대 한 류 마 티 스 학 회 지
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원 저
□ Vol. 12, No. 1, March, 2005― 26 ― ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
＜접수일：2004년 8월 16일, 심사통과일：2004년 12월 8일＞
※통신저자：송 관 규
서울시 구로구 구로동길 97번지 고려대학교 부속 구로병원 류마티스내과
Tel：02) 818-6667, Fax：02) 866-1643, E-mail：[email protected]
전신성 홍반성 루푸스 환자에서의 STAT-6 유전자 다형성에 관한 연구
고려대학교 의과대학 류마티스내과학교실
노영희․김효진․최성재․지종대․이영호․송관규
= Abstract =
Polymorphisms in the STAT-6 Gene and SLE
Young Hee Rho, M.D., Hyo Jin Kim, M.D., Seong Jae Choi, M.D., Jong Dae Ji, M.D., Young Ho Lee, M.D., Gwan Gyu Song, M.D.
Division of Rheumatology, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea
Objectives: To investigate whether the new polymorphism at position 2964 (G/A) in the 3' untranslated region of the STAT-6 gene is associated with susceptibility to systemic lupus erythematosus (SLE) and its clinical features.
Methods: A polymerase chain reaction of genomic DNA-restriction fragment length polymor- phism was used to determine genotypes of the STAT-6 in 90 SLE patients and 148 healthy controls. Clinical and serological manifestations were analyzed in each patient and correlated with the genotypes.
Results: The genotype distribution of the STAT-6 differed significantly between SLE patients and control subjects (AA, AG, GG genotypes 7, 74, 9 vs. 1, 119, 28 controls respectively, p=
0.003). The frequency of AA genotype (7.8%) is significantly increased in SLE patients compared with controls (0.7%)(OR=12.398, 95% CI 1.50∼102.5, Fisher’s exact test, p=0.005). Clinically in the lupus patients according to the STAT-6 genotypes, there was no significant difference in age at onset, anti-ds-DNA titer, C3, C4 level, SLEDAI, SLICC/ACR Damage Index, or auto- antibodies such as RF, anti-Ro, La, RNP, Sm antibodies, except for renal involvement. The frequency of lupus nephritis was significantly higher in the AA genotype in comparison with GG genotype (Fisher’s exact test, p=0.019).
― 노영희 외 : 전신성 홍반성 루푸스 환자에서의 STAT-6 유전자 다형성에 관한 연구 ―
― 27 ― 서 론
전신성 홍반성 루푸스(SLE)는 원인 불명의 만성 자가면역 질환으로 신체의 여러 장기를 침범해 면역 학적인 손상을 초래한다. 전신성 홍반성 루푸스의 발병기전에 Th1/Th2 면역반응의 불균형이 관여하는 것으로 알려져 있다1,2).
STAT-6 (Signal Transducer and Activator of Tran- scription)는 12q13 염색체에 위치한 유전자로 STAT- 6의 단백질은 세포 내 신호전달 물질의 하나로서 IL-4 및 IL-13에 의한 신호를 전달하여 그 작용을 발 현시키는 것으로 알려져 있다3,4). IL-4는 Th2 면역과 관련이 있는 cytokine으로서 호산구 생성의 증가나 아토피 등 알레르기성 질환의 증상을 매개하는 것으 로 알려져 있다5). 최근 3'UTR (Untranslated Region) 의 2964번 위치의 G/A 유전자 다형성이 알려졌고6) 이 STAT-6 유전자 다형성이 STAT-6 기능에 영향을 미치는지는 알 수 없으나 3'UTR region의 유전자 다 형성은 mRNA의 안정성에 영향을 끼쳐 단백질 형성 에 영향을 줄 수 있어 기능적인 연관 관계가 추정된 다. 최근에는 이 STAT-6 유전자 다형성이 알레르기 의 발생과 연관이 있다는 보고가 있었으나7,8) 아직 전신성 홍반성 루푸스에서는 아직 연구된 바가 없었 다. 이에 저자들은 STAT-6의 3'UTR의 2964번 위치 의 G/A 유전자 다형성과 전신성 홍반성 루푸스과의 연관을 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
본 연구는 환자-대조군 연구로서 고려대학교 부속 구로병원에 내원한 90명의 루푸스 환자(남자 4명, 여자 86명, 남자 평균 연령 34.6±11.9세, 여자 평균 연령 45.3±15.3세, 연령범위 16∼62세)와 148명의 정상 대조군(남자 29명, 여자 119명, 연령범위 16∼
76세)을 대상으로 연구를 하였다. 루푸스의 진단은
1997년 개정된 미국 류마티스학회(ACR) 루푸스의 진 단 기준으로 진단하였으며 루푸스 신염은 루푸스 진 단 기준상 신장 침범의 소견이 있거나 생검상 병리 적인 소견이 합당한 경우로 정의하였다. 각각의 말초 혈액을 채취하여 DNA를 분리한 다음, STAT-6 유전 자의 3'UTR (Untranslated Region)의 position 2964에서 의 G/A transition polymorphism을 중합효소 연쇄반응- 제한효소 절편 다형증(PCR-RFLP, Restriction Frag- ment Length Polymorphism)기법을 통하여 분석하였으 며 구체적인 방법은 Amoli 등이 제시한 방법6)을 따 랐다. PCR 분석에 쓰인 primer sequence는 Forward 5'- GAA GTT CAG GCT CTG AGA GAC-3', Backward 5'-CCA TCA CCC TCA GAG AGC-3'이었으며 중합 효소 연쇄반응의 과정은 100 ng의 genomic DNA, 10 KCL buffer, 3.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 5 pmol 의 primer 및 1 unit의 Taq DNA polymerase 그리고 4 mM의 betaine을 함유한 25μL의 용액으로 시행했다.
DNA는 95oC에서 3분간 변성과정을 거쳤으며 반응 온도는 95oC에서 45초간, 55oC에서 45초간, 72oC에서 45초간 40회를 시행했으며 마지막으로 72oC에서 2 분간 시행하였다. 제한효소 소화는 4 U의 제한효소 BsaHI 및 7μL의 중합효소 연쇄반응의 산물을 가진 15μL의 용액에서 시행되었다. 반응은 파라핀유로 도 포된 뒤 37oC에서 하룻밤 incubation 되었다. 소화된 산물들은 ethidium bromide로 염색한 뒤 4%의 agarose Conclusion: Our data show that the STAT-6 AA genotype may contribute to susceptibility to SLE and may be associated with development of lupus nephritis.
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Fig. 1. G/A polymorphism at position 2964 in the 3' Un- translated Region of STAT6 by PCR-RFLP analy- sis. The genotypes AA (93 bp), GA (93, 74 bp), and GG (74 bp) are shown (M : DNA size marker, upper 200 bp, lower 100 bp).
M AA GG GA
93 bp 74 bp
― 대한류마티스학회지 제 12 권 제 1 호 2005 ―
― 28 ― gel에서 관찰하였다. AA 유전형은 93 bp의 단일 띠 를 보였으며 GG형은 74 bp 및 19 bp로 이루어진 두 개의 띠를 보였다(그림 1, 19 bp의 띠는 primer 크기 와 비슷하여 잘 관찰되지 않음). STAT-6 유전자의 AA형, AG형, GG형의 빈도를 루푸스/대조군, 그리고 임상 집단(인구 통계학적인 분류, 루푸스 진단 기준 각각을 따로 분류, 자가 면역 항체의 보유 유무 등) 별도로 카이제곱 검정을 통하여 비교하였다.
결 과
루푸스와 대조군의 STAT-6 유전자의 유전형(AA, AG, GG)의 빈도는 유의한 분포의 차이를 보였으며 (표 1, p=0.003) AA형의 빈도가 루푸스군(7.8%)에서 대조군(0.7%)에 비해 유의하게 높았다(p=0.005, OR=
12.398, 95%CI (1.50∼102.5)).
임상 양상 분석에서는 루푸스 신염이 있는 군과 없는 군에서의 유전형의 빈도가 유의한 차이를 보였 다(표 2, p=0.022). 루푸스 신염에서 GG형은 발견되 지 않았고 유전형 간 빈도 분석에서 AA형이 유의하 게 높은 빈도를 보였다(표 2, p=0.019). 그러나 다른 임상 부집단(subgroup: anti-ds-DNA 역가, C3/C4 수 준, SLEDAI, SLICC damage index, 기타 자가항체의 유무)들에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다.
고 찰
STAT-6 (Signal Transducer and Activator of Tran- scription)이 발견된 이후 이 유전자 및 그 생성 단백 질이 IL-4의 신호전달과 관련하며 따라서 Th2 면역
에 관여할 것으로 알려졌다. 동물 모델의 실험에서 는 STAT-6 knock-out NZMxNZW mice에서 루푸스 신염의 발생률 및 활성을 줄인다는 보고9)는 루푸스 에서 STAT-6의 역할을 시사한다. 루푸스는 Th2 면 역의 이상 항진과 관련이 있을 것으로 여겨진다1,2). 아직까지 STAT-6의 유전적 다형성의 기능이 시험관 내(in vitro)나 생체 내(in vivo)를 통한 실험에서 밝혀 져 있지 않다. 그러므로, STAT-6의 유전적 다형성이 면역 신호의 전달에 있어 어떤 역할을 할 것인지에 대해서는 연구가 필요하다. STAT-6는 루푸스 감수 성의 linkage 부위인 염색체 12q에 위치하고 있고10), 3'UTR 부분의 유전자 다형성은 mRNA의 안전성에 영향을 끼쳐 단백질의 생성과 관계가 있을 수 있으 므로 서로 연관성이 있을 개연성이 있다. 본 연구는 STAT-6 유전자의 다형성과 루푸스와의 연관에 대한 최초의 연구로서 본 연구에서 STAT-6 유전자 다형 성은 루푸스와 루푸스 신염과 연관을 보여 이는 STAT-6 유전자가 루푸스와 루푸스 신염의 발생기전 에 관여할 가능성을 시사하는 것으로 생각된다.
본 연구에서 대조군이 Hardy-Weinberg 균형을 만 족시키지 못하였는데, Hardy-Weinberg 균형이 만족되 기 위해서는 대규모의 집단이며 무작위 교배가 되어 야 하고, 군집 간의 이동, 또는 새로운 변이의 출현 이 없어야 하며, Hardy-Weinberg 균형을 만족 못 시 킨다면 이는 상기의 조건에 하나 이상 위배되는 경 우이거나 유전자 다형성 검사의 오류 가능성이 있을 수 있다. 본 연구에서는 대조군의 유전자 분포가 Hardy-Weinberg 균형에 일치하지 않는지 정확한 이 유는 알 수 없지만 대상수가 크지 않은 경우 Hardy- Weinberg 균형을 만족시키지 않을 수 있을 가능성도 있다. 이 STAT-6 유전자 다형성은 한국인에서 그리 Table 1. Frequency of STAT-6 genotypes between SLE
and control groups
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Genotype Control SLE
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AG 119 (80.4%) 74 (82.2%) GG 28 (18.9%) 9 (10.0%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Total 148 (100%) 90 (100%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Fisher's exact test, p=0.003, *: p=0.005, OR=12.398 (95%
CI (1.50∼102.5)).
Table 2. Frequency of STAT-6 genotypes between nephri- tis and non-nephritis groups
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Genotype Without nephritis With nephritis ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ AA 3 (4.8%) 4 (14.3%)*
AG 50 (80.6%) 24 (85.7%) GG 9 (14.5%) 0 (0.0%)*
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Total 62 (100.0%) 28 (100.0%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Fisher's exact test, p=0.022, *: p=0.019.
― 노영희 외 : 전신성 홍반성 루푸스 환자에서의 STAT-6 유전자 다형성에 관한 연구 ―
― 29 ― 고 아시아인에서는 처음으로 연구되어 비교 자료가 없으므로 앞으로 더 많은 연구가 요구된다. 본 연구 에서 유전자 다형성 검사의 오류는 없는 것으로 여 겨진다. 유전자 다형성 검사에서 A allele (93 bp)은 제한효소에 의한 소화가 안되고 G allele은 소화가 되어 74 bp와 19 bp로 되는데, 만약 제한효소 소화 가 불완전해서 잘 안되었다면 A에서 G allele로 소 화가 안 되어 AA 유전형이 더 많이 나타나야 되나 본 연구결과에서는 반대로 소화된 GG 유전형이 기 대 빈도보다 높고 소화가 안 되어서 나타나는 AA 유전형은 적었다. 따라서 불완전한 제한효소 소화로 인한 유전자 다형성 오류 가능성은 없는 것으로 여 겨진다.
결 론
본 연구는 STAT-6의 3'UTR의 2964번 위치에서의 G/A 유전자 다형성이 루푸스와 루푸스 신염과 연관 이 있음을 보였다. 아직 STAT-6 유전자 다형성의 기능은 명확히 밝혀져 있지 않지만 본 연구를 통해 STAT-6 유전자가 루푸스와 루푸스 신염의 발병기전 에 관여할 가능성을 시사하여 향후 STAT-6와 루푸 스와 루푸스 신염에서 연구가 요구된다.
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