다양한 실험동물에서의 마이봄샘 촬영 및 면역조직화학적 구조 관찰

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ISSN 0378-6471 (Print)⋅ISSN 2092-9374 (Online)

https://doi.org/10.3341/jkos.2018.59.1.9

Original Article

다양한 실험동물에서의 마이봄샘 촬영 및 면역조직화학적 구조 관찰

Meibography and Immunohistochemistric Structures in Animal Models

이현규¹⋅우인호¹⋅강보람¹⋅엄영섭¹⋅강수연¹⋅황호식²⋅김효명¹⋅송종석¹

Hyun Kyu Lee, MD¹, In Ho Woo, MD¹, Boram Kang, MS¹, Young Sub Eom, MD, PhD¹,

Su-Yeon Kang, MD, PhD¹, Ho Sik Hwang, MD, PhD², Hyo Myung Kim, MD, PhD¹, Jong Suk Song, MD, PhD¹

고려대학교 의과대학 안과학교실¹, 한림대학교 의과대학 춘천성심병원 안과학교실² Department of Ophthalmology, Korea University College of Medicine¹, Seoul, Korea

Department of Ophthalmology, Chuncheon Sacred Heart Hospital, Hallym University College of Medicine², Chuncheon, Korea

Purpose: We evaluated differences in the meibographic findings and immunohistochemical structures of mice, rats, and rabbits (commonly used in animal experiments).

Methods: Meibomian gland images were taken using an animal meibograph in mice, rats, and black and white rabbits (five of each animal).The size ratios of the upper and lower Meibomian glands were calculated. Afterm meibographic imaging, the eyes were cut sagittally or transversely and the histological structures were compared using hematoxylin-and-eosin (H&E) and immunohistochemical staining. In addition, the diameters of the central ducts and the areas of ducted glands and the acini were compared using image analysis software.

Results: The meibographic findings were clearer in black rabbits than in the other animals. The upper to lower length ratio of the gland did not differ significantly among the three species. Histologically, no central duct epithelial cells were apparent in mice.

The diameters of the central ducts and the areas of ducted glands and acini increased in the following order: mouse, rat, and rabbit. However, the Meibomian gland areas did not differ significantly between mice and rats. On immunohistochemical staining, the central ductal epithelium and the Meibomian gland acini were stained for cytokeratin 5 (CK 5) but only the central ductal epithelium was stained for cytokeratin 6 (CK 6).

Conclusions: The larger the experimental animal, the greater the sizes of the Meibomian gland ducts and acini. In addition, black rabbits yielded better gland images because contrast was enhanced. Compared with sagittal sections of Meibomian glands, transverse sections facilitated a better understanding of the structures of the central ducts and surrounding Meibomian gland acini.

J Korean Ophthalmol Soc 2018;59(1):9-16

Keywords: Animal, Meibography, Meibomian gland, Immunohistochemistry

￭Received: 2017. 9. 14. ￭ Revised: 2017. 10. 30.

￭Accepted: 2017. 12. 19.

￭Address reprint requests to Jong Suk Song, MD, PhD

Department of Ophthalmology, Korea University Guro Hospital,

#148 Gurodong-ro, Guro-gu, Seoul 08308, Korea Tel: 82-2-2626-1277, Fax: 82-2-857-8580 E-mail: [email protected]

*Conflicts of Interest: The authors have no conflicts to disclose.

ⓒ2018 The Korean Ophthalmological Society

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마이봄샘은 지질을 분비하며, 눈물막의 표면의 안정성 에 기여하는 역할을 한다.¹ 또한 마이봄샘기능부전, 안구 건조증, 안검염 등의 질환은 눈물막의 안정성이 파괴되어 시력저하를 유발하며 삶의 질을 떨어트리는 주요 질환이 다.¹ 마이봄샘기능부전을 중심으로 병인 및 치료효과를 파 악하기 위하여 다양한 동물실험이 진행되고 있다.¹ 대표적 으로 생쥐, 쥐, 토끼가 있으며, 인간과의 비교 및 적용을 위해 다양한 동물모델이 제시되어 왔다.^2-8

마이봄샘기능부전의 경우 마이봄샘의 각질화가 중요하 며 이는 여러 동물실험을 통해 밝혀졌는데,⁹ 이에 더해서

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Table 1. Animal models (mouse, rat, rabbit)

Mouse Rat Rabbit

White C57BL/6 Dutch belted pigmented rabbits

Black BALB/c Sprague-Dawley New Zealand

A B

Figure 1. Meibography for animals. (A) Meibography for animals. (B) The animals were anesthetized by intramuscular injection,

and meibography of animals was performed.

면역조직화학염색을 통해 좀 더 다양한 연구가 진행되고 있다.1,5,6,10-14

하지만 아직 동물이 살아있는 상태에서 동물 의 마이봄샘을 확인할 수 있는 시스템이 없었다. 따라서 본 연구를 통해 동물실험으로 대표적으로 사용되고 있는 생쥐, 쥐, 토끼의 마이봄샘 촬영 소견 및 면역조직화학적 구조를 비교하여 동물별 결과의 차이를 파악하였고, 또한 마이봄샘을 촬영하기에 가장 적합한 동물모델이 무엇인 지 알아보았다.

대상과 방법

생쥐, 토끼는 검은색 및 흰색으로 구분을 하였으며, 각 동물마다 다섯 마리씩 연구를 하였다. 쥐의 경우 흰색 동 물만을 이용하였다(Table 1). 동물들의 마이봄샘을 촬영하 기 위하여 특수제작된 동물실험용 마이봄샘촬영장비를 이용하였다(Meiboviewer for animal experiments; Visual Optics, Chuncheon, Korea) (Fig. 1). 동물들의 마취를 위하 여, tiletamine/zolazepam (Zoletin^®, 30 mg/kg, Virbac Lab., Carros, France) 및 xylazine (Rompun^® 10 mg/kg, Bayer, Berkley, MI, USA)을 근육주사하여 마취시킨 다음, 눈에 대한 특별한 전처치 없이 살아있는 상태에서 눈꺼풀의 마 이봄샘을 촬영하였다(Fig. 1). 촬영 후 사람의 마이봄샘과 가장 유사한 동물모델이 무엇인지 알아보기 위하여 이미

지분석소프트웨어를 이용하여 윗눈꺼풀의 마이봄샘길이 와 아랫눈꺼풀의 마이봄샘길이의 비율을 측정하였다.

눈꺼풀의 마이봄샘촬영을 시행한 후 눈꺼풀조직을 잘 라 적출하여 눈꺼풀 정중앙부위를 시상면, 가로면 두 가지 방법으로 단면을 잘라서 단면에 따른 조직학적 결과의 차 이를 확인하였다. 이에 추가적으로 가로면으로 자른 200 배율의 사진을 통해 중심관의 장축길이와 중심관 및 주변 세엽세포를 포함한 면적을 이미지분석소프트웨어를 이용 하여 측정하여 평균을 측정하였다. 또한 Hematoxylin and Eosin (H&E) stain과 CK 5 (Cytokeratin 5, ab53121 1:100 dilution; Abcam, Cambridge, MA, USA), CK 6 (Cytokera- tin 6, GTX105355 1:100 dilution, GeneTex, San Antonio, TX, USA)에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 보통 CK 5의 경우 중심관의 상피세포와 주변 세엽세포를 염색 하며, CK 6의 경우 중심관의 상피세포를 염색하는 것이 차이인데, 이를 이용하여 CK 5, 6 사이의 결과의 차이 및 동물 간의 결과 차이를 확인하였다. 통계학적 분석은 SPSS 18 for Windows (IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용 하였다. 세 군의 결과를 분산분석(analysis of variance, ANOVA)하였으며, 통계학적 유의성의 기준은 p값이 0.05 미만인 경우로 하였다. 유의한 차이가 있는 경우 각각의 집단 간 Tukey 검정을 통해 확인하였다.

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A B C

D E

Figure 2. Meibographic images of upper and lower eyelids using Meiboviewer for animal experiments. Black mice (A), white mice

(B), white rat (C), black rabbit (D), and white rabbit (E).

Table 2. Ratio of upper meibomian gland length to lower mei-

bomian gland length in mouse, rat and rabbit

Upper/Lower ratio

Black mouse 2.0 ± 0.4

White mouse 1.5 ± 0.2

Black rat 1.7 ± 0.3

Black rabbit 1.7 ± 0.2

White rabbit 1.7 ± 0.2

p-value 0.17

Values are presented as mean ± SD unless otherwise indicated.

결 과

먼저 마이봄샘촬영을 시행한 검사결과 중 생쥐의 결과 를 보면, 모두 마이봄샘을 촬영할 수 있었지만 검은색 생 쥐에서 조금 더 분명하게 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 또한 윗눈꺼풀보다 아랫눈꺼풀에서 마이봄샘이 조금 더 길게 관찰이 되었음을 확인하였다. 다음으로 쥐의 경우, 흰색 동물만을 이용하여 검사를 시행하였기 때문에 검은색 및 흰색 간의 비교는 하지 못하였지만 마이봄샘을 촬영하는 것에는 무리가 없었다. 마지막으로 토끼에서는 생쥐, 쥐와 비교하여 검은색 및 흰색 동물 모두에서 마이봄샘의 촬영 이 수월하게 진행되었으며, 마이봄샘의 용적과 모양 모두 만족스러운 결과를 보였다. 또한 검은색과 흰색 동물을 비 교하였을 때, 검은색 동물이 조금 더 뚜렷한 관찰이 가능

하였다(Fig. 2). 이렇듯 모든 동물에서 윗눈꺼풀의 마이봄 샘이 보다 더 길고 관찰하기 더 용이하였다. 동물 간 비교 를 위해 윗눈꺼풀의 마이봄샘의 길이와 아랫눈꺼풀의 마 이봄샘의 길이의 비율을 측정한 결과 각 동물 간에 통계 적으로 유의한 차이는 없었다(Table 2).

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A B

Figure 3. Histologic results of meibomian gland. The structures such as the central duct and the surrounding lobules of the rabbit

were observed more uniformly than the other animals. In rats and rabbits, ductal epithelial cells were observed, but in the mouse, epithelial cells of the central duct were not clearly observed (Upper: mouse, Middle: rat, Lower: rabbit) (Hematoxylin and Eosin [H&E] stain, A: ×40, B: ×200).

Table 3. Central duct, acinar area and central duct diameter in mouse, rat and rabbit

Duct diameter (μm) Duct & acinar area (μm²)

Mouse 19.1 ± 2.3 2,011.7 ± 1,112.9

Rat 65.8 ± 25.2 13,785.3 ± 20,424.7

Rabbit 129.5 ± 21.6 47,275.7 ± 18,959.0

p-value^* <0.05 <0.05

Values are presented as mean ± SD unless otherwise indicated.

*Analysis of variance (ANOVA).

H&E 염색을 이용한 조직학적 검사에서, 세 동물의 마 이봄샘의 모양을 보면 토끼가 중심관 및 주변 세엽세포 등의 구조물이 다른 동물에 비해 균일하게 배열되어 관찰 이 되었다(Fig. 3). 확대한 사진에서 보면, 세 동물 모두 중 심관 및 주변 세엽세포의 구조를 파악하기에는 무리가 없 었다. 또한 쥐와 토끼에서는 관의 상피세포가 관찰되었지

만 생쥐에서는 중심관의 상피세포가 명확히 관찰되지 않 았다(Fig. 3). 중심관의 장축직경을 측정한 결과, 토끼군에 서 평균 129.5 μm로 가장 길게 측정되었으며, 생쥐군에서 평균 19.1 μm로 가장 짧게 측정되었고 이는 통계적으로 유의하였다(Table 3). 중심관 및 세엽세포의 면적을 측정 한 결과, 토끼군에서 평균 47257.7 μm², 생쥐군에서 평균

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A

B

C

Figure 4. Immunohistochemistry results of meibomian gland (CK 5, CK 6). In the case of mouse, the size of the lobules and the cen-

tral ducts was small, so that the difference between CK 5 and CK 6 was not apparent (A). In addition, it was difficult to determine whether the central duct epithelial cells were stained in both CK 5 and CK 6 (A). However, in rats, CK 5 was stained in the epithelium and lobules of the duct, and CK 6 was stained only in the ductal epithelial cells (B). In rabbits, the difference between CK 5 and CK 6 was most obvious (C) (A: Mouse, B: Rat, C: Rabbit) (Left: CK 5, Right: CK 6, ×100).

2,011.7 μm²로 중심관의 직경결과와 동일한 양상의 결과 를 보였고 통계적으로 유의한 결과를 보였으나 생쥐와 쥐 간에는 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.108, Table 3).

CK 5, 6에 대한 면역조직화학염색결과, 생쥐의 경우 마 이봄샘의 세엽과 중심관의 크기가 작아 CK 5와 CK 6의 차이가 뚜렷이 나타나지 않았다(Fig. 4A). 또한 CK 5, 6 모두 중심관 상피세포의 염색 여부를 파악하기가 어려웠 다(Fig. 4A). 그러나 쥐에서는 CK 5는 관의 상피세포와 세엽세포에 염색되는 것이 뚜렷이 관찰되었고 CK 6는 관 의 상피세포에 국한되어 염색되는 차이를 보였다(Fig.

4B). 토끼에서는 CK 5와 CK 6의 차이를 가장 선명하게 확인할 수 있었다(Fig. 4C).

추가로 마이봄샘을 가로면과 시상면으로 잘라 어떤 차 이점이 있는지 확인해 보았다. 시상면에서는 마이봄샘의 전체를 볼 수 있었고, 가로면으로 자르는 경우엔 국소적인 부분만 관찰 가능한 측면이 있었으나 시상면에 비해 중심 관과 주변의 세엽세포를 좀 더 자세히 확인할 수 있었다 (Fig. 5).

고 찰

사람의 마이봄샘의 구조에는 윗눈꺼풀과 아랫눈꺼풀 사이에 차이점이 존재한다.¹⁵ 윗눈꺼풀의 마이봄샘은 평균 31개, 5.5 mm의 길이로 존재하며, 아랫눈꺼풀의 마이봄샘

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A

B

Figure 5. Structures of meibomian glands in different section. In sagittal section (A), although there is an advantage of observing the

entire meibomian gland, there is a disadvantage in that it cannot confirm the structure of the gland structure because there is difference in the structure depending on the cutting position. On the other hand, in Transverse section (B), only the portion corresponding to the cutting position can be observed, but the relationship between the central tube and the surrounding lobules could be seen more clearly (A: Sagittal section, B: Transverse section, Hematoxylin and Eosin [H&E] stain, ×40).

은 평균 26개, 2 mm의 길이로 존재한다.¹⁵ 마이봄샘의 용 적 측면에서 보면, 윗눈꺼풀의 용적이 아랫눈꺼풀의 용적 보다 약 2배로 큰 것으로 알려져 있다.¹⁵

마이봄샘기능부전 및 안구건조증의 병태생리, 치료효과 등을 알아보기 위하여 생쥐, 쥐, 토끼, 원숭이 등의 다양한 동물모델들을 통해 그동안 여러 연구들이 진행되었다. 본 연구에서는 동물들을 살아있는 상태에서 마이봄샘촬영을 시행하여 그 결과를 비교하였고, 동물별 마이봄샘 구조와 면역조직화학적 구조의 차이를 분석하였으며, 동물실험연 구모델로 어떠한 동물이 가장 이상적인지 찾아보았다.

사람의 마이봄샘은 윗눈꺼풀에 위치한 것이 아랫눈꺼 풀에 위치한 것보다 샘의 수도 많으며, 길이도 긴 것이 특 징이라고 볼 수 있는데,¹⁵ 본 연구에서 진행한 세 동물에 서 측정한 마이봄샘길이의 비율을 측정한 결과상 윗눈꺼 풀의 마이봄샘이 아랫눈꺼풀의 마이봄샘보다 길고 관찰 하기 용이하였다. 그러나 동물 간에 윗눈꺼풀의 마이봄샘 과 아랫눈꺼풀의 마이봄샘비율은 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한 본 연구에서는 동물 간의 결과 차이뿐만 아 니라, 같은 동물 내에서 검은색과 흰색 동물 간의 결과 차 이도 분석을 하였다. 그 결과, 흰색 동물에 비해 검은색 동 물의 마이봄샘이 더 뚜렷하게 관찰할 수 있는 차이점이 있었다. 이를 통해 마이봄샘촬영을 시행하는 동물실험을

시행하는 경우 검은색 동물로 실험을 진행하는 것이 결과 차이를 볼 때 좀 더 용이할 것으로 생각된다.

마이봄샘의 조직학적인 면을 비교하였을 때, 중심관의 직경, 중심관 및 세엽세포의 면적 모두 토끼가 가장 크게 측정되었으며, 생쥐가 가장 작게 측정되었다. 이것은 조직 학적 구조를 관찰하여 연구할 때 마이봄샘 용적이 큰 토 끼로 연구하는 것이 변화를 관찰하기에 용이하다는 것을 의미한다. 마이봄샘의 조직학적 구조를 확인할 때 시상면 으로 잘라 관찰하는 경우와 가로면으로 잘라 관찰하는 경 우에 나타나는 구조가 다르게 되는 것이 일반적이다. 본 연구에서는 병리학적 결과를 확인할 때 어떠한 단면으로 자르는 것이 구조를 확인하기에 알맞은 방법인지 알아보 기 위해 토끼를 이용하여 눈꺼풀의 정중앙부위에 단면을 달리하여 조직학적 결과를 보았을 때 나타나는 차이에 대 하여 알아보았다. 마이봄샘을 시상면으로 자르는 경우, 마 이봄샘의 전체를 볼 수 있는 장점이 있으나, 자르는 위치 에 따라 나타나는 구조에 차이가 있어 관의 구조를 확인 하지 못할 때가 있는 단점이 있다. 반면 가로면으로 잘라 마이봄샘을 확인하면 자르는 일부 위치에 해당하는 부분 만 관찰 가능하나, 중심관과 주변의 세엽세포의 관계를 조 금 더 분명하게 알 수 있었다(Fig. 5).

CK 5, 6에 대한 면역염색으로 마이봄샘의 조직학적 구

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조를 확인할 수 있었다. CK 5의 경우 세엽세포와 중심관 의 상피세포를 함께 염색하고, CK 6의 경우 중심관의 상 피세포만을 염색하는 것이 특징인데, 본 연구에서도 이와 비슷하게 CK 5의 경우 마이봄샘의 세엽세포와 관의 구조 를 함께 염색하고, CK 6는 관의 구조만을 염색하여 마이 봄샘기능부전 등의 원인이 되는 과각질화를 확인하는 데 도움이 된다고 생각한다. 다만, 생쥐에서는 관의 상피세포 의 염색이 뚜렷하게 되지 않아 쥐와 토끼에서 비교적 더 쉽게 파악할 수 있을 것이라고 생각한다.

면역조직화학적염색을 추가로 시행하는 것이 중심관, 주변세엽세포를 염색하여 이상소견을 확인하기에 도움을 줄 수 있을 것이라 생각한다. 다만 Butovich et al¹⁶에 따르 면, 토끼의 경우 사람과 마이봄샘의 성분, 조성이 달라 토 끼를 통해서 눈물조성이나 눈물의 화학적 조성에 대한 연 구를 하기에는 부적합하다고 한 바 있다. 그러나 본 연구 에서는 성분 조성에 대한 연구보다는 구조적인 측면에서 다룬 것이기 때문에 이 부분에 대해서는 추가연구가 필요 하다고 본다.

실험동물의 마이봄샘구조를 관찰할 수 있는 마이봄샘 촬영장비를 통해 마이봄샘기능부전이나 안구건조증 동물 실험에서 마이봄샘구조를 순차적으로 평가하는 것이 가 능하게 되었다. 정확한 촬영을 위한다면 사람과 검은색 토 끼를 선택하는 것이 적합하다고 보여지며, 추가적으로 해 부학적 구조를 파악할 때 가로면으로 잘라서 관찰하는 것 이 마이봄샘의 구조나 주변구조물의 이상유무를 파악하 기에 적합하다고 생각한다. 또한 면역조직화학염색을 통 해 관의 상피세포와 세엽세포를 염색, 확인하여 이상소견 을 확인하는 데 도움이 될 것이라고 생각된다.

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= 국문초록 =

다양한 실험동물에서의 마이봄샘 촬영 및 면역조직화학적 구조 관찰

목적: 동물실험에 대표적으로 사용되고 있는 생쥐, 쥐, 토끼의 마이봄샘 촬영 소견 및 면역조직화학적 구조를 비교하여 동물별 결과의 차이를 파악하였다.

대상과 방법: 각각 다섯 마리의, 검은색 및 흰색으로 구분한 생쥐, 쥐, 토끼의 윗눈꺼풀과 아랫눈꺼풀의 마이봄샘을 촬영하였으며, 마이봄샘의 촬영은 동물실험용 마이봄샘촬영장비를 이용하였다. 촬영한 결과를 토대로 윗눈꺼풀과 아랫눈꺼풀의 마이봄샘길이의 비 율을 측정하였다. 이후 눈꺼풀조직을 적출하여 눈꺼풀의 정중앙부분을 가로면과 시상면으로 잘라 Hematoxylin and Eosin (H&E) stain 및 면역조직화학염색을 하여 조직학적 구조를 비교하였다. 또한 마이봄샘 중심관의 직경과 중심관과 주변 세엽세포를 포함한 면적을 측정하여 비교하였다.

결과: 동물 간의 마이봄샘촬영결과를 비교해 본 결과, 검은색 토끼가 가장 뚜렷하게 관찰되었다. 윗눈꺼풀과 아랫눈꺼풀의 마이봄샘길 이의 비율을 비교한 결과 동물 간 통계적으로 의미있는 차이는 보이지 않았다. 마이봄샘의 조직학적 구조는 세 동물 모두 관찰이 가능하였으나 생쥐에서 중심관의 상피세포가 분명히 관찰되지 않았다. 마이봄샘을 시상면으로 자르는 경우와 비교하여, 가로면으로 잘랐을 때 중심관의 크기와 주변의 세엽세포의 관계를 더 분명하게 알 수 있었다. 중심관의 직경을 측정한 결과 토끼, 쥐, 생쥐 순으로 크게 측정되었고 이는 통계적으로 유의하였으며, 중심관 및 주변 세엽세포를 포함하여 측정한 면적은 토끼가 가장 크게 측정되었고, 쥐, 생쥐순으로 크게 측정되었지만 쥐와 생쥐와의 크기 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 면역조직화학염색을 통한 결과는 세 동 물 모두에서 Cytokeratin 5 (CK 5)에서는 중심관의 상피세포와 주변 세엽세포, Cytokeratin 6 (CK 6)에서는 중심관의 상피세포만을 염색하는 특징이 있었다.

결론: 실험동물이 클수록 마이봄샘의 크기가 크고 실험동물의 색이 검은 경우 대조효과로 흰색 동물보다 마이봄샘의 관찰이 용이하여 마이봄샘의 정확한 촬영에는 검은색 토끼가 가장 적합하였다. 마이봄샘을 시상면으로 자르는 경우와 비교하여, 가로면으로 잘랐을 때 중심관의 크기와 주변의 세엽세포의 관계를 더 분명하게 알 수 있었다.

<대한안과학회지 2018;59(1):9-16>