First record of the freshwater dinoflagellate Unruhdinium kevei (Dinophyceae) from Paldang Reservoir, Korea

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(1)Korean Journal of Microbiology (2021) Vol. 57, No. 3, pp. 204-209 DOI https://doi.org/10.7845/kjm.2021.1056 Copyright ⓒ 2021, The Microbiological Society of Korea. pISSN 0440-2413 eISSN 2383-9902. 팔당댐의 담수 와편모조류 Unruhdinium kevei (Dinophyceae)에 관한 미기록종 연구 김태희. ･ 기장서*. 상명대학교 생명과학과. First record of the freshwater dinoflagellate Unruhdinium kevei (Dinophyceae) from Paldang Reservoir, Korea Taehee Kim. and Jang-Seu Ki*. Department of Life Science, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea (Received July 23, 2021; Revised September 13, 2021; Accepted September 15, 2021). We described the freshwater dinoflagellate Unruhdinium kevei, collected from Paldang Reservoir, Korea, on September 23, 2020. Overall cell shape was almost rhombic. Cell size was 37 µm in length (33–44 µm) and 31 µm in width (26–39 µm). The surface of the cells was smooth or reticulated. Plate formula of each morphotypes was determined to 3', 1a, 6'', 5''', and 2''''. In addition, one conical spine on hypotheca was observed at plate 1''''. The 18S rDNA sequences of Korean U. kevei were well-matched to the Japanese Unruhdinium cf. kevei (> 99.9% DNA similarity); however, it was not compared to U. kevei, due to be not available data for the species. These morphological and molecular results represented that our dinoflagellate was clearly U. kevei, and it was recorded for the first time in Korean freshwaters. Keywords: Unruhdinium kevei, freshwater dinoflagellate, morphology, Paldang Reservoir, 18S rDNA. 이 문헌적으로 보고되어 있으며, 담수에는 약 350여 종으로 해 양에 비해 보고된 종 수가 매우 적다(Guiry and Guiry, 2021). 또한, 해양에서의 와편모조류는 규조류와 함께 우점하지만, 담수에서는 다른 식물플랑크톤에 비해 적은 양이 출현하는 것 으로 알려져 있으며, 이러한 서식 환경에 따른 분류군 간의 우 점 비율 차이로 인해 다양성의 차이도 발생한다(Weithoff and Beisner, 2019). 와편모조류는 세포를 덮는 각의 유무에 따라 유각(armoured) 및 무각(unarmoured) 와편모조류로 구분된다. 유각 와편모조 류인 Peridinium 속과 무각 와편모조류인 Gymnodinium 속은 담수 생태계에 분포하는 대표적인 와편모조류 종으로 각의 유 무는 이들 종을 동정하기 위한 형태학적 특징으로 사용된다. 유각 와편모조류의 경우, 각판의 배열 구조인 Kofoidian plate fourmula가 종을 동정하는 중요한 형태적 특징이다(Gottschling et al., 2017). 따라서 Kofoidian plate fourmula는 와편모조류의 형태학적 분류에 중요한 기준으로 사용된다. 담수 와편모조류. 식물플랑크톤은 규조류, 남조류, 녹조류, 와편모조류와 같 은 다양한 분류군을 포함하며, 수생태계 내 1차 생산자로써 중 요한 역할을 한다. 이 생물들은 해양과 담수에 널리 서식하며, 환경에 따라 출현 분류군이 다른 양상을 보인다(Weithoff and Beisner, 2019). 그 중에서도 현재 와편모조류는 약 2,000여 종 *For correspondence. E-mail: [email protected]; Tel.: +82-2-2287-5449; Fax: +82-2-2287-0070. Unruhdinium 속은 규조류를 3차 내공생체(endosymbiont)로 가지고 있으며, 상각을 이루는 각판의 수가 10개 이하인 점 을 이유로 와편모조류 Peridiniopsis 속으로부터 분리되었다 (Gottschling et al., 2017; Kretschmann et al., 2018). 하지만 Unruhdinium을 포함한 와편모조류 속 내의 종들은 서로 동일 한 Kofoidian plate fourmula를 가지는 경우가 많아, 각각의 종을 정확히 동정하기 위해 추가적인 형태적 특징을 분석해 야 한다. 또한, 최근에는 분자생물학의 발달을 통해 형태가.

(2) First record of Unruhdinium kevei from Korea ∙. 205. 아닌 종이 가진 고유한 염기서열을 이용한 분자적 동정이 가 능 해졌다. 일부 담수 와편모조류는 배양이 어려워 동정을 위 해 single-cell PCR 또는 유전자 클로닝과 같은 기술이 적용되 고 있다(Ebenezer et al., 2012; Kim et al., 2020). 이렇듯 담수 와편모조류의 형태 및 분자생물학 기반의 분류학적 연구는 다 각도의 접근을 필요로 하고 있다. 한국의 담수 와편모조류에 대한 연구는 1960년대 한강에서 Ceratium hirundinella를 보고하는 것으로 시작되었다(Chung et al., 1968). 이 후 현재까지 약 21종의 담수 와편모조류가 보 고되었으나(National species list of Korea, 2020), 대부분의 종 들이 정확한 분류학적 기재가 없으며, 생태조사 과정에서의 단순한 출현 정보에 대한 기록에 한정된다. 2000년 대 이후 미 기록종에 대한 분류학적 기재가 활발해지기 시작하였으나, 와 편모조류 Peridinium 속과 관련된 종으로 한정되어 있으며(Ki and Han, 2005, 2008), 이들 중 Apocalathium aciculiferum과 Parvodinium umbonatum의 경우 분자적 동정이 같이 이루어 지지 않아 추가적인 연구를 필요로 한다. 한국에는 다수의 미기록 담수 와편모조류 종이 존재할 것으 로 사료된다. 최근 한강에서 다양한 종의 와편모조류 휴면포자 (cyst)의 보고와 함께 Tovellia paldangensis와 같은 신종의 발. Fig. 1. A map of Paldang Reservoir, Korea. The black circle represents the sampling site.. 표가 이루어져, 담수 와편모조류의 다양성이 알려진 것보다 높을 수 있다(Li et al., 2015a, 2015b). 최근의 Unruhdinium. -20°C에 DNA 추출 전까지 보관하였다.. penardii var. robustum 미기록종 연구는 환경에 존재하는 종. 미동정 와편모조류의 형태학적 동정을 위해 루골 용액으로. 을 유전자 클로닝을 통해 분자적으로 동정하여, 난배양성 종. 고정한 세포를 광학 현미경(Axioskop; Zeiss)을 사용하여 400. 의 출현을 정확히 보고하였다(Kim et al., 2020). 또한, 한강 메. 배에서 관찰하였다. 또한, Calcofluor White M2R (Sigma. 타게놈 연구에서 다수의 와편모조류가 동시에 출현하고 있음. Aldrich)을 루골 용액으로 고정한 세포에 20 µl 떨어뜨려 와편. 이 확인되었으나 속의 동정만이 이루어져, 이들에 대한 추가. 모조류의 각을 1분간 염색하였고, 형광 현미경으로 관찰하여. 적인 분류학적 연구의 필요성이 제기되었다(Boopathi and Ki,. Kofoidian plate formula를 결정하였다(Fritz and Triemer, 1985).. 2015; Muhammad et al., 2021).. 광학 현미경 사진을 ProgRes® CF scan CCD camera로 촬영하. 본 연구는 2020년 가을 한강 팔당댐에 출현하는 미동정 와 편모조류의 형태적 특징을 관찰하였으며, 기존에 출현하던 와. 여, ProgRes® CapturePro 2.10.0.1 software (Jenoptik)로 이미 지를 분석하였다.. 편모조류와 비교하였다. 또한, 이들의 18S rDNA 염기서열을. 미동정 와편모조류의 분자생물학적 동정은 이들이 출현한. 규명하여 기존에 보고된 담수 와편모조류들 간의 유전적 특성. 시기에 채집한 환경 DNA (eDNA)를 이용하여 실시하였다. 선. 을 파악하였다.. 행 연구에서 사용한 방법을 이용하여 eDNA를 추출하였다. 본 연구를 위해 2020년 9월 23일 한강 팔당댐에서 표층수를. (Faria et al., 2014). eDNA로부터 형태가 확인된 미동정 와편. 채집하였다(Fig. 1). 형태학적 분석을 위하여 채집된 시료를. 모조류의 18S rDNA 서열만을 얻기 위하여, 근연 와편모조류. 루골 용액으로 최종농도 1%가 되도록 고정하였다. 또한, 환경. Peridinium bipes, Unruhdinium penardii var. robustum 등과. DNA 분석을 위해서 300 ml의 표층수를 10 µm 멤브레인 필터. 같은 한강에 출현하는 종과 비교하여 와편모조류 U. kevei. (Cat. No. TCTP04700, 47 mm diameter, Millipore)로 거른 뒤,. 에 특이적인 프라이머를 개발하였다(정방향: Uk-18F250, 5'-. 800 µl의 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 완충 용. AACGAACGAATTGCACAGCC-3'; 역방향: Uk-18R1703,. 액(100 mM Tris-HCl, 100 mM Na2-EDTA, 100 mM sodium. 5'-CTAGACTTTCCACGGCATG-3').. phosphate, 1.5 M NaCl, 1% CTAB)이 담긴 2 ml 튜브에 넣어. 효소 중합 연쇄반응(PCR)은 3차 증류수 11.8 µl, 10× Ex Korean Journal of Microbiology, Vol. 57, No. 3.

(3) 206. ∙ Kim and Ki. PCR buffer (TaKaRa) 2 µl, dNTP mix 2 µl, 각 프라이머(500. 분자계통분석을 위해 본 연구에서 얻은 미동정 와편모조. nM), Ex Taq polymerase 0.2 µl (2.5 U), DNA 샘플 2 µl의 조성. 류의 염기서열과 NCBI를 통해 수집된 염기서열을 MAFFT를. 으로 총 20 µl를 혼합하여 진행하였다. PCR 반응은 Bio-Rad. 통해 재배열하였다(Kuraku et al., 2013). 재배열한 염기서열. iCycler (Bio-Rad)를 이용하여 초기 94°C 3분간 DNA를 변성. 의 일부를 Gblocks을 이용해 제거하여 서열의 길이를 동일하. 한 뒤, 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 60초를 35회 반복하여 대. 게 조정하였다(Castresana, 2000). Maximum likelihood (ML). 상 유전자 영역을 증폭하였다. PCR 증폭 반응이 종료되면 추. 계통도는 총 28개의 18S rDNA 염기서열(1,169 bp)로 이루어. 가로 72°C를 10분간 유지하여 반응을 종결하였다. 증폭된. 진 데이터 조합을 이용하여 MEGA X에서 GTR nucleotide. PCR 산물은 Midori Green으로 염색한 1% 아가로스 겔에서. substitution model을 통해 추정하였다(Kumar et al., 2018).. 전기영동 하여 확인하였다. 이후, 미동정 와편모조류의 염기 TM. 그 결과, 본 연구는 한국 팔당댐에 출현하는 와편모조류. TA kit (Enzynomics)를. Unruhdinium kevei를 형태학적, 분자계통학적으로 확인하였. 이용하여 PCR 산물을 클로닝하였다. 획득한 클론의 DNA. 다. 본 연구에서 관찰된 U. kevei의 세포 길이와 너비의 비율은. 서열만을 분리하기 위해 TOPcloner. sequencing은 Bionics사에 의뢰하였다. 구체적으로 PCR 프라. 1.19로 조사되었으며, 배면에서 보았을 때 길쭉한 마름모꼴. 이머와 ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing. 모양이었다(Fig. 2). 세포를 측면에서 보면 상각의 배면이 약. Ready Reaction kit (PE Biosystems)를 이용하여 분석하였다.. 간 오목하여 등배축으로 세포가 압축된 형태였다(Fig. 2B). 또. DNA sequencing 단편은 자동 DNA 분석기(Model 3700,. 한 상각이 하각보다 긴 길이를 갖고 있었다. 본 연구에서 관찰. Applied Biosystems)로 분석하였다. 각각의 시료로부터 얻은. 한 U. kevei는 기존에 팔당댐에 출현하던 Unruhdinium penardii. 염기서열 단편은 Sequencher 4.1.4 (Gene Codes)을 이용하여. var. robustum과 비교할 때 다른 형태를 가져 U. kevei 가 새로. 조합된 단일 염기서열로 만들었다. 이후 NCBI (National Center. 이 확인된 미기록종임을 보여주었다(Table 1). Unruhdinium. for Biotechnology Information)의 BLAST search를 통해 획득. kevei는 출현지역에 따라 형태에 차이가 있는데, 헝가리에서. 한 염기서열의 분류학적 특성을 파악하였다.. 발견된 U. kevei의 경우 각의 표면에 망상 무늬가 존재하였지. (A). (B). (C). (D). (E). (F). Fig. 2. Light (A), Epifluorescence micrographs (B–F) of the Korean Unruhdinium kevei collected from Paldang Reservoir. (A) Entire cell shape, (B) cell shape in lateral view, (C) morphotype has reticulated plate surface, (D) epitheca and hypotheca in ventral view, (E) epitheca in dorsal view, and (F) hypotheca in dorsal view. Red arrow heads represent hypothecal a spine. Scale bar = 10 µm.. 미생물학회지 제57권 제3호.

(4) First record of Unruhdinium kevei from Korea ∙. 207. Table 1. Morphological comparison of the two Korean Unruhdinium species Unruhdinium kevei a. Unruhdinium penardii var. robustum b. Length (µm). 37 (33–44). 31 (23–39). Width (µm). 31 (26–39). 29 (23–38). L/W (average) Cell shape Apical spine number. 1.19. 1.06. almost rhombic. pentagonal to rhombic. absent. 2. Hypothecal spine number. 1. more than 6. Hypothecal spine location. plates 1''''. plates 1'''' and 2''''. smooth or reticulated. smooth. Plate ornamentation a. Present study, b Kim et al. (2020).. Fig. 3. A ML tree of Unruhdinium kevei 18S rDNA with other freshwater dinoflagellates. Unruhdinium is marked in a color box. Our species and their GenBank Nos. are given in bold.. 만, 일본에서 보고된 U. kevei의 경우는 매끄러운 표면을 가져. 한국산 U. kevei의 Kofoidian plate fourmula는 3', 1a, 6'', 5''',. 해당 종을 Unruhdinium cf. kevei로 구분하였다(Grigorszky et. 2''''로 조사되었으며, 기존에 헝가리와 일본에서 보고된 U.. al., 2001; Takano et al., 2008). 한국 팔당댐에 출현하는 U.. kevei와 일치하였다(Grigorszky et al., 2001; Takano et al.,. kevei의 경우 두 가지 타입이 동시에 출현하는 것으로 확인되. 2008). 다른 Peridiniales와 달리 Unruhdinum 속은 상각을 구. 었으며, 향후 이들 형태학적 타입 간의 생태학적 차이 및 분포. 성하는 각판의 수가 줄어드는 방향으로 진화하였으며, 이로 인. 에 관한 연구가 필요하다.. 해 1개 이하의 intercalary plate (= 1a)를 가지는 것이 특징이다 Korean Journal of Microbiology, Vol. 57, No. 3.

(5) 208. ∙ Kim and Ki. (Kretschmann et al., 2018). 한국산 U. kevei의 intercalary plate. 담수 와편모조류인 Unruhdinium kevei를 기술하였다. 전체적. 는 마름모 꼴 모양이며, plate 2', 3', 3'', 4''과 맞닿아 있었다(Fig.. 인 세포의 모양은 마름모꼴이었다. 세포의 길이는 37 µm. 2E). 또한 하각에 위치한 plate 1''''에 한 개의 원뿔형 가시가 존. (33~44 µm) 이였고, 너비는 31 µm (26~39 µm) 이였다. 형태학. 재하였다. Unruhdinium 속의 종 동정에 있어 세포 표면에 돋아. 적으로 세포 표면에 망상 무늬가 존재하는 헝가리에서 보고된. 난 가시의 위치와 숫자는 중요한 형태학적 특징으로 사용된다. 종과 세포 표면이 매끄러운 일본에서 보고된 종이 동시에 출. (Gottschling et al., 2017). 기존에 한강에 출현하는 Unruhdinium. 현함을 확인하였다. 두 가지 형태 타입 모두 각판 배열은 3', 1a,. penardii 종과 새로이 관찰된 미기록 와편모조류를 비교할 때. 6'', 5''', 2''''로 결정되었다. 추가적으로 한개의 원뿔형의 가시. 가시의 숫자와 위치에 큰 차이를 보였으며, 이들의 형태적 특. 가 각판 1''''에 위치함을 확인하였다. 한국산 U. kevei는 일본에. 징은 본 연구에서 관찰한 종이 U. kevei라는 것을 명확하게 제. 서 보고된 Unruhdinium cf. kevei 18S rDNA 염기서열과 >. 시하였다(Table 1).. 99.9%의 높은 유사도를 보였다. 이러한 형태학적, 분자적 분. 분류학적 마커를 이용한 유전자 클로닝을 통해 환경에 존. 석 결과는 팔당댐에 새로이 출현한 미동정 와편모조류가 U.. 재하는 U. kevei의 18S rDNA 염기서열(1,434 bp) 4개를 확보. kevei임을 명확히 제시하였으며, 이는 국내 담수에서의 최초. 하였다(GenBank No. MZ540858-MZ540861). 이들 18S rDNA. 기록이다.. 염기서열은 거의 동일하였으며(0.01% 차이), BLAST search 결과 일본에서 보고된 Unruhdinium cf. kevei (AB353770)와 99.9%에서 100% 유사도를 보였다. 앞서 설명한바와 같이 U. kevei는 형태학적으로 두가지 타입이 존재하나, 헝가리에서의 신종 보고에선 분자적 염기서열 분석이 이루어지지 않아, 일 본에서 보고된 18S rDNA 서열만이 NCBI에 등록되어 있다. 따라서 본 연구에서는 한국산 U. kevei와 일본산 Unruhdinium. Acknowledgments 본 연구의 현장시료 채집에 협조해 주신 경기도팔당수질개 선본부 관계자 분들과, 심사과정에서 세심한 조언을 해 주신 익명의 심사자 분께 감사드립니다.. cf. kevei를 대상으로 분자계통분석을 실시하였으며, 이들이 같은 분기군을 형성하였다(Fig. 3). 또한 이들 분기군은 다른 Unruhdinium 종 들과는 뚜렷이 분리되었다(99 bootstrap value). 따라서 한국산 U. kevei는 계통학적으로 일본의 종과 동일한 것으로 파악되었다. 그러나 본 연구에서 사용한 유전자 클로. Conflict of Interest The authors have no conflict of interest to report.. 닝 방법으로 한국 팔당댐에 출현한 헝가리와 동일한 타입의 종 또한 일본의 종과 계통학적으로 동일한 종인지는 판단할 수 없었다. 따라서, 이들의 차이를 규명하기 위해 추후 각각의 타입을 분리 배양하여 이들 간의 유전학적 차이에 대한 연구 가 필요하다. 결론적으로 본 연구는 한강에 출현한 미동정 와편모조류의 형태 및 분자생물학적 특징을 분석하여 해당 종을 U. kevei로 동정하였다. 형태학적으로 헝가리와 일본 타입의 U. kevei가 한강 팔당댐에 동시에 출현하였으며, 분자계통학적으로 일본 의 타입과 동일함을 확인하였다. 이러한 U. kevei 출현은 한국 담수 생태계에서 처음으로 기록된 것으로, 이들의 분류학적 특징을 보고하였다.. 적 요 본 연구는 2020년 9월 23일 한국 팔당댐으로부터 채집한 미생물학회지 제57권 제3호. References Boopathi T and Ki JS. 2015. Unresolved diversity and monthly dynamics of eukaryotic phytoplankton in a temperate freshwater reservoir explored by pyrosequencing. Mar. Freshw. Res. 67, 1680–1691. Castresana J. 2000. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Mol. Biol. Evol. 17, 540–552. Chung YH, Kay ES, and Park DW. 1968. A study on the microflora of the Han River (II). Korean J. Bot. 11, 1–30. Ebenezer V, Medlin LK, and Ki JS. 2012. Molecular detection, quantification, and diversity evaluation of microalgae. Mar. Biotechnol. 14, 129–142. Faria DG, Lee MD, Lee JB, Lee J, Chang M, Youn SH, Suh YS, and Ki JS. 2014. Molecular diversity of phytoplankton in the East China Sea around Jeju Island (Korea), unraveled by pyrosequencing. J. Oceanogr. 70, 11–23. Fritz L and Triemer RE. 1985. A rapid simple technique utilizing.

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