Volume 6, Number 1 , A p r i l , 2003
인간 제대혈 유래 간엽줄기/전구세포의 골아세포 분화
메디포스트㈜ 생명공학연구소, 성균관의대 삼성서울병원 정형외과학교실
양성은・이만경・양윤선・하철원
= Abstract =
Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem/Progenitor Cells Developed in Cultures from Human Umbilical Cord Blood
Sung-Eun Yang, M.D.,Ph.D., Man-Kyoung Lee, Yoon Sun Yang, M.D.,Ph.D., Chul-Won Ha, M.D.,Ph.D.*
Medipost Biomedical Research Institute, Yongin-si, Kyungki-do, Korea, Department of Orthopedic Surgery, Samsung Madical Center, Sungkyunkwan University, School of Medicine, Seoul, Korea*
Purpose: To demonstrate the existence in human umbilical cord blood (hUCB) of circulating mesenchymal stem/progenitor cells(MSPC), the adherent cells developed in cultures from hUCB were characterized and induced to differentiate into osteoblasts.
Materials and Methods: Fifty hUCB harvests were cultured in the media supplemented with 10% fetal bovine serum. Homogeneously adherent fibroblast-like cells obtained during successive subcultivation were characterized by immunophenotyping analysis and induced to differentiate into osteoblasts. Reverse transcrip- tion-polymerase chain reaction of osteogenic markers, alkaline phosphatase (ALP) stain, and von Kossa stain were performed.
Results: The adherent fibroblast-like cells developed in cultures from hUCB positively expressed the MSPC- related antigens, but, did not express the hematopoietic, HLA-DR, osteoclast, or endothelial antigens. These cells were well proliferated during successive subcultivation. Under osteogenic condition, these cells showed increased levels of osteogenic mRNAs and strong positivity in ALP and von Kossa stains at 4th week.
Conclusion: The homogeneous fibroblast-like cells developed in cultures from hUCB were considered to be MSPC. Morphological and immunophenotypical characteristics of these cells were very similar to those of bone marrow-derived MSPC, and well differentiated into osteoblasts.
Key Words: Human umbilical cord blood, Mesenchymal stem/progenitor cells, Osteogenic differentiation
※ 통신저자: 하 철 원
서울시 강남구 일원동 50
성균관의대 삼성서울병원 정형외과학교실
TEL: 02) 3410-0275, FAX: 02) 3410-0084, E-mail: [email protected]
본 연구는 2 0 0 2년도 산업자원부 부품소재기술개발사업의 연구개발비 일부 지원을 통해 이루어졌음.
서 론
골수 간질(bone marrow stroma)의 일차적 기능은 조혈(hematopoiesis) 과정을 부양하는 것으로 조혈모세포(hematopoietic stem cells) 는 골수 간질 내에서 미분화 휴지기 상태로 유지 되거나 적혈구계, 백혈구계, 거핵구계의 각종 혈 구세포로 분화된다. 골수를 이용한 조혈모세포이 식은 줄기세포를 이용한 치료기술의 좋은 모델로 서, 조혈모세포 이상과 관련된 질환, 즉, 백혈병, 재생불량성 빈혈, 면역질환 등 다양한 질환의 치 료에 활발히 이용되고 있다.
한편, 골수는 조혈모세포 외에 각종 간엽 조직 으로의 분화 기능이 있는 간엽줄기세포( m e s- enchymal stem cells)를 포함하고 있다1 , 2 ). 간 엽줄기세포는 성숙한 골수 간질세포와 달리 자가 재생(self renewal)력이 있어 체외에서 대량 배 양이 가능하고, 다능성( m u l t i p o t e n t i a l i t y )이므 로 적절한 신호 하에 골, 연골, 지방, 골수 간질, 건 등의 조직으로 분화하는 세포이다3 , 4 ). 간엽줄기 세포는 골수 간질 내에서 휴지기 상태로 유지되거 나 간엽조직으로의 분화가 시작되므로, 골수 간질 내에는 간엽줄기세포 외에 직계 수임( l i n e a g e commitment) 후 분화 단계에 있는 골형성 혹은 지방형성 전구세포(progenitor cells)도 함께 존 재하며, 그와 같은 간엽줄기/전구세포들이 조직 생성 및 재생에 중요한 기능을 담당하고 있다.
현재까지 인간 간엽줄기/전구세포( m e s e n c h y- mal stem/progenitor cells)의 가장 좋은 자원 은 골수이며, 그 순환성( c i r c u l a t i o n )에 관해서는 아직 알려진 바가 적지만, 최근에 말초혈액이나 제대혈(umbilical cord blood) 내에도 그와 같은 간엽줄기/전구세포의 성상을 갖는 세포군이 존재 한다는 보고가 있다5 , 6 ).
인간 제대혈은 훌륭한 조혈모세포원으로서 조직 적합항원이 일부 불일치한 경우에도 이식이 가능 하고, 이식편대숙주반응 등의 면역 부작용이 적으 며, 바이러스 등 미생물 감염정도가 낮고, 제대혈 은행의 운영을 통해 즉각적인 공급이 가능하다는 장점이 있어 제대혈 조혈모세포이식은 꾸준히 증 가해 오고 있다7 - 9 ). 반면, 제대혈 내에 존재하는
비조혈성 세포 성분에 관해서는 세포 표면항원의 표현 양상에 근거하여 조혈부양성 간질세포 (myelosupportive stromal cells), 내피 전구세 포(endothelial precursor cells), 수지상 세포 (dendritic cells), 간엽성 섬유세포양 세포 (mesenchymal fibroblast-like cells) 등에 관 한 소수의 보고가 있을 뿐이다6 , 1 0 - 1 2 )
.
본 연구에서는 인간 제대혈로부터 분리, 배양되 는 세포군의 특징을 분석함으로써 제대혈 내에 간 엽줄기/전구세포가 존재하는 여부를 확인하고, 제 대혈 유래 간엽줄기/전구세포의 골형성능을 확인 하고자 하였다.
연구재료 및 방법 1. 제대혈 채취
본 연구에는 총 50 유니트의 제대혈이 이용되었 다. 분만 전에 산모로부터 제대혈 채취 및 연구에 관한 동의를 받은 후 동의서(informed consent) 를 작성하였다. 분만 시 제대를 잘 소독한 후 항 응고제 CPDA-1 23 mL이 포함되어 있는 제대 혈 채취백에 연결된 16G 주사침으로 제대정맥을 천자하여 중력에 의해 제대혈이 채취백 안으로 채 취되도록 하였다. 채취 후 세포 생존도가 90% 이 상인 경우에 한하여 4 8시간 이내에 세포 분리를 시행하였다.
2. 세포 배양
채취된 제대혈로부터 Ficoll-Hypaque 용액 (1.077 g/cm3, Sigma, St. Louis, MO, USA) 을 이용한 원심분리(400 g, 35분) 방법으로 저밀 도 단핵세포층을 분리하였다. 분리된 단핵세포층 을 2% 우태혈청(Fetal bovine serum, HyClone, Logan, UT, USA)을 포함한 p h o s- phate buffered saline(PBS, pH 7.4)으로 세 척 후, 10% 우태혈청을 포함한 α- m i n i m u m essential medium(α-MEM) 배지에 세포수 3×
1 05 / c m2의 농도로 분주하여 150 cm2 세포배양용 기에 배양하였다. 배양 조건은 5% 이산화탄소 배 양기에 3 7℃, 습도 95% 이상을 유지하였으며, 배
양액은 1주일마다 교환하였다. 배양 개시 후 매일 유착성 세포군을 관찰하였으며, 유착성 세포들이 100% 교회하면(confluent), 트립신( 0 . 2 5 % trypsin, HyClone, Logan, UT, USA) 처리하 여 계대배양( s u b c u l t i v a t i o n )을 시행하였다. 계 대배양시 세포농도는 1×1 04 / c m2이었고, 10%
우태혈청을 포함한 α-MEM 배지를 이용하였으 며, 배양조건은 일차 배양과 동일하였다.
3. 면역표현형 분석
세포 표면항원의 면역표현형을 분석하기 위하여 균질성의(homogeneous) 유착성 세포군이 배양 되는 시점인 5세대( p a s s a g e )의 세포들을 트립신 처리한 후 2% 우태혈청이 포함된 PBS 용액을 이용해 3회 세척한 후, 다음과 같은 항체들과 반 응시켰다. 직접 반응에 이용된 항체는 조혈관련항 원으로 CD45-fluorescein isothiocyanate (FITC), CD34-FITC, CD14-FITC, 조직적합 항원으로 H L A - D R - F I T C (이상 Becton Dick- inson, San Jose, CA, USA), 내피세포항원으 로 CD31-FITC, 파골세포( o s t e o b l a s t )항원으로 CD51/61-FITC, Integrin 수용체 관련항원으로 CD29-phycoerythrin(PE), CD49d-PE, CD49e-FITC, Matrix 수용체 관련항원으로 CD44-PE, CD106-PE(이상 P h a r m i n g e n , Los Angeles, CA, USA), CD54-PE(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), 기타 항원 으로 CD13-PE,(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), CD64-FITC, CD90-FITC (이상 Pharmingen, Los Angeles, CA, U S A )이었다. 각각에 해당되는 동종 대조항체 (isotypic controls)로서 I g G1-FITC, IgG1- P E , I g G2 a- F I T C (이상 Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), IgG2 b-PE, IgG1- F I T C , I g G1- P E (이상 Pharmingen, Los Angeles, CA, USA)이 사용되었다. 간접반응에 이용된 항 체는 간엽줄기/전구세포 관련항원인 SH2, SH3, SH4(Osiris Therapeutics, Baltimore, MD, U S A )에 대한 항체였으며1 , 1 3 ), 그에 대한 이차항 체로서 IgG-FITC(Jackson ImmunoRe- search, West Grove, PA, USA)를 이용하였
다. 반응 후 분석은 FACSCalibur 유세포분석기 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)와 CELLQUEST 소프트웨어를 이용하였다.
4. 골분화
배양된 세포들을 10% 우태혈청을 포함한 α- MEM 배지에 세포수 1×1 04/ c m2의 농도로 6 - well plate에 분주한 후 5% 이산화탄소, 37℃
조건으로 90% 교회할 때까지 배양한 후, 골분화 배지로 배양액을 교환하여 동일한 조건으로 배양 하였다. 골분화 배지의 조성은 0.1 uM dexam- ethasone, 10 mM β-glycerol phosphate, 50 uM L-ascorbic acid 2-phosphate(이상 Sigma, St. Louis, MO, USA), 10% 우태혈 청, α-MEM 배지이었고1 4 ), 3일마다 배지를 교환 하면서 4주간 분화 배양하였다.
5. 역전사 중합효소연쇄반응
골분화 과정 중 골조직 관련 유전자들의 발현 양상을 관찰하기 위하여 분화 전, 분화 후 1주, 2 주, 3주, 4주의 세포를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 시행하였다. 양성대조로서 골 육종 세포주(MG63, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 이용하였다.
총 R N A는 각각의 샘플로부터 T R I z o l ( I n v i t- rogen, La Jolla, CA, USA)을 이용한 1 단계 acid-phenol guanidinium 방법을 이용하여 추 출하였다. 총 R N A의 농도를 260 nm의 파장 하 에서 분광측정기로 측정한 후, RNA 1 ug, Oligo dT primer(500 ug/mL) 1 uL, 10 mM dNTPs 1uL를 6 5℃, 5분 반응시킨 후, 0.1 M dTT 2 uL, 5× First-Strand buffer(250 mM Tris-HCl(pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 4 uL, RNase OUT ribonucle- ase inhibitor 1uL를 첨가하여 4 2℃, 2분간 반 응시켰다. 그 후, SuperScript II reverse transcriptase 1uL(200 units) (이상 I n v i t r o- gen, La Jolla, CA, USA)를 첨가하여 4 2℃
6 0분, 72℃ 1 5분 반응시켜 c D N A를 합성하였다.
중합효소연쇄반응은 cDNA 3 uL, Taq DNA polymerase 0.5 uL, 10× AccuPrime PCR buffer 2.5 uL, 10 pM primers 2 uL (이상 Invitrogen, La Jolla, CA, USA)를 포함한 25 uL 반응액으로 9 5℃, 5분 반응시킨 후, 95
℃, 30초, annealing 온도, 30초, 72℃, 30초 반응을 35 주기 시행한 후, 2% agarose gel에서 전기영동하여 ethidium bromide 염색으로 확인 하였다. 역전사 중합효소연쇄반응을 시행한 대상 유전자 및 각각의 annealing 온도와 반응산물의 크기는 Table 1과 같다.
6. 조직화학 염색
골아세포로의 분화를 관찰하기 위해 분화 후 1 주, 2주, 3주, 4주에 각각 alkaline phos- phatase 염색을 시행하였고, 골조직의 칼슘 광화 작용 ( m i n e r a l i z a t i o n )을 확인하기 위해 v o n Kossa 염색을 시행하였다. Alkaline phos- phatase 염색은 먼저 세포를 60% acetone으로 고정시킨 후, fast violet B salt를 포함한 naphthol AS-MX phosphate 용액 (Sigma # 85, Sigma, St. Louis, MO, USA)에 실온에 서 3 0분간 반응시킨 후, Meyer’s hematoxylin 용액으로 1 0분간 대조염색하였다. von Kossa 염 색은 먼저 세포를 methanol 용액으로 고정시킨 후, silver nitrate 용액으로 자외선 하에 1시간
반응시키고, 5% sodium thiosulfate 용액에 2 분, nuclear fast red 용액 (이상 Sigma, St.
Louis, MO, USA)에 3분 염색하였다.
결 과 1. 세포 형태학적 특성
제대혈로부터 분리된 단핵세포는 배양 후 3 ~ 5 일부터 방추형의(spindle-shaped) 긴 모양인 섬 유세포양 형태의 세포와 원형 혹은 타원형의 단핵 성 혈구세포가 혼합된 형태로 배양되기 시작하였 다 (Fig. 1A). 섬유세포양 형태의 세포 중 일부 에서는 세포질 돌기(cytoplasmic extensions)가 관찰되었다. 배양 후 2 ~ 3주에 그와 같은 다클론 성(polyclonal) 세포들이 서로 교회하면서 유착 성 단세포층( m o n o l a y e r )을 이루며 배양되었다 (Fig. 1B). 배지 교환 및 계대 배양 시 원형 혹 은 타원형의 혈구세포는 점차 제거되었고, 주로 섬유세포양 형태의 세포로 이루어진 균질성의 c o l o n y가 관찰되었다 (Fig. 1C). 총 50 유니트 의 제대혈 중 20 유니트로부터 (40.0%) 섬유세 포양 형태의 균질성 c o l o n y를 얻을 수 있었으며, 계대 배양 후 4 - 5세대 경에 그와 같은 균질성의 colony 형태로 배양되었다. 그와 같은 제대혈 유 래 균질성의 유착성 섬유세포양 세포군은 평균 1 5세대, 최고 2 3세대까지 형태학적인 변화 없이
Table 1. Primer sequences and PCR conditions of target genes Target
Primer sequences Annealing Size of
Gene temperature PCR Product
Alkaline 5’-TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA-3’ 55˚C 453bp
phospatase 5’-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC-3’
Osteopontin 5’-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3’
55˚C 347bp
5’-CAGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3’
Osteocalcin 5’-CATGAGAAGCCCTCACA-3’
55˚C 310bp
5’-AGAGCGACACCCTAGAC-3’
Collagen I 5’-GGTGGACAACCACCCTCA-3’
60˚C 366bp
5’-CCGCCATACTCGAACTGG-3’
Cbfa I 5’-CAGTAGATGGACCTCGGGAA-3’
60˚C 416bp
5’-GAGGCAGAAGTCAGAGGTGG-3’
GAPDH 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
55˚C 452bp
5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
계대배양이 가능하였다.
2. 면역표현형 분석
제대혈로부터 배양된 섬유세포양 형태의 균질성 세포군에 대해 유세포분석기를 이용해 면역표현형 을 분석한 결과, 조혈모세포항원(CD34) 음성, 조혈관련항원(CD45, CD14) 음성, 조직적합항원 (HLA-DR) 음성, 내피세포항원(CD31) 음성, 파골세포항원(CD51/61) 음성이었다(Fig. 2). 그 외 integrin 수용체 관련항원 중 CD29 양성, CD49e 양성, CD49d 음성이었으며, matrix 수 용체 관련 항원은 CD44 양성, CD54 양성, CD106 음성이었다. 기타 항원으로 CD13 양성, CD90 양성, CD64 음성이었다.
골수 유래 간엽줄기/전구세포 관련 항원인 SH2, SH3, SH4에 대해 양성이었으며, 특히 계 대 배양을 계속 진행한 후에도 ( 1 0세대, 15세대, 2 0세대) SH2, SH3, SH4의 항원성은 잘 유지되
었다(Fig. 3).
균질성의 섬유세포양 형태의 c o l o n y가 관찰된 20 유니트 중 10 유니트에 대해 면역표현형을 분 석한 결과, 세포 표면 항원 발현 정도가 S H 2 , SH3, SH4에 대해서 95% 이상 균질한 양상을 나타내었으며, 각각의 항원에 대해서는 각 제대혈 간에 일정한 표현 양상이 관찰되었다(Table 2).
3. 골분화
제대혈 배양을 통해 얻은 균질성의 섬유세포양 형태의 세포들을 골분화 배지에 배양하면서 4주 동안 1주 간격으로 alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, cbfa I, collagen I 형에 관해 역전사 중합효소연쇄반응을 시행한 결 과, 골분화 전 단계에서는 alkaline phos- phatase, osteopontin, cbfa I, collagen I 형 은 약양성이었고, osteocalcin은 음성이었다. 이 후, 골분화 1주 경부터 alkaline phosphatase, Fig. 1. Morphological characteristics of the adherent
cells obtained from human umbilical cord blood.
(A) adherent cells at day 3 (B) heterogeneous adherent cells at day 21 ( C) confluent fibroblast- like adherent cells similar to the bone marrow- derived colony forming unit-fibroblastic (CFU- F) colony at passage 5. Initially adherent round- or oval-shaped hematopoietic mononuclear cells disappeared with the change of medium and suc - cessive subcultivation and relatively homoge- neous population of spindle-shaped cells were obtained. (A: x100, B: x100, C: x100)
A
C
B
osteopontin, osteocalcin, cbfa I, collagen I 형 모두에 대해 양성이었으며, 특히 a l k a l i n e p h o s p h a t a s e와 o s t e o p o n t i n은 분화 기간이 길 어질수록 발현양이 증가되다가 분화 4주째에 최대 발현됨이 관찰된 반면, osteocalcin과 collagen I 형은 분화 1, 2주째에 최대 발현되다가 분화 3 , 4주째에 발현양이 감소되었다. cbfa I mRNA는 골분화 전체 기간 동안 비교적 일정하게 발현되 었다.
제대혈 배양을 통해 얻은 균질성의 섬유세포양 형태의 세포들을 골분화 배지에 배양하면서 4주 동안 1주 간격으로 alkaline phosphatase 및 von Kossa 염색을 시행한 결과는 Fig. 5와 같 다. Alkaline phosphatase 염색의 경우, 처음 1, 2주에는 양성도가 낮았던 반면, 3, 4주에 양 성률이 급격히 증가하였으며, 이는 역전사 중합효
소연쇄반응 결과와 유사한 경향이었다. von Kossa 염색의 경우, 분화 말기인 4주째에 강양성 을 보여 칼슘 침착에 따른 광화작용이 일어났음을 확인하였다.
고 찰
본 연구에서 인간 제대혈을 성장인자나 싸이토 카인 등을 첨가하지 않고 10% 우태혈청만을 포 함한 기본 배지로 배양했을 경우, 40%의 제대혈 에서 골수 유래 colony forming unit-fibrob- lastic (CFU-F)과 유사한 모양의 유착성 세포군 을 얻을 수 있었다1 5 , 1 6 ). 그와 같은 세포군은 일차 배양 당시에는 원형 혹은 타원형의 조혈성 단핵 세포들과 동시에 배양되지만, 배지 교환 및 계대 배양이 계속될수록 조혈 세포들은 제거되고, 4-5 세대 경에는 방추형의 긴 모양인 섬유세포양 형태 의 세포군이 균질적으로 배양되며, 그 중 일부 세 포에서는 세포질 돌기가 관찰되었다.
제대혈로부터 배양된 균질성의 섬유세포양 세포 Fig. 2. Immunophenotypic characterization of the con-
fluent fibroblast-like cells cultured from human umbilical cord blood at passage 5. These cells expressed antigens CD29, CD49e, CD44, CD54, CD13 and CD90, but did not express antigens CD14, CD34, CD45, CD49d, CD31, CD51/61, CD64, CD106, or HLA-DR.
Table 2. Immunophenotypic characterization of the confluent fibroblast-like cells obtained from human umbilical cord blood at passage 5
Antigens Positive cells (%) Median (n=10) Range (n=10)
SH2 97.5 96.4~98.2
SH3 95.1 94.1~97.5
SH4 97.2 95.9~98.4
CD45 0.01 0.0~0.04
CD34 0.01 0.0~0.02
CD14 0.01 0.0~0.04
HLA-DR 0.80 0.02~0.88
CD29 98.2 94.0~98.8
CD49d 5.20 1.4~9.2
CD49e 25.6 20.2~44.4
CD31 0.01 0.0~0.6
CD44 97.7 93.1~98.5
CD54 36.0 28.3~50.5
CD13 98.8 93.4~99.6
CD51/61 0.08 0.0~0.1
CD106 4.53 2.7~5.12
CD64 0.20 0.08~0.8
CD90 89.3 85.1~95.0
군은 골수 유래 간엽줄기/전구세포 관련 항원이 양성이었고, 조혈관련 항원 음성, 조직적합항원 중 HLA-DR 음성, 내피세포항원 음성, 파골세포 항원 음성이었으며, 체외에서 대량으로 계대배양 이 가능하였다. 또한 시험관 내 골분화 유도 시 골아세포로 분화되고 광화 작용을 일으키는 등 골 수 배양을 통해 얻어지는 간엽줄기/전구세포와 유 사한 특징을 나타내었다. 골형성 또는 연골형성 등의 간엽조직 생성 과정은 간엽조직 내에서 전구 세포의 이주( m i g r a t i o n )를 시작으로 이루어지는 것이 일반적인 사실로서 골수 내의 간엽줄기세포 는 그와 같은 전구세포의 가장 원시적인 형태라고 할 수 있다. 반면, 간엽줄기세포의 순환성( c i r c u- l a t i o n )에 관해서는 아직 알려진 바가 적다.
Kuznetsov 등5 )은 인간을 포함한 동물 모델에서 말초 혈액 내에 골아세포와 지방세포로 분화하는 줄기세포가 존재한다고 하였으며, Erices 등6 )은
인간 제대혈 내에 골분화력과 지방조직 분화력을 동시에 갖는 순환성 비조혈성 전구세포가 존재한 다고 하였다. 반면, Bucala 등1 7 )은 말초 혈액 내 에 조직 재생 및 항원 표현의 기능이 있는 섬유세 포양 세포군이 존재하지만 그 표현형은 간엽줄기 세포와 다를 뿐만 아니라 각종 조직으로의 분화력 도 없음을 보고하였다. 본 연구에서 관찰된 제대 혈 유래 균질성 유착성 섬유세포양 세포군은 형태 학적으로나 면역표현형적으로 골수 유래 간엽줄기 /전구세포와 동일하였고, 체외에서 대량으로 배양 이 가능하면서 골분화력이 있었으므로, 이는 제대 혈 내에도 비조혈성 골형성 간엽줄기/전구세포가 순환하고 있음을 증명하는 소견이라 하겠다. 전구 세포는 한 직계( l i n e a g e )에로의 분화와 성숙을 하는 세포인 반면, 줄기세포는 보다 원시적이어서 신호의 종류에 따라 여러 직계로의 분화가 가능한 세포이므로, 제대혈 내 순환성 간엽줄기세포만의 Fig. 3. Positive expression of mesenchymal stem/progenitor cells-related antigens, SH2, SH3, and SH4 in the homo-
geneous fibroblast-like cells cultured from human umbilical cord blood at passage 5. SH2, SH3, and SH4 were well expressed during successive subcultivation.
Fig. 2. A: Umbilical cord blood (UCB)-derived fibroblast-like cells at passage 5 Fig. 2. B: UCB-derived fibroblast-like cells at passage 10
Fig. 2. C: UCB-derived fibroblast-like cells at passage 15 Fig. 2. D: UCB-derived fibroblast-like cells at passage 20
A B C D
Negative Control
SH2
SH3
SH4
존재를 증명하기 위하여는 골분화 이외에 연골, 지방 등의 다른 간엽조직으로의 분화를 증명할 필 요가 있다. 아울러 그와 같은 순환성 간엽줄기/전 구세포들의 기원 및 h o m i n g과 관련된 메커니즘 에 관한 연구가 계속 되어야 할 것이다.
본 연구에 사용된 제대혈 중 4 0 %에서만 간엽성 전구세포가 배양되었다. 실험에 이용된 모든 제대 혈에 대해 동일한 채취 방법과 동일한 제조번호의 우태혈청 및 배양 조건을 이용하는 등 배양 방법 이 같았으므로 이는 조혈모세포에서 관찰되는 것 과 같은 제대혈 간의 실제 생물학적 차이 때문이 라고 사료된다. 현재까지 간엽줄기/전구세포에 특 이한 항원이 정립되지는 않았지만, 제대혈 내의 간엽줄기/전구세포 분리를 위한 보다 민감도 높은 기술의 개발이 필요하다. 또한 일차 배양 및 초기 계대 배양 시에는 조혈성 단핵세포들이 섞여 다클 론성으로 배양되다가 4 - 5세대에 이르러 비로소 균질성의 간엽전구세포군으로 배양되는 등의 소견
은 민감도는 물론 특이도가 높은 분리 기술이 필 요함을 시사한다 하겠다. 이와 관련해 미분화 상 태의 간엽줄기세포를 체외 대량 배양하는데 있어 서 Lennon 등은 우태혈청 종류에 따른 배양 결 과의 차이와 그 선택 기준의 중요성을 강조한 바
있다1 8 ).
최근 조직 재생 및 질환 치료에 간엽줄기/전구 세포를 이용한 조직공학적 접근과 그에 관한 연구 가 활발하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 제대 혈 내 간엽줄기/전구세포의 존재를 확인하였고 또 이의 골 형성능을 증명한 바, 향후 제대혈을 이용 한 간엽줄기/전구세포의 정형외과적 응용에 큰 도 움이 될 것으로 사료된다.
제대혈은 비교적 구하기 쉬운 재료이며, 장기간 냉동저장이 가능하기 때문에 관혈적 채취를 해야 하는 골수로부터 간엽줄기/전구세포를 분리하는 방법에 비해 임상적 유용성이 더 클 수 있다 하 겠다.
Fig. 4. mRNA levels of osteogenic markers as detected by reverse transcription-polymerase chain reaction. Expres- sion of alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, collagen type I, cbfa I, and GAPDH were examined using RNA isolated from the human umbilical cord blood (UCB)-derived adherent fibroblast-like cells under osteogenic differentiation.
Fig. 4. M : molecular marker, MG63 : osteosarcoma cell line, positive control
Fig. 4. D0 : UCB-derived adherent fibroblast-like cells without osteogenic differentiation Fig. 4. 1W : 1 week of osteogenic differentiation
Fig. 4. 2W : 2 week of osteogenic differentiation Fig. 4. 3W : 3 week of osteogenic differentiation Fig. 4. 4W : 4 week of osteogenic differentiation
M D0 1W 2W 3W 4W MG63
Alkaline phosphatase
453 bp
347 bp
310 bp
366 bp
416 bp
452 bp Osteopontin
Osteocalcin
Collagen type I
Cbfa I
GAPDH
결 론
인간 제대혈로부터 분리, 배양된 균질성의 유착 성 섬유세포양 세포군은 형태학적, 면역표현형적 으로 간엽줄기/전구세포로 사료되었고, 이는 골아 세포로 분화가 가능하였다. 본 연구의 결과로 제 대혈 내에 순환성 비조혈성 골형성 간엽줄기/전구 세포가 존재함을 확인할 수 있었다.
감사의 글
본 연구에 사용된 SH2, SH3, SH4 하이브리 도마 세포주를 제공해주신 세종대학교 오덕재 교 수님께 감사드립니다.
R E F E R E N C E S
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Fig. 5. Osteogenic differentiation potential of human umbilical cord blood-derived adherent cells with homogeneous fibroblast-like morphology. Appearance of osteoblasts was detected by alkaline phosphatase expression (x40).
Calcium matrix mineralization was detected by von Kossa stain which stain the bone mineral with silver (x40).
Alkaline phosphatase stain
1W 2W 3W 4W
Von Kossa stain
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