고추품종 육성이 활발히 진행되고 있으며

,

^국내의

경우

Agrobacterium

^{형질전환법을} ^이용하여 ^개발한

Fny-

CMV CP

^유전자를^갖는

CMV

^내병성 ^유전자 ^변형^고추

(Lee

^등

, 2009)

^를 ^남양주와 ^안성의

GM

^{격리포장에서} ^시

험 재배하고있다

.

^본 ^연구는 ^두

GM

^{격리포장의}^고추로

부터

CMV

^의^전형적인 ^모자이크^병징을 ^확인하고

GM

^과

Non-GM

^고추에서 ^발현하는

CMV

^의 ^특성 ^차이

,

^지역별

로발생하는

CMV

^간^차이

,

^바이러스 ^{분리시기에}^따른^차

이및

Fny-CMV

^와

GM

^고추에서 ^분리된

CMV

^분리주간

의차이를분자적수준에서비교조사하기위해실시하였다

.

공시바이러스분리. 경기도 남양주와안성

GM

^격리

*Corresponding author

Phone) +82-33-250-6432, Fax) +82-33-241-1721

Email) [email protected]

(2)

포장에서 시험재배되고 있는

CMV

^내병성 ^유전자 ^변형

고추에 대하여 모자이크 병징을 나타내는

GM

^고추와

Non-GM

^{고추로부터}

2

^회에 ^걸쳐 ^바이러스 ^병징이 ^뚜렷

한

8

^{개체로부터}

12

^점의^잎을^선발^{채집하였다}

. 0.01 M

^인

산완충액을 이용한 즙액접종을

Nicotiana benthamiana

에 실시하였다

.

^{바이러스가}^증식된

N. benthamiana

의이병엽 을

Chenopodium amaranticolor

의 잎에접종한 후단일병 반분리를

3

^회 ^{실시하였으며}

,

^분리된^{바이러스를} ^다시

N. benthamiana

에증식시켜 그 이병엽을 공시재료로이용하

였다

.

Fig. 1. RT-PCR products from Pepper CMV isolates using CMV specific primer. M, 100 bp DNA marker; Lane 1~12, PCR prod- uct of 12 CMV field isolates.

Fig. 2. Nucleotide sequence differences from Fny-CMV coat protein gene. Different nucleotide sequences of field collected pepper CMV isolates (1-12) were indicated by bold letters.

(3)

CMV의 RT-PCR 검정 및 클로닝.

GM

^고추와

Non-

GM

^고추에서 ^발생하는

CMV

^의 ^차이와 ^지역별

,

^바이러스

분리시기별

CMV

^간^변이의^차이를^{알아보고자}^채집을^실

시하였으며 각 분리주에 대한 번호를 부여하였다

(Table 1).

^순수 ^분리된

CMV

^를 ^증식시킨

N. benthamiana

의 이 병엽로부터

Total RNA

^를^분리한^후

CMV specific primer

Fig. 3. Predicted amino acid sequence differences from Fny-CMV coat protein. Different amino acid sequences of field collected pepper CMV isolates (1-12) of the two regions were marked as boxes.

(4)

를 이용한 외피단백질 영역을포함하는

CMV RNA3

^부

분에대한

RT-PCR

^검정을^실시한 ^결과

, 12 CMV

^분리주

모두 예상된 약

950 bp

^의 ^밴드가 ^{확인되었다}

(Fig. 1).

^각

cDNA

^절편을 ^정제하여

pGEM-T easy

^벡터에 ^클로닝하

였다

. CMV

^{외피단백질} ^유전자를 ^포함하는

cDNA

^단편

이삽입된클론들을제한효소

Eco R I

^을^처리하여^약

950 bp

의크기를갖는클론을선발하여염기서열결정에사용하였다

.

염기서열 결정 및 변이분석. 이미 알려진

Fny-CMV

의 외피단백질 염기서열과 고추에서 분리된

CMV

^를 ^비

교하기 위하여 외피단백질이 포함된

cDNA

^를 ^이용하여

염기서열을결정하였다

.

^그^결과

941 bp

^에서

942 bp

^의 ^염

기를확인하였으며이염기서열에서

CMV

^{외피단백질}^유

전자및

3'

^말단^{비번역영역이}^{확인되었다}

.

^{외피단백질}^유

전자는

657

^개의 ^염기로 ^{구성되었으며}

,

^이들 ^{염기로부터}

218

^잔기의 ^아미노산 ^서열이 ^{해석되었다}

.

^남양주와 ^안성

포장의 고추

CMV

^분리주의 ^{외피단백질} ^유전자에 ^대한

염기 및 아미노산서열을 기존에 보고된

Fny-CMV

^의 ^염

기 및 아미노산서열과 비교하였다

(Fig. 2, 3).

^그 ^결과 ^각

포장의 고추에서 분리한

CMV

^들은 ^염기서열 ^분석에서

Fny-CMV

^와

92.9%

^에서

93.8%

^까지의^고른^유사성을^보이

며 그 차이를보이지 않았다

.

^그러나^{아미노산서열} ^분석

에서는 남양주의 고추포장에서 분리된

CMV

^가

96.8%

^에

서

97.3%

^의^유사성을^보인^반면

,

^안성의^{고추포장에서}^분

리된

CMV

^는

95.9%

^에서

96.8%

^의 ^유사성을 ^{보임으로서}

두 지역에서 분리된

CMV

^에서^다소 ^변이의 ^차이를 ^나타

내었다

(Table 1).

^특히

, Fig. 3

^에서^보듯이

,

^{남양주에서} ^분

리된

CMV

^분리주와

Fny-CMV

^모두

88

^번째^아미노산^잔

기에서

Lysine(K)

^을^{포함하지만}^{안성포장의}

CMV

^분리주

는

Arginine(R)

^을 ^{포함하였으며}

, 91

^번째^잔기에서 ^전자는

Leucine(L)

^을^{포함하지만}^후자는

Valine(V)

^을^포함하는^것

이확인되었다

.

^앞서^분석된^{외피단백질}^유전자의^염기서

열을이용하여 계통발생분석을 실시한 결과남양주와 안 성에서 각각 분리한

CMV

^는 ^서로^다른^그룹을 ^형성하였

으며 지역별 분리주에 의한 차이를 재확인할 수 있었다

(Fig. 4).

^이들^결과는

,

^남양주와 ^안성의

GM

^및

Non-GM

고추에서

8

^월 ^초순과 ^하순에 ^각각 ^분리된 ^{바이러스라는}

사실에 미뤄볼 때

, GM

^과

Non-GM

^고추의 ^분리주간 ^차

이와 바이러스 분리 시기에 따른 차이는 인정되지 않은 반면분리 지역에 따른바이러스변이 차이가 있는것으 로 판단되었다

.

요 약

남양주와안성의

GM

^고추 ^{격리포장에서} ^모자이크 ^병

징이뚜렷한 이병주들로부터 바이러스를채집하여 그 특 성을조사하였다

. CMV RNA3

^의^{외피단백질}^유전자를^포

함하는

3'

^말단 ^부분에 ^대한 ^특이 ^{프라이머를} ^이용하여

RT-PCR

^을 ^실시한 ^결과

,

^{예상되었던} ^약

950 bp

^의 ^밴드가

확인되었다

.

^이

PCR

^산물을^이용하여^클로닝을^실시하였

으며 분석된 외피단백질유전자 염기서열을 토대로 기존

에 알려진

Fny-CMV

^{외피단백질유전자}^{염기서열과} ^비교

하였다

.

^남양주와 ^안성에서 ^채집된 ^각 ^{분리주들은}

Fny- CMV

^{염기서열과의} ^상동성에 ^있어 ^특별한 ^차이를 ^보이

지 않았지만 염기서열을 이용한 계통발생분석에서는 두 지역간

CMV

^가^확연히^다른^그룹으로^나타났다

.

^한편

,

^분

리된 각

CMV

^의 ^{외피단백질유전자} ^{염기서열을} ^통해 ^확

인된 아미노산서열과

Fny-CMV

^의 ^{외피단백질} ^아미노산

서열을 비교한 결과

,

^{남양주에서} ^분리된

CMV

^가

96.8%

Table 1. Comparison of nucleotide and amino acid sequence homologies among Fny-CMV and Pepper CMV isolates

CMV isolates^a Percentage of coat protein identity Nucleotide Amino acid

Fny-CMV 100 100

1 93.0 97.3

2 93.0 97.3

3 92.9 97.3

4 93.0 97.3

5 93.0 97.3

6 92.9 96.8

7 92.9 95.9

8 92.9 95.9

9 93.3 96.8

10 93.8 96.8

11 93.6 96.8

12 93.2 96.4

a

CMV isolates were collected from Ansung GMO environmental risk assessement field (1-3 and 5-6; GM isolates, 4; Non-GM isolate) and Deokso GMO environmental risk assessement field (7-8 and 10-12;

GM isolates, 9; Non-GM isolate).

Fig. 4. Phylogenetic analysis based on nucleotide sequence of coat protein of Fny-CMV and Pepper-CMV isolates (1-12).

(5)

에서

97.3%

^의^유사성을 ^보인^반면

,

^안성의 ^{고추포장에서}

분리된

CMV

^는

95.9%

^에서

96.8%

^의^유사성을 ^보였다

.

^특

히남양주에서분리된

CMV

^와

Fny-CMV

^모두

88

^번째^잔

기에서

Lysine(K)

^을^{포함하지만}^안성에서^분리된

CMV

^는

Arginine(R)

^을 ^{포함하였으며}

, 91

^번째 ^잔기에서 ^전자는

Leucine(L)

^을^{포함하지만}^후자는

Valine(V)

^을^포함하는^것

이확인되었다

.

^이^같은^결과를^종합해볼^때

,

^남양주와^안

성의고추에서각각분리된

CMV

^는^서로^다른^지역적 ^특

색을 나타내는 것으로 확인되었다

.

감사의 글

본연구결과는 학술진흥재단기초연구과제

(KRF-2006- 311-C00560)

^와 ^{농촌진흥청} ^{바이오그린}

21

^과제

(

^과제번호

:20070301034010)

^의 ^지원으로 ^수행된 ^것으로 ^본 ^논문을

발표하는 자리를 빌려 감사를 표합니다

.

참고문헌

Cho, J. D., Lee, S. H., Choi, G. S., Lim, T. J., Chung, B. N., Ryu, K. H. and Kim, J. S. 2006. Viruses and their mixed infections on red peppers at Jeolla-do Province in 2005.(Abstr.) Plant Pathol. J. 21: 124-125.

Choi, G. S., Kim, J. H., Lee, D. H., Kim, J. S. and Ryu, K. H.

2005. Occurrence and distribution of viruses infecting pepper in Korea. Plant Pathol. J. 21: 258-261.

Choi, J. K., Kim, H. J., Hong, J. S., Kim, D. W. and Lee, S. Y.

1998. Identification and differentiation of Cucumber mosaic virus isolates in Korea. Korean J. Plant Pathol. 14: 7-12.

Choi, S. K., Choi, J. K., Park, W. M. and Ryu, K. H. 1999. RT- PCR detection and identification of three species of cucumoviruses with a genus-specific single pair of primers. J.

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