사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

전분 입자의 나노

blocklet

임승택 고려대학교 생명과학대학

1. 서 론

1.1 연구배경

• 전분은 에너지 저장 탄수화물로 식물체의 아밀로플라스트에서 생합성되는 식품의 주성분으로 섭취될 뿐 아니라, 회수된 전분은 가공식품, 제지, 의약, 화장품 등 다양하게 활용되고 있음.

• 전분은 친환경적 생분해성 고분자 소재로서, 안전하며, 무한 재생자원으로 가격이 저렴하여 산업적 응용 가능성이 높은 소재임.

• 천연 전분 입자 구조는 아밀로펙틴 사슬이 규칙적으로 배열되어 있는 cluster와 아밀로즈 사슬이 불규칙적으로 분산되어 있는 구조임(Oates, 1997).

• 이러한 cluster는 규칙적이며 견고하고 나란하게 glucan chain이 배열되어 있는 결정 영역과 주로 glucan의 branch point로 구성되어 있는 무정형 영역이 순차적으로 교차하고 있는 구조를 갖고 있음.

• 전분 입자의 결정 영역은 주로 전분 입자의 견고한 층에 위치하며 두께는 120～140nm임.

• 결정 영역은 전분 입자의 뼈대를 구성하는 결정성 판막의 집합체로 구성되어 있으며, 판막의 두께는 평균 9～10nm 정도임(Oostergetel et. al., 1989; Jenkins et al., 1993; Robin, et al., 1974).

• 천연 전분 입자의 결정성은 대략 15～45%이며(Zobel, 1988), X­ray diffraction에 따라 A타입, B타입 그리고 A타입과 B타입이 혼재되어 있는 C타입으로 분류됨. 이러한 결정 형태의 차이는 아밀로펙틴 side chain 이중 나선들의 배열 차이에 기인한 것임.

• <Figure 1>에서 도시된 것과 같이 아밀로펙틴의 결정 영역과 무정형 영역은 상부 구조물을 형성하는데, 이 구조를 ‘blocklets’이라고 지칭함(Gallant et al., 1997).

<Figure 1> Overview of starch granule structure

• 전분 입자의 blocklets은 전분 종류나 전분 입자 내부에서의 위치에 따라 20～500nm 정도임 (Gallant et al., 1997).

• blocklets은 효소 혹은 산 가수분해에 대하여 내성을 지니고 있다고 밝혀져 있음(Oates, 1997).

• blocklets의 존재는 최근 연구결과로 밝혀졌으나, 아직 정확한 구조 및 이화학적 특성에 관한 연구가 되어 있지 않음.

1.2 연구의 필요성

• 전분의 blocklets은 전분 입자의 기본이 되는 단위로서, blocklets의 특성을 이해하는 것은 전분 입자의 구조를 규명하는 핵심적인 연구임.

• 또한 전분의 blocklets은 나노 단위의 결정체로, 이를 회수하면 나노 신소재로 개발이 가능할 것으로 사료됨.

1.3 연구목표

• 전분의 결정성(A타입: 찰옥수수 전분, B타입: 감자 전분, C타입: 녹두 전분) 및 아밀로즈 함량(찰옥수수 전분: 0～1%, 옥수수 전분: 28%, 고아밀로즈 옥수수 전분: 70% 이상)의 차이에 따른 blocklets의 모양 및 크기, 결정성 및 열전이 특성, 그리고 구조적 특성을 규명함.

1.4 연구내용

• 산이나 효소는 전분 입자의 무정형 영역을 선택적으로 가수분해함. 반면 결정 영역은 상대적으로 효소나 산의 영향을 받지 않음.

• 따라서 산이나 효소를 이용하여 전분 입자의 무정형 영역을 선택적으로 제거할 수 있음.

• blocklets은 효소나 산 가수분해에 내성을 갖고 있기 때문에 쉽게 분해되지 않음.

<Figure 2> blocklets 분리 과정 모식도

• 상기 <Figure 2>와 같이 전분 입자의 무정형 영역이 가수분해된 후, 내성을 갖는 고결정성 blocklets이 잔류하게 되며 blocklets을 분리할 수 있음.

• 전분의 결정 형태, 전분 입자의 크기, 아밀로즈 함량에 따른 다양한 전분을 대상으로 비교함.

• 가수분해 및 원심분리를 이용하여 전분 blocklets을 분리․회수함.

• 분리된 전분 blocklets 입자 크기 분포, 결정성, 구조를 관찰하고, 열전이 특성을 분석함.

2. 연구방법

2.1 전분의 종류

• 결정성의 차이에 따른 전분 시료 활용

(A타입: 찰옥수수, B타입: 감자, C타입: 녹두 전분)

• 아밀로즈 함량의 차이에 따른 전분 시료 활용 (찰옥수수, 옥수수, 고아밀로즈 옥수수 전분)

2.2 전분 입자의 분해 및 blocklets 회수

전분 입자(14.69g)를 3.16M 황산 용액(100ml)에 분산

↓

가수분해 반응(40℃에서 100rpm으로 교반하면서 5일 동안 반응)

↓

전분 현탁액을 같은 양의 증류수로 희석한 후 0.1M 수산화나트륨으로 중화함

↓

원심분리시켜 전분 회수(12,096×g, 10분)

↓

침전물의 일부는 증류수에 재분산한 후(1%, w/v) Ultra Turrax homogenizer로 균질화함(13,000rpm, 3분)

blocklets의 형태 및 크기 분포 측정에 사용함 나머지 침전물은 동결건조하여 분말 상태로 분석에 이용

2.3 전분 입자의 가수분해율

• 가수분해율: 전체(100%)에서 Yield를 제외한 값

산 가수분해 후 건조시료의 중량

• Yield(%)= × 100 산 가수분해 전 건조시료의 중량

2.4 회수된 blocklets의 모양 및 크기 관찰

• Transmision electron microscopy 이용(FEI Tecnai G2 F30, Eindhoven, Netherland)

• 폼바(formvar) 코팅된 microscopy grid 사용

• 2%(w/v) uranyl acetate로 3분간 음성 염색 후 실온 건조

• 300kV 가속전압에서 관찰

2.5 회수된 blocklets의 입자 분포도 분석

• Dynamic light scattering detector 이용(Dynapro Titan, Wyatt Technology, Santa Babara, CA)

• 굴절률: 1.333, 점도: 1.00cP(20℃, 증류수를 용매로 이용)

2.6 회수된 blocklets의 결정성 분석

• X­ray diffractometer 이용(MO3XHF22 MAC Science Co., Ishikawa, Japan)

• 측정전압: 40kV, 측정전류: 30mA

• 측정범위: 3～40˚(2θ)

• 측정속도: 1.0˚/min

2.7 회수된 blocklets의 열용융 특성 분석

• Differential scanning calorimetry 이용(Seiko DSC 6100, Chiba, Japan)

• 측정시료:증류수=1:2

• 측정온도: 40～125℃

• 가열속도: 5℃/min

2.8 회수된 blocklets의 분자구조 분석

• 회수된 blocklets을 90% DMSO와 알코올을 이용하여 정제화함(Klucinec and Thompson, 1998).

• 정제화된 전분은 탈분지 과정(Han, 2003)을 거친 후 아밀로펙틴의 분자구조 특성을 분석하였음.

• GPC­RI 시스템 조건

- 컬럼: medium­pressure superdex 75HR(10×300mm, Amersham Pharmachia, Uppsala, Sweden) - 검출기: refractive index(Shodex RI-71, Tokyo, Japan)

- 용매: 물 - 유속: 0.4ml/min

3. 결과 및 고찰

3.1 전분 입자의 가수분해

<Figure 3> Acid hydrolysis patterns for the blocklet isolation

• 상기 <Figure 3>는 7일 동안 산 가수분해 후 얻어진 전분의 가수분해 패턴을 보여 주고 있음.

• 문헌상 전분의 가수분해는 초기의 빠른 단계와 그 이후 상대적으로 느린 단계로 구분된다고 보고되고 있음. 또한 산은 쉽게 전분 입자 내부로 침투가 가능하지만 결정형 영역(crystalline region)에 비하여 무정형 영역(amorphous region)이 빠르게 가수분해되는 특성이 있음(R. Hoo- ver, 2000).

• 본 실험에서는 초기 3일까지는 전분의 종류에 상관없이 빠른 가수분해 패턴을 보였고, 5일부터는 상대적으로 느린 가수분해 패턴을 보이며 안정 상태에 접어들었음. 따라서 가수분해 5일째 샘플을 취하여 분석에 이용하였음.

• 초기 3일 동안에는 무정형 영역에서 주로 가수분해가 일어났으며, 그 후 결정형 영역의 가수분해가 일어났다고 사료됨. 무정형 영역이 우선적으로 제거됨에 따라 전분 입자의 구조적인 변화가 수반되어 전분 입자 구조가 불안정하게 될 것이라고 판단됨.

• 결정형 타입에 따른 가수분해 정도: 찰옥수수>감자>녹두

아밀로즈 함량에 따른 가수분해 정도: 찰옥수수>옥수수>고아밀로즈 옥수수

• A타입에 해당하는 찰옥수수 및 옥수수 전분의 가수분해 정도가 B타입에 해당하는 감자 및 고아밀로즈 전분보다 더 큰 것으로 관찰됨. 이는 Jane 등(1997)이 보고한 결과, 즉 B타입 전분이 A타입 전분보다 산에 대한 저항성이 높은 것과 일치함을 보여 줌.

• 다만 B타입에 해당하는 감자 전분의 가수분해 정도가 A타입과 거의 유사하게 높게 나타난 것은, 치밀하지 못한 가지 구조로 구성되어 있고 인의 함량이 높기 때문인 것으로 이미 논문에서 보고된 바 있음(Nakazawa & Wang, 2003).

• 옥수수 전분의 가수분해 정도를 비교해 볼 때 아밀로즈 함량이 높을수록 가수분해 정도가 낮은 것으로 관찰됨. 이는 아밀로즈 사슬들의 견고한 결정에 기인한다고 사료됨.

• 더불어 산은 직쇄상의 분자들보다 분지상의 분자들에 더 높은 민감성을 가지므로(BeMiller, 1965), 분지상의 분자들로 대부분 구성되어 있는 찰옥수수 전분의 가수분해 정도가 결정형 타입 혹은 아밀로즈 함량에 따라 비교했을 때 다른 전분들에 비해 더 높게 나타났다고 사료됨.

3.2 가수분해된 전분의 형태

• 결정형 타입에 따른 분류

• 아밀로즈 함량에 따른 분류

<Figure 4> TEM micrographs of negatively stained isolated blocklets

• 상기 <Figure 4>에서 나타난 것과 같이 5일 동안 산 가수분해 후 전분은 크기가 작은 입자로 관찰됨.

• TEM 관찰은 건조된 샘플을 가지고 수행되었기 때문에 이러한 작은 입자들이 서로 뭉쳐져 있는 것은 자연스러운 현상임이 기존 논문에 보고된 바 있으며(J. ­Y. Kim, S. ­T. Lim, 2009), 본 실험에서도 유사한 결과가 나타났음.

• 이 작은 입자들은 Le Corre 등(2010)이 보고한 논문에서와 같이 전분의 결정 형태인 A, B, C타입 또는 아밀로즈 함량에 따라 큰 차이를 보이지 않았음. 직경은 40～80nm, 모서리가 둥근 형태를 보임.

• 본 연구에서 회수된 작은 입자들은 문헌상 보고되고 있는 전분 입자의 blocklets 크기인 20～500nm 범위(Gallant et al., 1997) 내에 있으며 유사한 모양을 보임.

3.3 가수분해된 전분의 입자 크기 분포

• 결정형 타입에 따른 분류

• 아밀로즈 함량에 따른 분류

<Figure 5> Particle size distribution of isolated blocklets

• 상기 <Figure 5>는 가수분해된 전분의 입자 분포도를 나타내고 있으며, Dynamic light scat- tering detector를 이용하여 가수분해 직후 용액에 분산되어 있는 입자의 분포를 측정한 것임.

• DLS는 수화된 샘플의 hydrodynamic radius를 감지하여 입자의 크기를 측정하는 원리를 가지고 있음.

• 전분의 결정 형태에 따른 분류: A타입(180～500nm), B타입(70～500nm), C타입(400～700nm).

아밀로즈 함량에 따른 분류: 찰옥수수(180～220nm), 옥수수(300～500nm), 고아밀로즈 옥수수 (200～400nm).

• DLS 측정 결과 TEM 사진 상에서 보이던 개별적인 작은 입자의 크기가 아닌 여러 개의 입자들이 뭉쳐져 있는 크기로 측정되었음.

3.4 결정구조(X­ray diffraction)

• 결정형 타입에 따른 분류

• 아밀로즈 함량에 따른 분류

<Figure 6> X­ray diffraction patterns of isolated blocklets N: 전분 입자, AH: 가수분해된 전분 입자

• 호화온도 이하에서 산 가수분해 시 결정형 영역보다 무정형 영역의 전분이 더 빠르게 가수분해되며, 이로 인해 전분의 결정성이 증가하게 됨(Atichokudomchai et al., 2001).

• 본 실험 결과 산 가수분해된 전분 입자들은 결정형 타입과 아밀로즈 함량에 따라 전분 입자 고유의 X선 회절 패턴의 일부 변화가 관찰됨.

• 결정형 타입에 따른 X선 회절 패턴

- A타입: 15.0, 17.0, 18.1 그리고 23.5°(2θ) 부근에서 피크를 보임. 특히 찰옥수수 전분의 경우 산 가수분해로 인한 결정성의 증가를 보였음.

- B타입: 17°(2θ)에서 강한 피크와 6.5, 20, 22°(2θ)에서의 작은 피크를 보임. 산 가수분해된 전 분 입자의 경우 17, 22° 부근의 피크는 그대로 남아 있었지만, 6.5°(2θ) 부근의 피크가 감소하 는 경향을 보임.

- C타입: 15.0, 17.0, 18.1 그리고 23.5°(2θ) 부근에서 피크를 보임(A형에 가까운 타입). 산 가수 분해 후에도 동일한 부근에서 피크를 보임.

• 아밀로즈 함량에 따른 X선 회절 패턴: 아밀로즈 함량이 높은 고아밀로즈 옥수수의 경우 고유의 피크는 유지되었지만, 6.5°(2θ) 부근의 피크가 감소하는 경향을 보임.

• X선 회절 측정 결과 전분 입자의 무정형 부분만 산에 의해 우선적으로 제거되었고, 무정형 영역의 제거가 전분 입자의 파쇄를 유도하여, 결정형 blocklets을 전분 입자로부터 분리할 수 있었다고 사료됨.

3.5 열용융 특성

<Table 1> Thermal transition properties of isolated blocklets

Starches Melting Temperature(℃)^a Melting Enthalpy

△H(J/g)

To Tp Tc Tc-To

Waxy maize

Native 65.1±0.1 74.6±0.0 81.9±0.0 16.8±0.1 18.3±0.0

Hydrolyzed 57.7±0.2 92.4±0.1 117.5±0.1 59.8±0.1 34.6±0.5

Normal maize

Native 63.4±0.1 73.3±0.1 79.5±0.3 16.1±0.4 15.7±0.0

Hydrolyzed 60.2±0.4 89.1±0.0 116.7±0.2 56.5±0.6 20.2±0.2

High amylose maize

Native 70.6±1.1 98.7±0.1 117.5±0.3 46.9±1.3 15.3±0.0

Hydrolyzed -^b - - - -

Potato

Native 59.1±0.1 71.0±0.1 74.5±0.1 15.4±0.1 15.1±0.0

Hydrolyzed - - - - -

Mungbean

Native 60.2±0.1 71.9±0.1 81.2±0.2 21.0±0.4 17.2±0.0

Hydrolyzed - - - - -

a To, Tp, and Tc are onset, peak, and conclusion temperatures, respectively.

b Endotherm not detected.

• 실험 결과 결정형 타입과 아밀로즈 함량에 상관없이 전분들의 호화 최고온도(Tp)와 전이온도 범위(Tc­To) 값이 가수분해 후 증가함을 보임. 이러한 경향은 이전의 연구 결과와 일치함 (Donovan & Mapes, 1980; Jacobs et al., 1998; R. Hoover, 2000).

• 산 가수분해에 의한 무정형 영역의 우선적인 공격은 결정형 영역을 분리시키고, 더 이상 무정형 영역으로부터 불안정하지 않게 됨. 결과적으로 결정형 영역은 더 높은 온도에서 녹게 되고, 전이온도 범위(Tc­To)가 더 넓어지게 됨.

• 더불어 산 가수분해에 의한 짧은 사슬들이 증가한 것을 추정할 수 있음. 실제로 Donovan(1983)과 Waigh(2000) 등은 전이온도 범위의 확대가 더블 헬릭스 길이에 역으로 비례함을 발견하였음.

3.6 전분 사슬 길이 분포(Chain length distribution)

• 결정형 타입에 따른 분류

• 아밀로즈 함량에 따른 분류

<Figure 7> Chain profiles of isolated blocklets using GPC­RI Chromatograms 점선: 전분 입자, 실선: 가수분해된 전분 입자

• 상기 <Figure 7>은 산 가수분해 전후의 전분을 이소아밀라아제로 α­1,6 결합을 끊어주어 superdex 75HR을 이용하여 그 용출 패턴으로부터 사슬 분포를 살펴본 결과임.

• 결정형 타입에 따른 전분 사슬 길이의 분포: A타입에 해당하는 찰옥수수 전분은 이소아밀라아제에 의하여 크게 3개의 분획으로 나누어짐. 나머지 타입의 전분은 4개의 분획으로 나누어짐을 확인함.

아밀로즈 함량에 따른 전분 사슬 길이의 분포: 아밀로즈 함량이 적은 찰옥수수 전분은 크게 3개의 분획으로 나누어짐.

그 외에 옥수수 전분 및 고아밀로즈 옥수수 전분은 4개의 분획으로 나누어짐을 확인함.

• ‘분획 1’은 주로 α­1,4 결합으로 구성되어 있는 아밀로즈에 해당하며, ‘분획 2’는 아밀로펙틴의 긴 사슬인 B≥2 사슬, ‘분획 3’과 ‘분획 4’는 아밀로펙틴의 짧은 사슬에 해당하는 B1과 A사슬임.

• 산 가수분해 후 분자적 분해 현상이 일어났음을 관찰할 수 있었음. 특히 아밀로즈 사슬들과 아밀로펙틴의 긴 사슬들이 쉽게 분해되었음. 그 결과 모든 타입의 전분들에서 B1과 A사슬과 같은 짧은 사슬들이 차지하는 비율이 크게 증가하였음.

4. 요 약

• 전분 입자 내의 무정형 영역은 산 가수분해에 의해 선택적으로 제거됨. 가수분해 패턴을 통해 볼 때 3일을 기준으로 빠르고 느린 경향을 보였음. 3일 이전에 주로 무정형 영역의 분해가 이루어졌다고 생각됨.

• 무정형 영역의 제거 후 40～80나노미터 크기의 둥근 입자가 관찰되었으며, TEM과 DLS 측정 결과 모양과 크기가 기존의 문헌에서 보고되고 있는 blocklets과 유사함. 따라서 TEM과 DLS에서 관찰된 입자는 blocklets이라고 사료됨.

• 회수된 blocklets의 X선 회절 패턴은 전분 입자 고유의 것을 유지하는 경향을 보임. 따라서 blocklets 회수에 있어 산 가수분해에 의한 결정학적 구조의 손상이 거의 없는 것으로 확인되었음. 특히 A타입과 C타입 전분의 경우 결정성이 증가되는 현상을 보여 결정형 blocklets이 회수되었음을 확인할 수 있었음.

• 또한 회수된 blocklets의 내부는 아밀로펙틴의 짧은 사슬들, 즉 B1과 A사슬로 구성되어 있음을 확인하였음.

• 지금까지의 연구를 통해 전분 입자의 무정형한 영역을 선택적으로 산 가수분해하여 전분 입자 구조의 변화를 유도하였고, 성공적으로 결정형 blocklet을 분리할 수 있었음. 더불어 이번

실험을 통해 분리된 결정형 blocklet은 다양한 분야에서 나노 신소재로 활용될 수 있으리라 사료됨.

<Table 2> 다양한 전분의 blocklets 특성

찰옥수수 전분 옥수수 전분 고아밀로즈

옥수수 전분 감자 전분 녹두 전분

결정성 타입 A A B B C

아밀로즈 함량(%) 0-1 28 70 21 33

가수분해율(%) 높음 높음 낮음 높음 중간

형태 및 크기 40~80nm의 둥근 입자

결정성 유지 유지 약간 손상 약간 손상 유지

사슬길이 분포

trimodal trimodal bimodal bimodal bimodal

짧은 사슬(B1 and A)의 비율 증가

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