Anti-oxidation and Anti-inflammatory Effect of Asiasari Radix in RAW 264.7 Cells

細辛 酒錠 抽出物이 LPS로 유발된 RAW 264.7 Cell의 염증 및 항산화 반응에 미치는 영향

이옥진⋅오민석

대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Anti-oxidation and Anti-inflammatory Effect of Asiasari Radix in RAW 264.7 Cells

Yu-Chen Lee, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D.

Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University

RECEIVED June 19, 2014 REVISED July 21, 2014 ACCEPTED July 22, 2014

CORRESPONDING TO Min-Seok Oh, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University, 1136, Dunsan-dong, Seo-gu, Daejeon 302-869, Korea

TEL (042) 470-9424 FAX (042) 470-9005 E-mail [email protected]

Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives The purpose of this study was to investigate the Anti-oxidation and anti-in- flammatory effects of ethanol extract from asiasari radix (AR) on lipopolysaccharide (LPS)-induced in RAW 264.7 Cells

Methods Anti-oxidative effects of AR were measured by scavenging activities of 1,1-di- phenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and production of reactive oxygen species (ROS) in RAW 264.7 cells. Anti-in- flammatory effects of AR were measured by mediators including nitric oxide(NO), inter- leukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necosis factors-α (TNF-α) and iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression in RAW 264.7 cells.

Results Total phenolic content was expressed 28.77±1.67. DPPH radical Scavenging was increased depend on AR ethanol extract. ABAT radical Scavenging was increased de- pend on AR ethanol extract. Production of ROS was significantly decreased by AR ethanol extract on concentration of 100 (μg/ml). Production of NO was significantly decreased by AR ethanol extract on concentration of 100 (μg/ml). Production of IL-1β, interleukin-6 and TNF-α were increased depend on AR ethanol extract. And Production of inter- leukin-6, TNF-α were significantly decreased AR ethanol extract. iNOS, IL-1β, IL-6, TNF- α mRNA expression of RAW 264.7 cells was increased depend on AR ethanol extract.

Conclusions According to this study, AR ethanol extract has anti-oxidative and anti-in- flammatoy effects. (J Korean Med Rehab 2014;24(3):99-110)

Key words Asiasari radix (AR), Anti-oxidation, Anti-inflammatory, RAW 264.7 cell

서론»»»

염증반응이란 대식세포를 포함한 면역세포들이 항원의 침입이나 조직손상과 같은 자극에 의해 손상 부위로 이동 하여 항원을 제거하고, 손상의 결과로 생성된 물질을 제 거하는 것을 말한다^1,2). 대식세포는 감염초기에 생체방어

에 중요한 역할을 하는 세포로, NO, cytokine 등과 같은 염증매개물질을 생산하여 염증반응에 관여하게 되는데, 염증매개물질이 과량 생산되면 염증성 질환을 유발함으 로써 숙주에 치명적인 결과를 초래할 수 있다^3-6).

염증반응의 억제는 염증 질환을 치료하는데 있어 중요 한 목표가 되는데, 기존 항염제에 비해 한약물을 이용한

항염제의 경우 부작용이 적고 안전성이 높아, 현재 한약 물 제제를 통해 염증성 매개물질로 알려진 NO와 염증유 발 cytokine 등을 억제시킬 수 있는 물질을 찾기 위한 연 구가 활발히 진행되고 있다^7-11).

細辛 (

Asarum sieboldii Miq.

Asarum sieboldii

Asarum sieboldii var. seoulensis

20,21)

되고 있으나. 細辛을 酒錠 추출하여 RAW 264.7 cell 을 이용한 항염 항산화 연구는 접하지 못하였기에, 저자 는 Lipoplysaccharide (LPS)로 유도된 RAW 264.7 cell에 細辛 酒錠 抽出物을 처리하여 항염 및 항산화 반응 등을 관찰한 결과 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 세포

세포는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 RAW 264.7 세포를 구입하여 사용하였다.

2) 약재

細辛(Asiasari Radix 이하 AR로 표기)은 ㈜옴니허브(대 구, 한국)에서 구입하였고, 대전대학교 지역혁신센터 난 치성 면역질환의 동서생명의학 연구센터(Traditional and biomedical research center, TBRC)에서 정선 후 사용하 였다.

3) 시약

시약은 isopropanol (Sigma Co., U.S.A.), gelred (Sigma

Co., U.S.A.), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS: Welgene, Korea), ether (Sigma Co., U.S.A.), dulbecco's modified eagle's medium (DMEM: Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide (LPS: Sigma Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), nitric oxide detection kit (Intron Biotechnolo- gy, Korea), dimethyl sulfoxide (DMSO: Sigma Co., U.S.A.), 1,1–diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH: Sigma Co., U.S.A.), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), strepto- mycin (Hyclone Co., U.S.A.), agarose (FMC Co., U.S.A.), 2',7'-dichlorodihydrofluorescin diacettate (DCFH-DA: Sigma Co., U.S.A.), anti-biotic (Gibco BRL Co., U.S.A.), try- pan blue (Sigma Co., U.S.A.), ethanol (Merck Co., Germany), mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), total RNA RNA purification kit는 GeneAll사(서울, 한국), 酒錠은 ㈜주정판매월드(전 주, 한국), HNO3 (덕산, 한국), As, Pb, Hg, Cd standard solution (SCP Science, Canada), acetonitrile (덕산, 한 국)을 사용하였다.

4) 기기

기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimadzu Co., Japan), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), plate shaker (Lab-Line Co., U.S.A.), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), ICP (Shimadzu, Co., Japan), 수은분석기 (Teledyne Leeman Labs, U.S.A.), high performance liq- uid chromatography (HPLC: Shimadzu, Co., Japan), 유 세포 분석기(Flow cytometer, Becton Dickinson, Co., U.S.A.), Light Microscope (Carl Zeiss, Co., Germany) 등을 사용하였다.

2. 방법

1) 검액의 조제

細辛 30 g을 80% 酒錠 500 ml에 넣어 3시간 동안 환 류추출 후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건 조하여 23.9 g의 분말을 얻었다. 얻어진 분말은 냉동고에 서 보관하며 필요한 농도로 3차 증류수에 희석하여 사용 하였다.

2) 안전성 검사 (1) 중금속 검사

납, 비소, 카드뮴 분석의 경우 細辛 酒錠 抽出物 0.5 g 을 극초단파 시료전처리장치 전용용기에 넣고 질산 10 ml을 넣은 후, 용기를 후드 안에 정치시켜 발생 가스를 제거하고 극초단파 시료전처리장치를 사용하여 분해하였 다. 분해가 끝난 다음 분해액을 여과지로 여과하여 용량 플라스크에 넣고 물을 넣어 적절하게 표준액의 농도범위 로 희석하여 검액으로 하였다. 따로 질산 10 ml를 극초단 파 시료전처리장치 전용용기에 넣어 검액 조제와 같은 방 법으로 조작하여 공시험액으로 사용하였다. 준비된 검액, 표준액 및 공시험액을 가지고 유도결합플라즈마분광계 (inductively coupled plasma, ICP)를 이용하여 검량선을 작성 하고 공시험액으로 보정하여 검액을 측정하였다. 수 은 분석의 경우 細辛 酒錠 抽出物 50 mg을 정확하게 달 아 특별한 전처리 과정 없이 수은분석기를 이용하여 측정 하였다.

(2) 세포독성 측정

Raw 264.7 세포는 96 well plate에 2×10⁴ cells/well로 분 주하여 24시간 동안 배양 하였다. 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, 細辛을 각각 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 μl의 WST solution을 첨가하여 세포배양기(37^oC, 5%

CO2)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 nm에서 흡광 도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분 율로 표시 하였다.

(3) HPLC 분석

細辛 酒錠 抽出物 30 mg을 80% 酒錠 1 ml에 녹여 0.45 μm membrane filter로 여과 후 10 μl를 HPLC 시 료로 사용하였다. HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 system

controller (CBM-20A), pump (LC-20AD), column oven (CTO-20A), diode array detector (SPD-M20A)를 사용하 였으며, column은 ZORBAX Eclipse Plus C18 (250×4.6 mm, 5 μm)을 사용하였다. 이동상은 water(A)와 aceto- nitrile(B)로 gradient elution system을 적용시켜 0~5분 (0% B), 5~40분(30% B), 40~60분(80% B), 60~80분 (100% B)로 설정하였다. 유속은 1.0 ml/min이었으며 column 온도는 40^oC를 유지하였고, ultraviolet rays of wavelength (UV wavelength)는 210 nm로 설정하여 분 석하였다.

3) 항산화 효능 측정 (1) Total polyphenol 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약을 이용하는 방법으로 측정하였다. 추출 시료용액 1 ml에 50% Foiln- Ciocalteu's phenol reagent 0.5 ml를 가하여 실온에서 3 분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 ml와 7.5 ml 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취해 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 GAE (Gallic acid equi- valent)/g을 사용하였다.

(2) DPPH 소거능

Radical소거 활성 시험은 안정한 radical DPPH를 사용 하는 방법이다. 細辛 酒錠 抽出物은 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 (μg/ml)의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 μl와 細 辛 酒錠 抽出物을 각각 100 μl씩 혼합하여 37^oC에서 30 분간 반응 시켰다. 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 대조군은 시료액 대신 증류수를 넣었으며 DPPH 용액의 대신 酒錠을 넣어 보정값을 얻었다. DPPH radi- cal 소거율은 아래의 식에 따라 계산하였다.

소거율(%)=( 대조군의 흡광도-시료 첨가군의 흡광도 )×100 대조군의 흡광도

(3) ABTS 소거능

ABTS assay 방법²²⁾을 응용하여 측정하였다. 기존에 보 고된 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다.

細辛 酒錠 抽出物은 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 (μg/ml) 의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM potassium persulphate를 제조한 후, 암 소에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTSㆍ＋)을 형성시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이 하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTSㆍ＋ 용액 150 μl 와 AR 抽出物을 각각 5 μl 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화 능은 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 ABTS radical 소거능을 백분율로 나타내었다.

소거율(%)=(1- (시료 첨가군의 흡광도)

)× 100 대조군의 흡광도

(4) 세포내 ROS 생성

Raw 264.7 세포에서 reactive oxygen species (ROS)를 측 정하기 위하여 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) 를 이용하였다. 12 well plate에 Raw 264.7 세포를 1.5×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 細辛 酒錠 抽出物을 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 37

oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 1,200 rpm 에서 5분간 원심분리하여 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, DCF-DA 10 μM이 되도록 첨가하여 15분 동 안 암소, 상온에 두었다. 염색 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 한 다음 상청액을 제거하 고 다시 PBS 400 μl를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ U.S.A.) 를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.

4) 항염증 효능 측정 (1) NO

NO (Nitric oxide) 농도는 griess reagent system을 이 용하여 측정하였다. Raw 264.7 세포는 96 well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 후 새로 운 배양액으로 교체하였고, 細辛 酒錠 抽出物을 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml의 농도 로 처리하여 다시 24시간 동안 세포배양기(37^oC, 5%

CO2)에서 배양하였다. N1 buffer 50 μl를 각 well에 처 리하여 10분간 상온에서 반응한 후, N2 buffer 50 μl를 각 well에 처리하고 10분간 반응시켰다. 반응 후 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표 준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

(2) Cytokine

세포 내에서 염증성 사이토카인을 측정하기 위하여 lu- minex를 사용하였다. 12 well plate에 Raw 264.7 세포를 1.5×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고, 細辛 酒錠 抽出物을 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 세포배양기(37^oC, 5%

CO2)에서 배양하였다. 원심분리 후 상청액으로 inter- leukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necosis factors-α (TNF-α)를 측정하였다.

5) 유전자 발현

(1) Ribonucleic acid (RNA) 추출

셀에 RNAzolB 1,000 μl를 넣고 chloroform (CHCl3) 200 μl를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음 에 2분간 방치하였고, 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 400 μl의 상층액을 회수하여 isopropanol 400 μl와 동 량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다.

이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 1분간 vacuum pump에서 건조하여 RNA를 추 출하였다.

(2) 역전사 중합효소 연쇄반응

역전사(reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dNTPs mixture, RNase in- hibitor, stabilizer, oligo dT15 primer)를 사용하여 total RNA 1 μg이 되게 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리 된 증류수에 최종 부피가 20 μl가 되도록 하여 첨가하였 다. 이 20 μl의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에 서 5초간 원심 침강하여 45^oC heating block에서 60분 동 안 반응시켜 first-strand complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 이를 다시 95^oC에서 5분 동안 방치하여 M- MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 pol- ymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다.

(3) RT-PCR

RT-PCR은 DNA polymerase 1 U/tube에 250 mM

Table I. The Sequences of Primers in Used This Study

Primer F/R Sequences

iNOS F ATT GAT GGA GAG GGT CCA GC R ACC TGG AGG CAA GAG CTG AT IL-1β F GTG TCT TTC CCG TGG ACC TT

R TCG TTG CTT GGT TCT CCT TG IL-6 F CCT TCC TAC CCC AAT TTC CA

R CGC ACT AGG TTT GCC GAG TA TNF-α F AGC ACA GCC AGC ATG ATC CG R GTT TGC TAC GAC GTG GGC TA β-actin F GAG GTT CGA TGA TGC AGT GG

R CCC AGG ATA GGA CTC AGG GA

Table II. Content of Pb, As, Cd and Hg in 80% Ethanol Extract of AR

Pb As Cd Hg

Permissive density (mg/kg) 5 3 0.3 0.2

AR 0.03 0.09 N.D. N.D.

N.D.: not detected. AR: asiasari radix.

Fig. 1. Cell viability of AR extract in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cell was treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of AR ex- tract for 24 hr. Cell viability was measured using an MTT assay. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments.

AR: asiasari radix.

Fig. 2. HPLC chromatogram of 80% ethanol extract of AR.

Column; ZORBAX Eclipse Plus C18 (250×4.6 mm, 5μm), sample injection volume; 10μl, mobile phase; H

O(A)/ACN(B) gradient elution: 0~5 min (0% B), 5~40 min (30% B), 40~60 min (80% B), 60~80 min (100% B), flow rate; 1.0 ml/min, de- tector; PDA detector.

AR: asiasari radix.

dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 30 mM KCl, 1.5 mM MHCl2)를 포함한 mixture에 각 샘플과 primer를 넣고 PCR을 시행하였다. PCR 조건은 denatura- tion을 위해 94^oC에서 10초, annealing을 위해 iNOS는 57^oC에서 10초, IL-1β는 62^oC에서 10초, IL-6는 59^oC에 서 10초, TNF-α는 64^oC에서 10초, b-actin은 61^oC에서 10초 수행하였으며, extension을 위해 72^oC에서 30초로 35 cycles에 수행하였고, 사용된 primer는 아래와 같다 (Table I). 2% agarose gel에 전기영동하여, 유전자발현 여부를 측정하였다. UV로 촬영하여 각 그룹별로 band를 확인하였고, RNA 발현을 수치로 나타내었다.

3. 통계처리

실험 결과는 statistical package for the social sciences (SPSS) 11.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계 처리 하였으며 p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

결과»»»

1. 안전성 검사

1) 중금속 함량

細辛 酒錠 抽出物의 중금속 함량을 측정한 결과, 납과 비소의 경우 기준치 이하로 검출되었고 나머지 중금속의 경우 검출되지 않았다(Table II).

2) 세포독성

Raw 264.7 세포주에서 細辛의 세포 생존율을 측정 한 결 과, 대조군을 100.0±7.0%로 나타냈을 때 細辛 처리군은 각 각 1, 10, 100 (μg/ml) 농도에서 105.4±17.0%, 86.0±

8.3%, 94.2±11.2%의 세포 생존율을 나타내었다(Fig. 1).

Table III. Total Phenolic Contents of 80% Ethanol Extract of AR

Samples Total phenolics (mg GAE

/g ext.)

Asiasari radix 28.77±1.67

1)

Total phenolic contents was expressed as milligram of gal- lic acid equivalent (GAE) per gram of extract.

AR: asiasari radix.

Fig. 3. DPPH free radical scavenging activity of AR extract at various concentration. Extract was incubated with DPPH sol- ution at 37

C for 30 mins. Activities were determined by meas- urement of absorbance at 517 nm. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments.

DPPH: 1,1–diphenyl-2-picryl-hydrazyl. AR: asiasari radix.

Fig. 4. ABTS free radical scavenging activity of AR extract at various concentration. Extract was incubated with ABTS sol- ution at RT for 10 mins. Activities were determined by meas- urement of absorbance at 517 nm. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments.

ABTS: 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).

AR: asiasari radix.

Fig. 5. Effect of AR extract on ROS production in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cell was treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of AR extract and LPS (1 μg/ml) for 24 hr. The ROS pro- duction was analyzed by flow cytometry. The results were ex- pressed as mean±S.D. from three independent experiments.

Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*p＜0.05).

ROS: reacive oxygen species. LPS: lipopolysaccharide. AR: asia- sari radix. Norma: normal group. Con: LPS- induced group.

3) HPLC pattern 분석

細辛 酒錠 抽出物의 경우 210 nm에서 HPLC를 이용하 여 pattern 분석한 결과, 50.87분, 53.61분, 56.80분, 59.98 분대에 peak를 확인할 수 있었다(Fig. 2).

2. 항산화 효능에 미치는 영향

1) 총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량을 gallic acid를 표준물질로 하여 측 정한 결과, 폴리페놀 함량이 28.77±1.67 mg/g으로 나타 났다(Table III).

2) DPPH 소거능

DPPH 소거율은 1 μg/ml 농도에서 0.0±1.0%, 10 μg/

ml 농도에서 1.2±1.6%, 100 μg/ml 농도에서 15.1±

2.3%, 1,000 μg/ml 농도에서 55.2±3.9%로 나타나 농도 의존적으로 증가 하였다(Fig. 3).

3) ABTS 소거능

ABTS 소거율은 1 μg/ml 농도에서 0.3±0.7%, 10 μg/

ml 농도에서 1.6±0.8%, 100 μg/ml 농도에서 9.3±

0.6%, 1,000 μg/ml 농도에서 85.6±1.2%로 나타나 농도 의존적으로 증가 하였다(Fig. 4).

4) ROS의 생성

ROS 생성 저해 활성은 대조군을 100.0±1.0%로 나타

Fig. 6. Effect of AR extract on LPS-induced nitric oxide (NO) production in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cell was treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of AR extract and LPS (1 μg/ml) for 24 hr. The amount of nitric oxide in supernatant was measured using Griess reagent. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***p＜0.001).

NO: nitric oxide.

Fig. 7. Effect of AR extract on LPS-induced IL-1β production in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of AR extract in the presence of LPS (1 μg/

ml) for 24 hr. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*p＜0.05). interleukin-1β (IL-1β).

Fig. 8. Effect of AR extract on LPS-induced IL-6 production in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of AR extract in the presence of LPS (1 μg/ml) for 24 hr. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***p＜0.001).

IL-6: interleukin-6.

냈을 때 정상군은 74.6±3.8%, 細辛 투여군은 1 μg/ml 농도에서 100.6±3.6%, 10 μg/ml 농도에서 90.3±8.7%, 100 μg/ml 농도에서 83.3±8.2%로 나타나며 특히 100 μg/

ml 농도에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 5).

3. 항염증 효능에 미치는 영향

1) NO의 생성

NO 생성량은 대조군을 100.0±9.8%로 나타냈을 때 정 상군은 42.9±10.4%, 細辛 투여군은 1 μg/ml 농도에서 92.2±5.9%, 10 μg/ml 농도에서 88.8±9.4%, 100 μg/

ml 농도에서 51.2±3.8%로 나타나며 특히 100 μg/ml 농 도에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 6).

2) Cytokine에 미치는 영향 (1) IL-1β의 생성

IL-1β 생성량은 대조군이 17.9±1.0 pg/ml, 정상군이 4.1±1.5 pg/ml, 細辛 투여군은 1 μg/ml 농도에서 17.0±1.3 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 10.3±2.9 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 5.8±4.1 pg/ml로 모든 농도에서 농도의존적으로 감소하였으며, 특히 10 μg/ml 농도에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 7).

(2) IL-6의 생성

IL-6 생성량은 대조군이 4589.2±135.9 pg/ml, 정상군

이 10.0±3.0 pg/ml, 細辛 투여군은 1 μg/ml 농도에서 2049.8±261.7 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 1673.3±

288.6 pg/ml, 100μg/ml 농도에서 899.8±215.3 pg/ml으 로 모든 농도에서 농도 의존적으로 감소하였고, 모든 농 도에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 8).

(3) TNF-α의 생성

TNF-α 생성량은 대조군이 21954.1±4123.3 pg/ml, 정상군이 191.3±92.1 pg/ml, 細辛 투여군은 1 μg/ml

Fig. 9. Effect of AR extract on LPS-induced TNF-α production in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with 1, 10 and 100 (μg/ml) of AR extract in the presence of LPS (1 μg/

ml) for 24 hr. The results were expressed as mean±S.D. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p＜0.05, **p＜0.01).

TNF-α: tumor necosis factors-α.

Fig. 10. Effects of AR on lipopolysaccharide(LPS)-induced mRNA production in RAW 264.7 cells. Cells treated with 1, 10 or 100 (μg/ml) of AR in the presence of 1 (μg/ml) LPS or with LPS alone for 24 hrs. Total RNA was isolated and the mRNA expression levels of iNOS, IL-1β, IL-6 and TNF-α were detected by RT-PCR. Bar graph showed band intensity of PCR products.

농도에서 11446.4±2808.7 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 9340.3±3092.4 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 5343.4±

2261.3 pg/ml으로 모든 농도에서 농도 의존적으로 감소 하였고, 모든 농도에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 9).

4. 유전자 발현에 미치는 영향

mRNA 발현에 미치는 영향을 보기위해 1, 10, 100 μg/

ml 농도로 처리한 후, LPS 처리된 대조군의 mRNA 발현 량을 100%로 보았다. iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α는 농도

의존적으로 억제되었고, β-actin으로 정규화를 한 결과, iNOS의 경우, 1, 10, 100 μg/ml의 농도에서 17.4%, 23.6%, 66.1%, IL-1β의 경우, 1, 10, 100 μg/ml의 농도 에서 61.0%, 72.9%, 74.0%, IL-6의 경우, 1, 10, 100 μg/

ml의 농도에서 7.4%, 10.9%, 56.1%, TNF-α의 경우, 1, 10, 100 μg/ml의 농도에서 22.3%, 30.2%, 56.4%가 감 소하였다(Fig. 10).

고찰»»»

염증반응은 어떤 자극에 대한 생체 조직의 비특이적 면역반응으로써 조직의 변성, 순환장애와 삼출, 조직 증 식 세 가지를 유발하는 복잡한 병변이다^23,24). 대식세포는 초기 염증반응에 관여하는 대표적인 면역세포로서 동물 체내 모근 조직에 존재하며 외부 이물질을 탐지하고 포식 하여 죽은 세포를 제거하는 포식작용과 더불어 외부자극 을 통해 염증사이토카인, ROS, NO, PGE2 등의 다양한 염 증물질 분비를 통해 초기 염증반응을 유도하게 된다^25-28). 염증매개물질이 과량 생산되면 기관지염, 관절염 등의 염 증성 질환을 유발함으로써 질환을 악화시키는 데 기여하 게 된다. 따라서 각종 염증질환을 효과적으로 감소시킬 수 있는 항염증제제 및 치료보조제 개발에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며, 최근 한약재로부터 유래되는 생 리활성물질이나 단일화합물이 치료제 개발의 표적물질로 주목받고 있다²⁹⁾.

최근에 골관절염의 진행에 중요한 역학을 하는 tumor

necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 등 의 cytokine을 억제하는 면역학적 관점의 약물에 대한가 진행되고 있다^30-32). 또한 체내에서 생성되는 산화 스트레 스는 염증반응을 유발하는 원인 중 하나가 되므로, 다량 의 항산화성분을 섭취하여 산화 스트레스를 억제함으로 써 염증반응의 유발을 감소시켜 만성 질환을 예방, 치료 하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다³³⁾.

細辛은 족두리풀(Asarum sieboldii)이나 민족두리풀 (

Asarum sieboldii var.seoulensis

細辛에 대한 연구로는 LPS로 활성화된 복강 대식세포 에서 細辛 抽出物의 항염증 효과에 대한 연구¹⁹⁾, 細辛 정 유 추출물의 피부진균 및 기회감염진균에 대한 항진균 효 과의 연구¹²⁾, 빈용 한약재의 진통 및 소염활성에 대한 연 구³⁴⁾ 등이 있으나, 염증기전에 관계된 cytokine과 항산화 에 대한 연구는 미비한 것으로 사료되었기에 RAW 264.7 cell을 이용하여 細辛의 항염및 항산화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

본 연구에서는 細辛의 RAW 264.7 cell에서 세포독성, 항산화 효과 및 NO 생성, 염증성 지표로서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 염증 cytokine, 유전자 발현에 미치는 영향에 대해 분석하였다.

먼저 약재의 안정성 검증을 위해 중금속 함량, 세포독 성 검사, HPLC pattern 분석을 실시하였다.

細辛 酒錠 抽出物의 중금속 함량을 측정한 결과, 납과 비소의 경우 기준치 이하로 검출되었고 나머지 중금속의 경우 검출되지 않았으며(Table II), 세포 생존율은 대조군 을 100.0±7.0%로 나타냈을 때 細辛 酒錠 抽出物은 각각 1, 10, 100 (μg/ml) 농도에서 105.4±17.0%, 86.0±8.3%, 94.2±11.2%의 세포 생존율을 나타내어(Fig. 1) 비교적 안전한 약물임을 알 수 있었다.

細辛 酒錠 抽出物을 210 nm에서 HPLC를 이용하여 pattern 분석한 결과, 50.87분, 53.61분, 56.80분, 59.98 분대에 peak를 나타내었다(Fig. 2).

Free radical은 정상적인 신체 대사과정 중에 생성된 한 개 이상의 비공유전자를 가진 불안정한 상태의 이온으 로 DNA 손상을 일으키고 단백질의 과산화물을 생성하며 지질과산화를 유발하는 등 여러 염증반응과 연관되어 노

화 및 조직손상과 밀접한 관련이 있다³⁵⁾.

폴리페놀은 식물에 함유되어 있으며, 대사 과정 중에 발생하는 유해한 과산화물질을 제거하는 작용(free radi- cal scavenging)이나 항산화 작용을 나타낸다. 또 폴리페 놀 화합물은 만성 질환의 원인의 하나로 생각되어지고 있 는 oxidative stress나 다른 여러 가지 생리적 요인을 제거 하여 결과적으로는 세포나 조직을 보호하고, 파괴를 방지 하는 역할을 한다³⁶⁾.

DPPH는 짙은 자주색을 나타내는 질소중심의 radical로 항산화 활성을 가진 시료와 반응하게 되면 노란색으로 탈 색되어 감소하는데 이의 감소정도를 측정하여 DPPH radical 소거활성을 분석하였다³⁷⁾.

ABTS 소거능은 ABTS radical이 항산화 물질과 반응하 여 ABTS radical 특유의 청록색이 탈색되어 감소하는 정 도를 측정하는 방법이다³⁷⁾.

ROS는 모든 생명체에서 일반적인 세포사 과정 및 여러 요인에 의해 지속적으로 활성화 되는데³⁸⁾, ROS가 일정 농도 이상이 지속 되면³⁹⁾ 영양분 파괴로 인한 불균형이 초래되며, 이에 따라 더욱 산화적 스트레스가 증가하고 ROS에 의한 유리기 생성이 촉진되어 생체막 지질을 파괴 하게 되다⁴⁰⁾.

본 연구에서 항산화 활성에 미치는 영향을 알아보고자 총 폴리페놀, DPPH 소거능, ABTS 소거능, ROS의 생성에 대해 측정한 결과 細辛 酒錠 抽出物에 존재하는 총 폴리 페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 28.77±1.67 mg/g으로 나타났다(Table III). 細辛 酒錠 추출물의 농도 가 상승함에 따라 DPPH 소거 효율과 ABTS 소거 효율이 증가하였다(Fig. 3, 4). ROS는 細辛 100 μg/ml 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 5). 이를 통해 細辛 의 항산화활성이 유효함을 알 수 있다.

NO는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로써 NO syn- thase (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성된다^29,41). NO는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데 특히 대식세포를 LPS로 자극하면 inducible NOS (iNOS)가 발현되어 NO을 생성하게 된다. 이렇게 생 성된 NO는 염증반응을 매개하는 역할을 하게 된다^41-44). IL-1β는 대식세포의 탐식작용을 도와주는 등 각종 면 역반응을 조절하는 것으로 알려져 있는 중요한 염증매개 인자로, 대식세포, 호중구, 상피세포, 내피세포에 의해 생 산되고, LPS와 같은 박테리아 산물이나 TNF-α와 같은

다른 cytokine에 의해서 유도되며, 과잉 또는 장기적인 생성이 일어나게 되면 생체 침습 작용으로 발열, 염증, 조 직파괴, 쇼크 등을 일으킬 수 있다^45-47).

IL-6는 대식세포와 T cell에 의해 생산되며, TNF-α와 IL-1과 함께 급성기 단백반응의 유도체로서 anti-inflam- matory와 pro-inflammatory cytokine으로 알려져 있다⁴⁸⁾.

TNF-α는 대식세포와 비만세포 등에서 분비되며, 많은 자가면역질환에서 염증의 개시 및 유지에 핵심적 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 종양 세포에서는 세포 독작용 을 염증세포에서는 IL-1과 유사한 염증 유발 작용을 하여 세포의 증식과 분화를 조절한다^49-51).

본 연구에서 RAW 264.7 세포에서의 細辛의 항염증 효 과에 대한 NO 생성량과 염증 사이토카인에 미치는 영향 을 알아보고자 NO, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량을 측 정하여다. NO 항목에서는 細辛 투여군 100 μg/ml 농도 에서 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 6).

IL-1β, IL-6, TNF-α 항목은 모든 농도에서 농도의존 적으로 감소 하였으며, IL-1β는 특히 10 μg/ml 농도에 서 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 7). IL-6은 모든 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 8). TNF- α는 모든 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig.

9). 이러한 결과는 細辛이 IL-1β, IL-6, TNF-α, NO의 생 성을 억제시켜 염증질환을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것으로 사료된다.

iNOS는 염증 반응시 대량으로 생성 되는 것으로 LPS, interferon-γ (TFN-γ), IL-1 및 TNF-α 등의 자극에 의 해 대식세포, 혈관평활근 세포, 내피세포, 간세포 및 심근 세포 등에서 장시간 다량의 NO를 생성하는 것으로 알려 져 있다^52-55). iNOS의 지속적인 발현에 의해 NO가 과도하 게 생산되면 패혈증이나 관절염 등 여러 가지 염증성 질 환 또는 자가면역질환을 일으키며, 그 발병과 증상을 악 화시키는데 깊게 관여하고 있다. 또한 류마티스 관절염이 나 변형성 관절염 환자의 활막세포 또는 연골세포에서 iNOS mRNA나 단백질의 발현이 보고되고 있으며, 활막액 중에 NO의 농도가 상승하여 염증을 악화시키는 것으로 알려져 있다⁵⁶⁾.

항염증성 기전과 관련된 iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α의 유전자 발현에 미치는 영향을 RAW 264.7 cell에서 iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA 발현을 RT-PCR로 분석하였 다. 그 결과 LPS에 細辛 酒錠 抽出物을 처리한 경우 유전

자 발현양이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 10).

이는 LPS에 의해 유도된 iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α가 細辛 酒錠 抽出物에 의해 유전자 발현이 억제됨으로써 항 염증 효과가 있다고 생각된다.

본 논문에서는 細辛 酒錠 추출물이 세포독성을 나타내 지 않으면서 DPPH와 ABTS 소거능의 증가와 ROS 생성 량의 감소를 통해 항산화 효과가 있음을 알 수 있었고, NO 및 염증 사이토카인의 생성량의 감소, 유전적 검사를 통해 항염증 효과를 확인하였다.

細辛을 酒錠으로 추출하여 실험을 하였는데 酒錠 抽出 이 가수분해 추출보다 수득율이 우수하다고 보고^20,21)되고 있으며, 총 폴리페놀, ABTS radical 소거능, 세포내 ROS 생성 측정 HPLC 분석를 통하여 細辛에 대한 정밀한 검사 를 유도하였다.

細辛의 주정 추출물이 LPS로 유발된 각종 염증매개물 질등의 생성 증가를 유의하게 억제시키는 것으로 나타나, 細辛이 염증매개물질의 과다배출로 인하여 발생하는 관 절염 등의 질환의 치료에 영향을 미칠 수 있는 것으로 볼 수 있으며, 향후 이러한 항염 및 항산화 작용에 의하여 관절염의 치료뿐만 아니라 예방 등을 응용될 수 있을 것 으로 사료된다. 골관절염 치료에 대한 기초 연구의 일환 으로, LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에 細辛 酒錠 抽出物 을 처리하여 항염 및 항산화 반응 등을 관찰한 결과 유의 한 성적을 얻었기에 향후 지속적인 연구로 임상적인 활용 이 기대된다.

결론»»»

LPS로 유발된 RAW 264.7 cell을 이용한 細辛 酒錠 抽 出物의 항산화 활성, 항염증 효능, 유전자 발현을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 항산화 효과

1) 총 폴리페놀은 28.77±1.67 mg/g으로 나타났다 2) DPPH 소거능은 농도 의존적으로 증가하였다.

3) ABTS 소거능은 농도 의존적으로 증가하였다.

4) ROS의 생성량은 100 (μg/ml) 농도에서 유의성 있 게 감소하였다.

2. 항염증 효과

1) NO의 생성량은 100 (μg/ml) 농도에서 유의성 있 게 감소하였다.

2) TNF-α, IL-1β, IL-6는 농도 의존적으로 감소하였 으며, 1L-6, TNF-α는 유의성 있게 감소하였다.

3) iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α는 농도 의존적으로 감 소하였다.

이상과 같이 細辛 酒錠 抽出物은 항산화 및 항염증 효 과가 있는바, 향후 관절염 치료제로의 연구가 필요할 것 으로 생각된다.

참고문헌»»»

1. 대한병리학회. 병리학 I. 제 7판. 서울: 고문사. 2010:68-121.

2. Lundberg IE. The role of cytokines. chemokines and ad- hension molecules in the pathogenesis of idiopathic in- flammatory myopathies. Current Rheumatology Report.

2000;2:216-24.

3. Lee YS, et al. IL-6 mRNA expression in mouse peri- toneal macrophages an NIH3T3 fibroblasts in response to candida albicans. J Microbiol Biotechnol. 2000;10:8- 15.

4. Higuchi M, et al. Cytolytic mechanism of activated mac- rophages. Tumor necrosis factor and L-arginine-depend- ent mechanism acts as synergistically as the major cyto- lytic mechanism of activated macrophages. J Immunol.

1990;144:1425-31.

5. McDaniel ML. et al. Cytokines and nitric oxides in islet inflammation and diabtes. Proc Soc Exp Biol Med. 1996;

211:24-32.

6. Rocca B, FitzGerald GA. Cyclooxygenases and prosta- glandins : shaping up the immune response. Int Immu- nopharmacol. 2002;2(5):603-30.

7. 김민선 등. LPS로 유도한 대식세포의 염증반응에서 우슬의 항염증 효과. 대한본초학회지. 2011;26(2):51-7.

8. 김시나 등. 차조기추출물에 의한 염증성 cytokine 생성억 제 및 진통작용에 관한연구. 동의생리병리학회지. 2006;

20(2):414-9.

9. 박성주. 김수곤, 사간 물 추출물의 항염증 효과. 동의생리 병리학회지. 2010;24(3):410-5.

10. 조일주 등. 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 蜈 蚣의 항염증 효과. 대한본초학회지. 2011;26(3):23-9.

11. 류한우, 김윤상 임은미. 모과(木瓜) 물추출물의 항염증 효 능에 관한 실험적 연구. 대한한방부인과학회지. 2012;

25(3):1-15.

12. 한갑훈. 細辛 정유 추출물의 피부진균 및 기회감염진균에 대한 항진균 효과. The Korean Journal of Mycology.

2007;1:58-60.

13. 辛民敎, 編著. 原色 臨床本草學. 서울:永林出版社. 1988:

512.

14. 安德均 著. 原色 韓國本草圖鑑. 서울:敎學社. 1994:440.

15. 新文豊出版公司 編輯. 新編 中藥大辭典, 臺北: 新文豊出版 公司. 1982:1811-5.

16. 李時珍 著. 本草綱目. 北京: 人民衛生出版社. 1977:816-9.

17. 이정원. 細辛이 microglial 세포의 nitric oxide 생성에 관여 하는 유전자 발현 분석 연구. 경희대학교 대학원. 한방생 리학. 2008. 2.

18. 지은석. 細辛이 LPS로 유도된 BV2 Microglia cell에서의 ni- tric oxide 생성에 미치는 영향. 경희대학교 대학원.한방생 리학. 2007. 2.

19. 정원석, 유현미, 서상완, 조준기, 손지우, 박민철, 최창민, 염승룡, 황상욱,김영우, 송달수, 채영석, 김영목, 박성주, 신 민교, 송호준. LPS로 활성화된 복강 대식세포에서 細辛 추 출물의 항염증 효과, 大韓本草學會誌, 2006;21:189-95.

20. Nan Huang, Cathy Hauck, Man-Yu Yum, Ludmila Rizshsky, Mark P, Rosmarinic Acid in Prunella vulgaris Ethanol Extract Inhibits LPS-induced Prostaglandin E2 and Nitric Oxide in RAW264.7 Mouse Macrophages, Health of national institutes. 2009;57(22):10579-89.

21. Mei-Fen Shih, Yih-Dih Cheng, Chia-Rui Shen, Jong-Yuh Cherng, A molecular pharmacology study into the an- ti-inflammatory actions of Euphorbia hirta L. on the LPS- induced RAW 264.7 cells through selective iNOS protein inhibition, J Nat Med. 2010;64:330-5.

22. Re R, Pellegrini N, Proteffente A, Pannala A, Yang M, and RiceEvans C. Antioxidant activity applying an im- proved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med. 1999;26:1231-7.

23. Morson BC. Pathology of inflammatory bowel disease.

Gastroenterol Jpn. 1980;15:14-7.

24. Cline MJ. Leukocyte funcion in inflammation: the in- gestion, killing, and digestion of microorganisms. Ser Haematol. 1970;3:3-16.

25. Boscá L, Zeini M, Través PG, Hortelano S. Nitric oxide and cell viability in inflammatory cells: a role for NO in macrophage function and fate. Toxicology. 2005;208:

249-58.

26. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mam- malian cells. FASEB J. 1992;6:3051-64.

27. Turini ME, DuBois RN. Cycloxygenase-2: a therapeutic target. Annu Rew Med. 2002;53:35-57.

28. Wei W, Li XY, Zhang HQ, Wu SG. Anti-inflammatory and immuno pharma cology. 1st ed. Beijing: Renmin- weishengchubanshe. 2004:10-7.

29. 민지영, 박용기. 續斷이 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증반응에 대한 효과. 대한본초학회지. 2009;

24(4):189-95.

30. Auw Yang KG, Saris DBF, Dhert WJA, Verbout AJ.

Ostoarthritis of the knee: current treatment options and future directions. Current Orthopaedics. 2004;18:311-20.

31. Laufer S, Greim C, Bertsche T. An in-vitro screening as- say for the detection of inhibitors of proinflammatory cy- tokine synthesis: a useful tool for the development of new antiarthritic and disease modifying drugs. Osteoar- thritis and cartilage. 2002;10:960-7.

32. Maier JA, Brugel TA, Clark MP, Sabat M, Golebiowski A.

Bokkland RG, Laufersweiler MJ, Laughlin 나, VanRens JC, De B, Hsieh LC, Brown KK, Juergens K. Walter RL, Janusz MJ. Development of N-2,4-pyrimidine-N-phenyl- N'-alkylureas as orally active inhibitors of tumor necrosis factor alpha(TNF-a)synthesis. Part 2. Bioorganic& Medici- nal chemistry Letters. 2006;16:3514-8.

33. 이정은. RAW264.7을 이용한 복분자의 항염증 효과 규명.

중앙대학교 대학원. 2012.2.

34. 박종은, 최혁재, 정석희, 김남재, 김동현. 빈용 한양재의 진 통 소염활성. 생약학회지. 2001;34(4):257-68.

35. Fu S, Gebicki S, Jessep W, Gebicki JM, Dean RT.

Biological fate of amino acid, peptide and protein hydro- peroxides, Biochem J, 1995;31(3):821-7.

36. 정중근. 한국산 고구마의 폴리페놀 함량과 항산화활성에 관한 연구. 염덕대학교 대학원. 2008.12.

37. 이제학. 싸리나무(Lespeedeza bicolor) 부위별 추출물의 항 산화 활성에 관한 연구. 강원대학교 대학원. 동물식품응용 과학과. 2013:4,19,22.

38. Beckman KB, Ames BN. The free radical theroy of aging matures. Phusiol. Rev. 1998;78:547-81.

39. Kim YH, Paek, JY, Kwon HJ, Lee JW. Antioxidant and antibaceterical activities of ethyl acetate extract from Scutellaria baicalensis, Korean J. Food Nutr. 2009;22(3):

367-76.

40. 이희경. 퇴생성 슬관절염의 운동치료 효과에 대한 생체 역 학적 분석. 조선대학교 대학원. 2007.

41. Kawamata H, Ochiai H, Mantani N, Terasawa K, Enhan- ced expression of inducible nitric oxide synthase by Juzen-taiho-to in LPS-activated RAW 264.7cell, a murine macrophage cell line. Am J Chin Med. 2000;28:217-26.

42. Livshits, G., Guangju Zhai, G., Hart, D, J., Kato, B. S., Wang, H., Williams, F. M. K., & Spector. T. D.

Interleukin-6 is a significant predictor of radiographic knee osteoarthritis Arthritis Rheum. 2009;60(7):2037-45.

43. Seo WG, Pae HO, Oh GS, Chai KY, Kwon TO, Yun YG, Kim NY, Chung HT, Inhibitory effects of methanol ex- tract of Cyperus rotundus rhizomes on nitric oxide and superoxide productions by murine macrophage cell line.

RAW 264.7 cells. J Ethnopharmacol. 2001;76(1):59-64, 119-23.

44. Chiou WF, Chou CJ, Chen CF. Camptothecin suppresses

nitric oxide biosynthesis in RAW 264.7 macrophages.

Life science. 2001;69:625-35.

45. Kishimoto T, Akira S, Taga T, Interleukin-6 and its re- ceptor a paradigm for cytokines. Science. 1992;258(5082):

593-7.

46. 강재성 등. 세포분자면역학. 제 4판. 서울: 범문사. 2002:

4-5, 240-53, 276-9.

47. 김윤희. 사이토카인의 종류와 기능에 관한 연구. 전주기전 여자대학논문집. 2000;20:271-85.

48. Pierce BT, et al. The effect of fetal acidemia on fe- tal-placental vascular tone and production of inflam- matory cytokines interleukin-6 and tumor necrosis factor- α. AJOG. 2002;187(4):894-7.

49. Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T, Kashiwamura S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu A, et al. Complmentary DNA for a novel hu- man interleukin(BSF-2)that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature. 16;324(6092):7376.

50. Lee AK, et al. Inhibition of lipopolysaccharide inducible nitric oxide synthase. TNF-α and COX-2 expression by sauchinone effects on I-ĸBa phosphorylation. C/EBP and AP-1 activation. British Journal of Pharmaology.

2003;139:11-20.

51. Dalgado AV. McManus AT, Chambers JP. Production of tumor necrosis factor-alpha, interleukin 1-beta, inter- leukin 2, and interleukin 6 by rat leukocyte subpopu- lations after exposure to substance P. Neuropeptides.

2003;37(6):355-61.

52. Lee, Z, H, & Kim, H, H. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Bio- chem Biophys Res Commun. 2003;305:211-4.

53. Suda, T., Takahachi, N., Udagawa, N., Jimi, E., Gillespie, M.T., & Martion, T. J. Modulation of osteo- clast differentiation and function bv the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand familes.

Endocr Rev. 1999;20(3):345-57.

54. Lee BG, Kim SH, Zee OP, Lee KR, Lee HY, Han JW, Lee HW. Suppression of inducible nitric oxide synthse expression in RAW 264.7 macrophage by two beta-car- boline alkaloids extracted from Meliazadarach. Eur J Pharmacol. 2000;406(3):301-9.

55. 안영민, 안세영, 두호경. 미세변화 신증후군에서 溫脾湯과 當歸芍藥散이 면역조절작용에 미치는 영향. 대한한의학회 지. 2000;21(1):20-8.

56. Santangelo KS, Bertone AL, Effective reduction of the in- terleukin-1β transcript in osteoarthritis-prone guinea pig chondrocytes via short hairpin RNA mediated RNA inter- ference influences gene expression of mediators im- plicated in diseaase pathogensis. Osteoarthritis Cartilage.

2001;19(12):1449-57.