Effects of Yoohyangheukho-dan (R?xi?ngh?ih?-d?n) on Osteoporosis Induced by Ovariectomy in Rats

Original Article

乳香黑虎丹이 난소적출로 유발된 흰쥐의 골다공증 모델에 미치는 영향

금창준⋅조창영⋅임정민⋅송대욱⋅김재현⋅이비나⋅정혁상

경희대학교 한의과대학 해부학교실

Effects of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) on Osteoporosis Induced by Ovariectomy in Rats

Chang-Jun Kum, Chang-Young Cho, Jeong-Min Lim, Dea-Uk Song, Jae-Hyun Kim, Bina Lee, Hyuk- Sang Jung

Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Institute of Korean Medicine, Kyung Hee University

RECEIVED June 16, 2014 REVISED July 12, 2014 ACCEPTED July 15, 2014

CORRESPONDING TO

Hyuk-Sang Jung, Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Institute of Korean Medicine, Kyung Hee University, 1, Hoegi-dong, Dongdaemun-gu, Seoul 130-701, Korea

TEL (02) 961-9449 FAX (02) 961-0327 E-mail [email protected]

Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives Osteoporosis is an impending problem in the rapidly aging society. The pur- pose of this study is to identify the effects of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) on osteoporosis induced by ovariectomy in rats.

Methods 24 rats were randomly assigned to a SHAM group, a control group, and a Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) group (n=8). Ovaries were extracted and for 8 weeks, the rats were given dry feeds and Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) group were given a mixture of dry feeds and Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān). At 8 weeks, their body weight, femur mass, tibia ash per body ratio, overall surface area and thickness of the trabeculae, overall surface area of the osteoblasts, and the number of os- teoclasts were measured and levels of albumin, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total-cholesterol, calcium and estradiol were recorded.

Results There was no significant difference in the weight of the femur and the tibia ash per body ratio. The Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) group had significantly thicker trabeculae than the control group and showed a minimal increase of overall surface area of the trabeculae. The overall surface area of the osteoblasts and the number of osteoclasts decreased in the Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) group. There were no statisti- cally significant differences in AST, ALT, ALP, total cholesterol, phosphorus, and estradiol levels. On the contrary the Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) group had sig- nificantly higher levels of Albumin, triglyceride, and calcium.

Conclusions It can be concluded that oral intake of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiāng- hēihǔ-dān) prevents the thinning process of the trabeculae. Thus, it may have positive ef- fects on the treatment and prevention of osteoporosis in postmenopausal women. (J Korean Med Rehab 2014;24(3):29-37)

Key words Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān), Osteoporosis, Postmenopausal osteoporosis, Osteoblast, Osteoclast

서론»»»

세계보건기구(WHO)의 정의에 따르면 골다공증은 전 신적인 골격계 질환으로 뼈의 미세구조의 이상과 골량의 감소가 일어나는 질환이다¹⁾. 이렇게 약화된 뼈는 골절되 기 쉬운 상태에 이르기 때문에 합병증으로 골절이 발생하 는 경우가 많은데, 미국의 임상 통계를 살펴보면 골다공 증으로 인한 엉덩이뼈 골절 환자의 경우 1년 이내에 사망 하는 비율은 20%에 달하며, 골절 이전의 상태로 기능이 회복되지 못하는 경우와 스스로 보행이 불가능해지는 비 율은 50%에 달한다²⁾. 이처럼 심각한 경과를 야기시킬 수 있는 골다공증은 세계적인 인구 고령화 현상으로 인해 국 내뿐만 아니라 전 세계적으로 중요한 보건학적 문제로 인 식되고 있다³⁾.

국내의 관련 통계를 살펴보면 건강보험심사평가원 심 사결정자료를 분석한 결과, 골다공증으로 인한 진료인원 과 총 진료비는 2007년 53만 5천명, 535억원에서 2011년 77만 3천명, 722억원으로 진료인원은 약 44.3%, 총 진료 비는 약 35.0%가 증가하였다. 또한 2011년을 기준으로 진료인원 점유율은 50대 이상의 장년, 노년층에서 93.7%, 최근 5년간의 연령구간별 증가율 추이는 50~59세 33.1%, 60~69세 41.2%, 70세 이상 75.2%로, 최근 고령인구 증가 로 인한 50대 이상의 장년, 노년층 높은 골다공증 유병율 을 확인할 수 있다⁴⁾.

이처럼 골다공증으로 인한 문제는 심각해지고 있는 반 면, 골다공증에 효과적으로 대응하기 위한 방법은 부족한 것이 현실이다. 운동법 등의 일반적 권고 사항과 칼슘, 비타민 D, 비스포스포네이트 제제 등과 같은 약물요법이 임상에서 많이 활용되고 있으나 이러한 치료법은 골다공 증의 발생을 효과적으로 예방하기 어려울 뿐만 아니라 악 골괴사, 비전형적 골절 등과 같은 부작용을 동반시킬 수 있는 것으로 알려져 있다⁵⁾. 특히 대표적인 에스트로겐 대 체 요법은 장기적으로 사용할 경우 유방의 충혈, 유방암 발병 가능성 증가와 같은 부작용을 야기시킬 수 있어 주 의가 필요하다^6,7). 더욱이 골다공증은 골절이 생기기 전까 지는 임상적 증상이 거의 발현되지 않아 적절한 시점에 치료개입이 이루어지기 힘들기 때문에 현재의 골다공증 치료법을 보완할 수 있는 효과적인 치료법과 예방법의 개 발은 매우 중요하다고 할 수 있다.

한의계에서도 이와 관련된 각종 연구가 진행되었는데,

한의학 문헌에서 骨은 腎과 관련된다고 보았으며(黃帝內 經 素問 六節藏象論篇⁸⁾; 腎者, 主蟄封藏之本, 精之處也氣 華在髮, 其充在骨), 腎의 이상으로 骨이 제대로 자양받지 못해 발생하는 ‘骨痿’ (黃帝內經 素問 痿論篇⁸⁾; 腎主身之 骨髓’, ‘腎氣熱, 則腰脊不擧, 骨枯而髓減, 發爲骨痿)라는 개념이 존재하는데 骨多孔症이 여기에 포함된다고 할 수 있다⁹⁾.

骨多孔症의 한의학적 병인병리는 크게 네 가지로⁹⁾ 그 중 腎陰虛證, 腎陽虛證, 氣血兩虛證의 경우 加味左歸飮¹⁰⁾, 六味地黃湯加味¹¹⁾, 生血補髓湯¹²⁾, 滋陰八味煎¹³⁾, 人蔘養榮 湯¹⁴⁾ 등과 같이 腎精의 부족을 회복시켜주는 약물을 바탕 으로 한 관련연구가 많이 이루어진 반면 風邪偏勝證은 관 련된 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다. 風邪偏勝證 의 경우 風邪가 侵襲하여 관절에 遍歷, 筋脈을 막아 腎의 水液조절 기능이 원활치 못해 骨髓가 자양되지 못하는 것 으로, 다른 證과는 달리 萎軟無力 한 증상과 함께 관절의 屈伸이 어려워지고 유주성 관절동통이 동반된다⁹⁾.

이러한 風邪偏勝證과 관련된 부분을 東醫寶鑑에서 찾 아보면, 風邪偏勝證은 東醫寶鑑 雜病篇¹⁵⁾에 언급된 歷節 風과 증상, 병리가 상통한다고 볼 수 있다. 東醫寶鑑 雜 病篇에서는 歷節風의 증상에 사용가능한 다양한 처방들 을 제시하고 있는데(歷節風宜用 神通飮 定痛散 虎骨散 加 減虎骨散 麝香元 乳香黑虎丹 乳香定痛丸 捉虎丹), 그 중 乳香黑虎丹은 특히 모든 風과 寒 및 濕으로 인해 骨節과 온몸이 아픈 것을 치료하는데 효과가 좋다고 언급되어있 다. 즉, 실제 임상에서 風, 寒 ,濕邪로 인해 骨髓가 자양 되지 못하여 관절 혹은 전신 부위에 통증을 동반하는 환 자의 경우 乳香黑虎丹의 활용을 고려해 볼 수 있다는 것 으로, 골다공증의 다양한 한의학적 병인병리 중 특히 이 러한 風邪偏勝證을 통한 접근은 뼈의 약화 외에 종창, 유 주성 관절동통 등과 같은 임상 증상이 함께 발현되어⁹⁾ 빠 른 치료개입이 가능하고, 이는 다시 말해 치료과정에서 증상완화뿐만이 아니라 골다공증에서 특히 중요한 예방 효과를 동시에 줄 수 있다는 것을 의미하기 때문에 임상 적으로 매우 큰 의미를 갖는다고 할 수 있다.

아직 연구된 바가 없는 乳香黑虎丹이 골다공증 예방과 치료에 미치는 효과를 살펴보기 위해 저자는 골다공증 유 발 모델로써 흰쥐의 난소를 적출하여 estrogen 결핍으로 인한 골다공증을 유발시키고¹⁶⁾, 乳香黑虎丹을 8주간 구강 투여한 후 체중의 변화와 체중대비 대퇴골의 무게와 경골

Herb name Scientific name Dose (g) 草烏 Aconiti Ciliare Tuber 200.0 當歸 Angelicae Gigantis Radix 80.0 五靈脂 Trogopterorum Faeces 80.0 白芷 Angelicae Dahuricae Radix 80.0

羌活 Osterici Radix 80.0

川芎 Cnidii Rhizoma 80.0

自然銅醋淬 Pyritum 80.0

乳香 Olibanum 40.0

蒼朮 Atractylodis Rhizoma 120.0 840 g Table I. Composition of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ- dān)

의 회분함량, 대퇴골 조직에서의 골소주 두께, 골소주 면 적, osteoblast와 osteoclast의 변화, 그리고 혈액에서의 calcium, phosphrous, estradiol, alkaline phosphatase (ALP), total cholesterol, triglyceride, albumin, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT)의 변화 를 관찰하였다.

재료 및 방법»»»

1. 동물

동물실험은 동물실험 윤리위원회의 심의를 통과한 후 진행하였으며(심의번호:KHUSP(SE)-13-051) 실험동물과 관 련된 모든 실험과정과 관리는 Korean Academy of Medical Sciences에서 발행된 “동물실험지침”에 의거하였 다. 실험동물은 체중 200 g (7주령)의 Sprague-Dawley 계 암컷 흰쥐로, 오리엔트 바이오(Seongnam-si, Gyeonggi- do, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 모든 실험동물은 습도 40~60%, 온도 21~23^oC, 낮과 밤의 주기는 각각 12 시간의 실험실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 사용하였 다.

2. 검액의 제조

본 실험에 사용한 약재는 東醫寶鑑 雜病篇¹⁵⁾에 수록된 乳香黑虎丹 처방 구성약물로 (주)옴니허브(대구)에서 구 입하였으며 구체적인 약재와 20첩 분량은 Table I과 같

다. 본 실험에서는 흰쥐가 1일 체중 100 g 당 7 g의 사료 를 섭취함을 예비실험을 실시해 확인하였고, 이를 바탕으 로 300 g의 쥐 8마리가 60일 가량 섭취할 사료 9,600 g을 산출, 총 10 kg의 사료를 제조하였다. 건조 사료는 분말 사료에 20첩(840 g) 분량의 乳香黑虎丹 구성 한약재를 분 말하여 혼합하는 방법으로 제조하였다.

3. 실험군의 분류

골다공증 유발 실험을 위한 흰쥐의 실험군 분류는 크 게 세 군으로 이루어졌다. 먼저 마취 후 등쪽 피부를 절 개하였으나 난소는 적출하지 않고 봉합한 군(SHAM, SHAM 수술군)과, 절개술 후 난소를 적출한 군(OVX, 난 소적출군), 난소 적출 후 乳香黑虎丹 투여한 군(YHD, 乳 香黑虎丹군)으로 분류하였으며, 각 군별 실험동물의 숫자 는 8마리로 수행하였다.

4. 골다공증의 수술 및 검액 투여

실험에 사용한 흰쥐에게 각각 3.5%의 chloral hydrate (1 ml/100 g)를 복강주사 하였으며, 이렇게 마취시킨 흰 쥐의 등쪽 털을 제거, 절개를 위해 수술부위를 알콜로 소 독한 후 피부를 절개하여 양측 난소를 적출 한 후 다시 봉합하였다. 乳香黑虎丹의 투여량은 성인(60 kg)의 1일 복용량을 기준으로 흰쥐의 무게대비 복용량을 계산하여, 난소 적출 수술 2일 후부터 8주차까지 乳香黑虎丹이 혼합 된 흰쥐용 건조 사료를 경구 투여하였고, 동량의 건조사 료를 SHAM 수술군과 난소적출군에게 투여하였다.

5. 체중 측정

전자저울(Electronic balance, OHAUS Corporation, USA, Adventure-pro AVG812)을 사용하여 난소적출 직전 과 난소적출 후 매주 2회씩 총 8주간 측정하였다.

6. 대퇴골 무게와 경골의 회분 함량 측정

난소적출 수술 후 8주째 되는 날 실험동물을 희생시켜 경골과 대퇴골 을 양쪽 모두 적출하여 결합조직을 깨끗하 게 정리한 후 중량을 각각 측정하였으며, 회분함량 측정

Fig. 1. Effect of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) on body weight (g) in ovariectomized rats.

SHAM: Sham surgery group. OVX: administered with general animal feed for 8 weeks in ovariectomized rats. YHD: ad- ministered with animal feed contained Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) (0.3 g/100 g) for 8 weeks in ovariectom- ized rats.

Each data value represents the mean±S.E.M. of 8 animal.

**p＜0.01 compared with SHAM group.

을 위해 오른쪽 경골을 24시간 동안 900^oC 회화로(Elec- tric Muffle Furnare, JISICO, Korea, J-FM3)에서 완전히 회화시킨 후 충분히 식혀 ash의 무게를 측정하였다.

7. 조직염색 및 관찰

Neutral buffered formalin (NBF)에 왼쪽 대퇴골을 1일 간 고정한 후 over night 동안 수세하였다. 이후 에탄올 로 탈지하고 formic acid로 2주간 탈회한 후, 조직처리과 정을 거쳐 파라핀에 포매하였다. 조직은 4μm로 절편한 후 hematoxylin and eosin (H&E)으로 염색하여 광학현 미경(Olympus BX51, Japan)으로 40배와 100배 시야에서 관찰하였다.

광학현미경을 사용하여 H&E 염색한 조직을 40배로 capture 후 각 조직의 근위부에서 성장판의 직하 부분 중 가로변 길이가 성장판 길이의 2/3 정도 되는 길이로 하는 기준면적 0.43×10⁷μm²인 부분을 NIH image 1.62를 이 용하여 골소주의 면적과 두께와를 측정하였다. Osteo- blast의 차지 면적은 조직을 100배로 capture한 후 기준 면적 0.15×10⁷μm²의 면적에서 osteoblast가 차지하는 면적을 측정하였다. Osteoclast 수는 근위부에서 성장판 의 직하 부분 중 가로변의 길이가 성장판 길이 2/3 가량 되는 부근까지 200배 시야에서 개수를 측정하였다.

8. 채혈 및 혈액분석

난소적출 후 8주째 되는 날 마취한 흰쥐의 심장 우심 실에서 채혈을 진행한 후 10분간 2,000 rpm, 4^oC에서 원 심 분리하였다. Calcium, phosphrous, estradiol, alkaline phosphatase (ALP), total cholesterol, triglyceride, albu- min, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT)의 정량은 서울의과학 연구소(Yongsan-gu, Seoul, Korea)에 의뢰하였다.

9. 통계처리

측정값은 평균±표준오차(mean±S.E.M.)로 표기하였 다. 통계분석은 Graph Pad PRISM Software (Graphpad Software Inc, CA, USA) 프로그램을 이용하였다. One- way ANOVA를 이용하였으며 Dunnett's Multiple Com-

parison Test를 post hoc test로 분석하여, 유의수준 p value＜0.05 인 경우 유의성이 있다고 판단하였다.

결과»»»

1. 체중 변화

난소 적출 8주 후 평균체중 측정결과 난소적출군 및 乳香黑虎丹군은 SHAM 수술군에 비해 유의한 증가를 보 였다(p＜0.01). 그러나 난소적출군과 乳香黑虎丹군 간에 는 유의한 체중의 변화는 없었다(Fig. 1).

2. 대퇴골의 무게와 경골의 회분함량

체중대비 대퇴골의 무게는 SHAM 수술군에 비해 난소 적출군에서 유의하게(p＜0.05) 감소하였고, 乳香黑虎丹군 역시 SHAM 수술군에 비해 유의하게(p＜0.01) 감소하였 으나, 난소적출군과 乳香黑虎丹군 사이에는 유의한 차이 가 없었다(Table II).

체중대비 경골의 회분 함량은 SHAM 수술군에 비해 난 소적출군과 乳香黑虎丹군에서 유의하게(p＜0.01) 감소하 였으며 乳香黑虎丹군은 난소적출군과 유의한 차이는 보

Femur/body ratio (%) Tibia ash/body ratio (%)

SHAM 0.573±0.027 0.089±0.003

OVX 0.487±0.016* 0.075±0.003^†

YHD 0.482±0.012^† 0.073±0.002^†

SHAM: Sham surgery group. OVX: administered with general animal feed for 8 weeks in ovariectomized rats. YHD: ad- ministered with animal feed contained Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) (0.3 g/100 g) for 8 weeks in ovariectom- ized rats.

Each data value represents the mean±S.E.M. of 8 animal.

*p＜0.05, ^†p＜0.01 compared with SHAM group.

Table II. Effect of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) on Femur and Tibia Ash Weight per Body Ratio in Ovariec- tomized Rats

Trabecular thickness (μm)

Trabecular area (%)

SHAM 120.11±4.37 71.49±2.62

OVX 95.40±1.98* 55.68±0.50*

YHD 110.85±4.42^† 58.50±1.59**

SHAM: Sham surgery group. OVX: administered with general animal feed for 8 weeks in ovariectomized rats. YHD: ad- ministered with animal feed contained Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) (0.3 g/100 g) for 8 weeks in ovariectom- ized rats.*

Each data value represents the mean±S.E.M. of 8 animal.

*p＜0.01 compared with SHAM group. ^†p＜0.01 compared with OVX group.

Table III. Effect of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) on Trabecular Thickness and Trabecular Area (%) in Ovariec- tomized Rats

Fig. 2. Representative H & E stained sections of femoral neck in ovariectomized rats (Sections A and B, SHAM group; sec- tions C and D, OVX group; sections E, F, G and H, YHD group). Arrows indicate the osteoblast and arrowheads indicate the osteoclast. Magnification A, C, E: 100×, G: 200×, B, D, F, H: 1000×.

이지 않았다(Table II).

3. 골소주의 두께 및 면적

골소주 두께는 난소적출군이 SHAM 수술군에 비해 유 의하게(p＜0.01) 감소한 반면, 乳香黑虎丹군은 난소적출 군에 비해 유의하게(p＜0.01) 증가하였다(Table III).

골소주 면적은 난소적출군과 乳香黑虎丹군이 SHAM 수 술군에 비해 유의하게(p＜0.01) 감소하였으며, 乳香黑虎 丹군은 난소적출군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었 다(Table III).

4. Osteoblast와 osteoclast의 정량적 분석

Osteoblast가 차지하는 면적은 난소적출군이 SHAM 수

술군에 비해 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, 乳香黑虎 丹 투여군은 난소적출군에 비해 유의하게(p＜0.01) 감소 하였다(Fig. 3).

Osteoclast의 개수는 난소적출군이 SHAM 수술군에 비 해 유의하게(p＜0.05) 증가하였으며, 乳香黑虎丹군은 난 소적출군에 비해 유의하게(p＜0.01) 감소하였다(Fig. 3).

5. 혈액성분의 변화

Calcium은 난소적출군이 SHAM 수술군에 비해 유의하 게(p＜0.01) 감소하였으며, 乳香黑虎丹군은 난소적출군에 비해 유의하게(p＜0.05) 증가하였다(Table IV).

Fig. 3. Effect of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) extract on osteoblast (A) and osteoclast (B) in ovariectomized rats.

SHAM: Sham surgery group. OVX: administered with general animal feed for 8 weeks in ovariectomized rats. YHD: administered with animal feed contained Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) (0.3 g/100 g) for 8 weeks in ovariectomized rats.

Each data value represents the mean±S.E.M. of 8 animal.

*p＜0.05, **p＜0.01 compared with SHAM group. ^##p＜0.01 compared with OVX group.

SHAM OVX YHD

Osteoporotic parameters Calcium (mg/dL) 10.72±0.10 10.00±0.14^† 10.54±0.19^‡

Phosphorus (mg/dL) 6.64±0.43 5.67±0.50 6.46±0.37

Estradiol (pg/dL) 14.82±0.25 9.28±0.19^† 10.16±0.62^†

ALP (U/L) 167.80±29.79 179.71±16.87 157.75±15.99

Lipid parameters Total cholesterol (mg/dL) 80.50±3.48 108.29±7.03^† 117.63±3.89^† Triglyceride (mg/dL) 110.60±11.92 45.00±6.11^† 90.50±13.64^§

Liver parameters Albumin (g/dL) 4.24±0.17 3.63±0.06^† 3.99±0.06^§

AST (IU/L) 115.25±16.98 119.13±13.15 105.63±4.28

ALT(IU/L) 62.00±10.88 50.25±5.39 45.88±3.56

SHAM: Sham surgery group. OVX: administered with general animal feed for 8 weeks in ovariectomized rats. YHD: administered with animal feed contained Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) (0.3 g/100 g) for 8 weeks in ovariectomized rats.

Each data value represents the mean±S.E.M. of 8 animal.

*p＜0.05, ^†p＜0.01 compared with SHAM group. ^‡p＜0.05, ^§p＜0.01 compared with OVX group.

Table IV. Effects of Yoohyangheukho-dan (Rǔxiānghēihǔ-dān) on Serum Parameters in Ovariectomized Rats

Phosphorous는 난소적출군이 SHAM 수술군에 비해 다 소 감소하였으나 유의성은 없었고, 乳香黑虎丹군은 난소 적출군에 비해 다소 증가하였으나 역시 유의성은 없었다 (Table IV).

Estradiol은 난소적출군과 乳香黑虎丹군에서 SHAM 수 술군에 비해 유의하게(p＜0.01) 감소하였으며, 乳香黑虎 丹군은 난소적출군에 비해 다소 증가하는 경향을 보였으 나 유의성은 없었다(Table IV).

ALP는 난소적출군이 SHAM 수술군에 비해 다소 증가 하였으나 유의성은 없었으며, 乳香黑虎丹군은 난소적출군 에 비해 감소하는 경향을 보였으나 역시 유의성은 없었다 (Table IV).

Total cholesterol은 난소적출군과 乳香黑虎丹군에서 SHAM 수술군에 비해 유의하게(p＜0.01) 증가하였으나,

乳香黑虎丹군과 난소적출군간에 유의한 차이는 보이지 않았다(Table IV).

Triglyceride는 난소적출군이 SHAM 수술군에 비해 유 의하게(p＜0.01) 감소하였으며, 乳香黑虎丹군은 난소적출 군에 비해 유의하게(p＜0.01) 증가하였다(Table IV).

Albumin은 SHAM 수술군에 비해 난소적출군에서 유의 하게(p＜0.01) 감소한 반면, 乳香黑虎丹군은 난소적출군 에 비해 유의하게(p＜0.01) 증가하였다(Table IV).

AST는 SHAM 수술군에 비하여 난소적출군에서 감소하 였고, 乳香黑虎丹군은 난소적출군에 비해 다소 감소하였 으나 유의성은 없었다(Table IV).

ALT는 SHAM 수술군에 비해 난소적출군에서 다소 감 소하였고, 乳香黑虎丹군은 난소적출군에 비해 감소하였으 나 유의성은 없었다(Table IV).

고찰»»»

최근 심화되고 있는 고령인구의 증가는 장년, 노년층의 높은 골다공증 유병율을 야기하였으며⁴⁾ 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 중요한 보건학적 문제로 대두되고 있다.

인구 고령화 현상이 지속됨에 고령인구의 증가 현상 역시 지속될 것임이 예상되는 바, 현재의 골다공증 치료법을 보완할 수 있는 부작용이 적은 치료법과 효과적인 예방법 의 개발은 매우 중요하다고 할 수 있다.

한의학계에서는 골다공증과 관련된 기존의 병리들 중⁹⁾ 腎陰虛證, 腎陽虛證, 氣血兩虛證의 처방과 관련된 연구는 비교적 많이 진행 된 반면^10-14) 風邪偏勝證의 경우 동반되 는 증상으로 인해 빠른 치료개입이 가능함에도 불구하고 비교적 관련 연구가 이루어지지 않았다. 風邪偏勝證의 경 우 다른 병리들과 달리 뼈의 약화와 함께 종창, 유주성 관절동통, 관절의 굴신곤란과 같은 증상이 발현되어⁹⁾ 빠 른 치료개입이 가능하기 때문에 치료과정에서 단순한 치 료 효과뿐만 아니라 골다공증의 예방효과를 함께 얻을 수 있어 임상적으로 매우 큰 의미가 있다고 하겠다. 이에 風 邪偏勝證과 관련된 처방인 乳香黑虎丹의 골다공증 치료 및 예방효과를 알아보기 위해 본 연구를 진행하였다.

본 연구에서는 골다공증 모델을 만들기 위해 Saville¹⁶⁾ 모델을 이용하여 흰쥐의 난소를 적출하였으며, 이를 통해 estrogen을 결핍시켜 골다공증을 유발, 관련 실험을 진행 할 수 있었다.

본 실험의 지표들을 살펴보면, 먼저 체중의 경우 SHAM 군에 비하여 난소적출군과 乳香黑虎丹군에서 유의한 증 가가 있었다. 이는 난소절제수술 후 정상군과 체중 비교 를 시행한 기존의 연구^17-19)에서 정상군에 비해 난소절제 수술을 받은 군에서 체중이 유의하게 증가한 것과 동일한 결과로, 기존연구¹⁹⁾에서는 체중증가의 이유로 음식물 섭 취량 증가와 육체활동 감소, 그리고 체내 지방질의 축적 을 체중증가의 원인으로 보고하였다. 반면 난소적출군과 乳香黑虎丹군 사이에서는 유의성 있는 체중 변화를 보이 지 않아 乳香黑虎丹 투여가 체중증가에는 특별히 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

다음으로 본 실험에서 乳香黑虎丹이 골밀도와 뼈 속의 무기질 함량에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 체중 대비 대퇴골의 무게와 경골의 회분함량, 대퇴골의 골소주 의 두께와 면적, 그리고 osteoblast의 면적과 osteoclast의

개수를 측정하였다. 본 실험 결과 체중대비 대퇴골의 무 게와 경골의 회분함량은 난소적출군과 乳香黑虎丹군 사 이에서 유의성 있는 차이를 보이지 않았으며, 골소주의 두께는 SHAM 군에 비해 난소적출군에서 유의하게 감소 한 반면 乳香黑虎丹군에서는 난소적출군에 비해 유의하 게 증가하였다. 골소주의 면적은 난소적출군에서 유의하 게 감소한 반면, 乳香黑虎丹군에서는 난소적출군에 비해 소량 증가하였으나 유의성 있는 차이는 보이지 않았다.

Osteoblast의 면적과 osteoclast 개수 측정 결과를 살펴 보면, 난소적출군에서 유의성 있게 증가하였고, 乳香黑虎 丹군에서는 난소적출군과 비교하여 유의성 있게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 乳香黑虎丹의 투 여가 osteoclast의 골 흡수 작용을 억제하여 그 결과 골소 주의 두께 감소가 억제된 것으로 보인다. 또한 osteoblast 의 면적 측정 결과를 보면 난소적출군에서 SHAM 수술군 과 乳香黑虎丹군보다 높은 수치를 보이는 것을 알 수 있 는데, 이는 골흡수가 늘어날수록 골생성이 증가하여 체내 골량의 항상성을 유지하는 골재형성 과정의 일환으로²⁰⁾, osteoclast의 활성화와 골흡수를 보상하기 위해 보상 작용 으로 골생성이 증가하고 osteoblast가 보다 활성화 된 것 으로 보인다.

다음으로 乳香黑虎丹의 투여가 혈청학적으로 야기하는 변화를 확인하기 위해 혈액검사를 진행하여 각종 관련 지 표를 살펴보았으며, 그 중 먼저 골대사와 관련된 혈액지 표인 calcium, phosphorous와 estradiol 수치를 살펴보았 다. Calcium과 phosphorous는 인체 내에 존재하는 무기 질로, calcium은 체내에서 0.1%만이 세포외액에서 평형 상태를 유지하며, 나머지 99.9%는 뼈에 존재하는데, 악성 종양, 다발성골수종 등 골의 급격한 파괴를 일으키는 질 환에 이환되는 경우 골질파괴가 광범위하고 급속도로 일 어나 calcium이 뼈로부터 유리되어 高Ca 혈증을 초래하 기도 한다²¹⁾. 본 실험에서 혈중 phosphorous와 calcium 수치를 비교한 결과 phosphorous는 乳香黑虎丹군과 난 소적출군에서 유의한 차이가 없었으나 혈액 중 calcium의 농도는 난소적출군과 비교하여 乳香黑虎丹군에서 유의하 게 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 乳香黑虎 丹의 투여가 혈중 calcium 농도 감소를 억제하는 효과를 갖는다는 것을 알 수 있었다. 이는 乳香黑虎丹의 투여가 calcium의 농도를 감소되지 않도록 유지시킴으로써 골다 공증의 진행을 억제하는 것으로 해석되며, 앞서 살펴본

파골세포의 활성 억제를 통한 골흡수의 증가 억제 효과와 도 밀접한 연관이 있을 것으로 사료된다.

다음으로 乳香黑虎丹의 투여가 estrogen의 수치에 미 치는 영향을 살펴보기 위해 혈청 중 estradiol의 농도를 비교해 보았다. Estradiol은 estrogen 호르몬의 종류 중 하나로, 생물학적 활성이 가장 강하여 갱년기 증상과 혈 중 농도 사이에 아주 깊은 관계를 나타낼 뿐만 아니라 난 소 제거시 혈중 수치가 바로 감소하는 경향이 있어 실험 지표로 활용하기 용이하다²¹⁾. 본 실험 결과 난소적출군에 서는 SHAM 수술군에 비하여 estradiol의 농도가 유의성 있게 감소한 반면 乳香黑虎丹군에서는 난소적출군에 비 하여 estradiol의 농도가 증가하는 경향성을 나타내었다.

다음으로 골생성, 간담도계 질환과 관련된 지표인 ALP 수치변화를 살펴보았다. ALP는 임상적으로 의의가 큰 지 표로, 간담도계 질환, 골질환 등에서 증가하는 것을 관찰 할 수 있다. 골생성이 항진되어 있을 때는 그 수치가 증 가하는 반면 골파괴에 골신생이 동반되지 않을 때는 증가 하지 않으며, 간담도 질환의 경우 ALP의 증가와 함께 γ- GT, LAP 등의 증가를 수반한다. 대표적으로 골연화증, 골육종과 같은 골질환과 Virus성 간염, 간경변과 같은 간 질환에서 그 수치가 상승하는 것을 관찰할 수 있다²¹⁾. 본 실험에서 ALP 수치는 세 군간에 유의성 있는 차이는 나 타내지 않았으며, 乳香黑虎丹군에서 난소적출군에 비하여 다소 감소하는 경향을 보였으나 본 실험에서 실험군들의 표상성을 표현하는 혈액학적 지표로는 판단하기 어렵다 고 생각된다.

다음으로 乳香黑虎丹의 투여시 약물이 혈청내 지질상 승을 유발하는지 여부를 확인하기 위해 total cholesterol 과 triglyceride의 수치변화를 살펴보았다. 실험 결과 乳香 黑虎丹군은 난소적출군과 비교하여 total cholesterol의 수 치는 다소 증가하였으나 유의성은 없었으며, triglyceride 수치는 난소적출군에 비하여 유의하게 증가하는 경향을 나타내었다. 실험군의 경우 난소적출군에 비해 체중 증가 는 유의한 결과차이가 나타나지 않았는데, triglyceride 수 치는 유의하게 증가한 결과에 대하여는 추후 乳香黑虎丹 의 지질대사와 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

마지막으로, 乳香黑虎丹의 투여가 대사과정에서 간에 미치는 영향을 확인하기 위해 albumin, AST, ALT의 수치 변화를 살펴보았다. Albumin은 간에 의해 합성되어 순환

혈류로 분비되기 때문에 간기능 손상에 의해서 그 수치가 저하될 수 있으며²¹⁾, AST, ALT는 대표적으로 만성간염, 급성간염, 간경변 등의 간장애에서 수치가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 특히 ALT의 경우 AST에 비해 간세포 손 상 시 특이하게 상승하므로 간장애와 관련된 예민한 검사 로 활용할 수 있다²¹⁾. 본 실험결과 난소적출군에 비하여 실험군의 혈청중 albumin 수치는 유의하게 증가하였고, AST·ALT 수치는 난소적출군에 비하여 다소 감소하는 경향을 보였으나 유의성 있는 차이는 나타내지 않았다.

이상의 결과로 볼 때 乳香黑虎丹의 투여가 간기능에 유의 한 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

본 연구에서는 乳香黑虎丹의 골다공증 치료 효과를 살 펴보기 위한 모델로 Saville¹⁶⁾ 모델을 이용하여 실험을 진 행하였으며, 이상의 결과를 정리하면 난소 적출을 통해 골다공증을 유발한 흰쥐에게 乳香黑虎丹를 투여한 결과 osteoclast의 활성을 억제하여 골소주의 두께 감소를 억제 하였고, 혈중 calcium 수치의 감소를 억제하였으며, 장기 간 투여에도 간기능의 손상과 혈중 total cholesterol의 상 승은 유발되지 않았으므로 乳香黑虎丹은 골다공증을 개 선시키고 예방하는 효과가 있을 것으로 사료된다. 그러나 본 실험은 동물실험으로, 실제 임상에서 직접적으로 적용 되기에는 한계가 존재하는 바, 본 연구결과를 바탕으로 보다 구체적인 임상연구와 증례보고 등이 추가적으로 필 요할 것으로 생각된다. 이러한 추가 연구결과를 바탕으로 임상에서 乳香黑虎丹이 활용가능할 경우 歷節風 증상 완 화와 더불어 골다공증을 예방하는 효과 역시 얻을 수 있 으므로, 골다공증의 예방과 부작용 없는 치료로써 한방치 료가 보다 효과적으로 활용될 수 있다 하겠다.

결론»»»

난소 적출을 통해 골다공증이 유발된 흰쥐에게 乳香黑 虎丹의 투여가 미치는 영향을 알아보기 위해 대퇴골의 체 중대비 무게와 경골의 회분함량, 대퇴골 조직에서의 골소 주 두께와 면적, osteoclast와 osteoblast의 변화를 살펴보 았으며, 실험군의 혈액에서 calcium, phosphorous, estra- diol, ALP, total cholesterol, triglyceride, albumin, AST, ALT의 변화를 관찰하였다. 체중 변화를 관찰한 결과 乳 香黑虎丹군과 난소적출군 사이에 유의한 차이는 보이지

않았다. 뼈의 조직학적 변화를 관찰한 결과 乳香黑虎丹의 투여는 osteoclast의 활성을 억제하며 골소주의 두께 감소 를 억제하는 효과가 있었다. 혈액내 성분중 calcium 변화 를 관찰한 결과 乳香黑虎丹의 투여는 calcium의 감소를 억제하는 효과가 있었다. 혈액내 성분중 albumin, AST, ALT, total cholesterol의 변화를 관찰한 결과 乳香黑虎丹 의 투여는 간기능 손상과 혈중 지질 수치의 증가를 유발 하지 않았다. 이상의 결과를 통해 乳香黑虎丹의 투여는 약 투여로 인한 간기능의 손상이나 혈중 지질의 상승은 유발하지 않으며, 혈중 calcium의 감소를 억제해주고 os- teoclast의 활성을 억제함으로써 골소주의 두께 감소를 억 제하므로 여성의 폐경 후 발생하는 골다공증의 치료와 예 방에도 효과가 있을 것으로 생각된다.

참고문헌»»»

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