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Changes of Physiological Activity by Drying Temperature in Leaf of Eriobotrya japonica

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40(3) : 178 183 (2009)

178

건조온도에 따른 비파 잎의 생리활성 변화

엄효진·김선민·표병식·이경인

*

동신대학교한약재산업학과

Changes of Physiological Activity by Drying Temperature in Leaf of Eriobotrya japonica

Hyo-Jin Eom, Sun-Min Kim, Byoung-Sik Pyo and Kyoung-In Lee

*

Dept. of Oriental Medicine Materials, Dongshin University, Naju, Jeonnam, 520-714, Korea

Abstract −

In DPPH radical and nitric oxide scavenging ability, the extract of lowest temperature condition(40-15H ; 15 hours at 40

o

C for drying) exhibited highest activity. The total phenolic and flavonoid contents of each extracts were found to be 120.4~193.3 mg/g and 86.91~94.55 mg/g respectively. It is shown that 40-15H was the highest content in each compound. In antimicrobial activity, a lower drying temperature conditions were found to be more strong activities in disc diffusion assay and each extracts showed MIC of identical level against every tested microbial strains. However 100-2H(2 hours at 100

o

C for dry- ing) was exhibited MIC of slightly low level against some strains. And every extract showed fine cell viabilities(101.7~122.9%) against RAW 264.7 cell. In anti-proliferation activity against AGS, each extract showed a similar inhibition activity. However in anti-proliferation activity against HeLa, a lower drying temperature conditions showed more strong activities.

Key words −

Eriobotrya japonica, antioxidative, antimicrobial, cytotoxicity, drying temperature.

비파

( Eriobotrya japonica Lindl.)

나무는장미과

(Rosaceae)

상록소교목으로서겨울철에개화하여이듬해

6

월에

확하는과실수이다

.

중국이원산지로최대생산국이며

,

본이나스페인

,

브라질

,

인도등에서도재배되고있다

.

또한

최근에는국내에서도남해안지역을중심으로재배가증가 하고있는추세에있다

.

한방관련의서나민간요법에서는

비파진해

,

거담

,

구토

,

토혈등에효과가있으며

,

호흡진

정과갈증해소에도효능이뛰어난것으로전하고있다

.

비파잎은청폐

(

淸肺

),

지해

(

止咳

),

화위

(

和胃

),

지구

(

止嘔

),

소담

(

消痰

),

해서독

(

解暑毒

)

등의효능이있는것으로알려져

있다

.

1-3)

일본과중국등의최근연구에따르면비파종자추출물 활성산소종

(reactive oxygen species; ROS)

제거하거

산화적스트레스를억제하며

,

4,5)

LDL oxidation

방지

하는효과가있음이확인되었다

.

6)비파잎에서는항당뇨

과와항염증항암효과를나타내는물질의존재를확인 하기도하였다

.

7,8)국내에서는비파과실의성분분석이나비파

부위별용매추출물의항산화항균활성에관한연구

,

9-13)

잎의특정성분을이용한

peroxynitrite

소거능에대한

, nitrite

소거능항돌연변이효과에관한연구등이

행되었다

.

14,15)

비파잎은연중언제나수확이가능한특성을가지고 으며

, ursolic acid

oleanolic acid, amygdalin

같은생리

활성성분이함유되어있어서새로운기능성소재로의 잠재성이높은생약재임으로비파의기능성에대한 양한연구가필요한실정이다

.

저자들의선행연구에서비파

잎의생리활성이건조를실시한것보다건조하지않은 잎의추출물에서우수한것으로확인하였다

.

16)그러나

약재의경우유통이나가공

,

저장등을위해대부분건조의

과정을거치게되어있어실제활용에있어효과적인건조 조건의탐색이필요하게된다

.

열풍건조는생약재의건조에

있어서가장많이사용되는방법으로다양한건조방법 비교적경제적인방법으로평가되고있지만건조시간을 줄이는등의목적으로필요이상의높은온도를사용하는 경우변색등으로인한물리적

,

관능적인품질저하뿐만

니라생약재가가지고있는다양한생리활성물질의변화 초래하여결과적으로약효를떨어뜨리게되는경우가 생하게된다

.

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel):82-61-336-3118

(2)

따라서연구에서는비파잎을다른온도조건으로 풍건조한것을재료로하여항산화활성과항균활성

,

암세포

증식저해세포독성에미치는건조온도의영향에대하 조사하였다

.

재료 및 방법

실험재료 − 본실험에사용된비파잎은

2008

7

전남

농업기술원과수연구시험장에서채취한것을

4

o

C

이하로

장보관하면서사용하였다

.

균주 및 세포주 − 항균활성실험에사용된미생물균주

MRSA(methicillin resistance Staphylococcus aureus ,

CCARM3696)

서울여자대학교항생제내성균주은행에서

분양받았으며

, Bacillus cereus (KCTC1012), Staphylococcus aureus (KCTC3881), Vibrio vulinificus (KCTC2959), Stap- hylococcus epidermidis (KCTC1917)

세포독성실험에

용된동물세포주인

RAW 264.7

한국생명공학연구원

물자원센터

(BRC)

에서분양받은것을실험에사용하였다

.

또한암세포증식저해측정에사용된

AGS(human gastric

adenocarcinoma, CRL-1739)

HeLa(Uteri cervix cancer

cell)

한국세포주은행

(KCLB)

에서분양받은것을사용하

였다

.

시료의 조제 − 비파의신선한잎을수세하여물기를제거

40-60-80-100

o

C

가지온도조건에서수분함량

5%

이하가되도록

dry oven

에서건조하였다

.

이때건조

소비된시간은각각

15-5-3-2

시간이었으며

,

상압가열건

조법으로측정한수분함량은각각

4.24-3.13-3.21-2.86%

나타났다

.

건조온도별시료는

40-15H, 60-5H, 80-3H,

100-2H

건조에소비된시간과병행하여표기하였다

.

조가완료된시료는

80%

에탄올을추출용매로하여

90

o

C

에서

2

시간동안

2

반복하여환류추출을실시하였으며

,

출액은여과감압농축과동결건조의과정을거쳐분말 화한것을

-20

o

C

냉동보관하면서실험에사용하였다

.

총 페놀성 화합물 함량 측정 −

Folin-Denis

법을이용하

추출물의

total phenolic compound

함량을측정하였

.

17)

1 mg/ml

농도로

methanol

용해시킨시료액

80

µ

l

Folin-Denis reagent 80

µ

l

혼합하여

3

분간반응시킨

, 10% Na

2

CO

3

80

µ

l

혼합하여암실에서

60

분간반응시

상등액

120

µ

l

취하여

700 nm

에서흡광도를측정

하였다

.

표준물질로

tannic acid

이용하여검량선을작성

하고

phenolic compound

함량을

mg/g

으로나타내었다

.

총 플라보노이드 함량 측정 − 페놀성화합물중특히

가지기능성을나타내는것으로알려진

flavonoid

함량

알아보기위해

Lee

등의방법을변형하여다음과같이

측정하였다

.

18)

1 mg/ml

농도로

methanol

용해시킨시료액

10

µ

l

1 N-NaOH 10

µ

l, diethyleneglycol 200

µ

l

혼합하

37

o

C

에서

1

시간동안반응시킨

420 nm

에서흡광도

측정하였다

.

표준물질로

rutin

이용하여검량선을작성

하고

total flavonoid

함량을

mg/g

으로나타내었다

.

DPPH radical 소거능 측정 − 건조온도별비파추출물 항산화활성을비교하기위해

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

사용하여

radical

소거능을측정하였다

.

19)추출

물을

methanol

0.1~20 mg/ml

다양한농도로용해시킨

시료액

10

µ

l

300

µ

M

용해시킨

DPPH

용액

190

µ

l

혼합하여

15

분간암실에서반응시킨

microplate reader (BIO-TEK, USA)

사용하여

517 nm

에서흡광도를측정하

였다

.

측정된흡광도를바탕으로

50%

DPPH radical

거하는데 필요한 농도

(SC

50

)

계산하였다

.

대조군으로

ascorbic acid (vitamin C)

사용하였다

.

Nitric oxide 소거능 측정 −

Nitric oxide

소거능은

Marcocci

등의방법을변형하여다음과같이측정하였다

.

20)

10 mM sodium nitroferri-cyanide(III) dihydrate 50

µ

l

류수에일정농도로용해시킨시료액

30

µ

l

혼합한

25

o

C

에서

150

동안 반응시켰다

. 1% sulfanilamide(in 30%

acetic acid) 60

µ

l

혼합하고

5

분후 다시

0.1% N- (naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride(in 60% acetic acid) 60

µ

l

혼합하여

30

분간실온에서반응시킨

microplate reader(BIO-TEK, USA)

사용하여

520 nm

에서흡광도를

측정하였다

.

대조군으로

ascorbic acid(vitamin C)

사용하

였으며

,

시료액 대신증류수를사용한대조군의결과를

준으로소거능을계산하였다

.

Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정 − 각추출 물의항균활성은균주를대상으로

disc diffusion assay

측정하였다

.

21)항균시험용평판배지는계대배양된균주

멸균면봉을이용하여

200

µ

l

도말하여준비하였고

,

료를

disc

5 mg

되도록

paper disc(8 mm)

천천히

수시킨건조과정을거쳐용매를휘발시킨평판배지 위에밀착시킨상태로

37

o

C

에서

24

시간배양한

disc

변에생성된저해환

(clear zone, mm)

측정하여항균활성

비교하였다

.

최소저해농도(MIC)의 측정 − 각각의유해균주에대한 소저해농도

(minimum inhibitory concentration)

측정은

broth micro dilution assay

이용하였다

. 10

5

CFU/ml

농도

균액을

96well plate

분주하고최종시료농도가

0.5, 1.0, 2.5, 5 mg/ml

되도록하여

30~37

o

C

에서

24

시간동안배양

하였다

.

배양

600 nm

파장에서흡광도를측정하여시료

포함하지않은배양액의흡광도를기준으로

30%

이상

저해한농도를

MIC

결정하였다

.

MTT assay에 의한 세포생존율 측정 − 건조온도별비파 추출물의정상세포암세포에대한세포독성정도를

확인하기위해

MTT assay

이용한세포생존율을측정하

였다

.

22)

96 well plate

RAW 264.7

AGS

세포주는

(3)

1×10

4

cells/well, HeLa

1×10

3

cells/well

농도로

100

µ

l

분주하여

24

시간동안

37

o

C, 5% CO

2조건으로

incubator

배양한

0.5~10.0 mg/ml

농도의추출물을

10

µ

l

처리하여다시

24

시간동안배양하였다

. MTT

시약을

10

µ

l

가하여다시

4

시간동안반응시킨

well

바닥에형성

formazan

흩어지지않게상등액을제거하고

DMSO

100

µ

l

가하여

30

방치한

microplate reader(BIO-TEK,

USA)

사용하여

540 nm

에서흡광도를측정하였다

.

추출

물을넣지않은대조군의흡광도를

100%

하여상대적인

세포생존율을구하였다

.

통계처리 − 모든측정값은평균값

±

표준편차

(mean±SD)

표시하였고

,

실험군간의통계학적분석은

windows

SPSS 12.0

이용하였다

.

간의측정치비교는

one- way analysis of variance(ANOVA)

시행하였으며

,

유의성

신뢰구간

p <0.05

에서의미를부여하였다

.

결과 및 고찰

총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 − 건조온도에 비파잎의항산화기타의활성변화와연관성탐색을 위해페놀성화합물과플라보노이드함량을측정하여

Table I

II

나타내었다

.

건조온도별비파잎추출물의

페놀성화합물의함량은

40-15 H

에서

193.8±14.52 mg/g

으로가장높게나타났으며

,

20

o

C

건조온도상승에

11.35~17.36%

감소를보임으로써건조온도가페놀성

화합물의함량에높은영향을줌을있었다

.

그러나

라보노이드함량에서는건조온도에따라다소간의함량변 화를보이기는했지만통계적으로유의한수준은아닌 으로나타났으며

,

결과적으로플라보노이드이외의페놀성

화합물함량변화에건조온도가영향을미침을있었

.

페놀성 화합물은식물의 대표적인

2

대사산물로

hydroxyl

기를가지는방향족화합물로서다양한생리활성에

관여하는것으로알려져있으며

,

특히항산화활성은페놀

화합물의종류나함량이미치는영향이것으로알려

있다

.

23-25)한편

,

플라보노이드는전형적인페놀성화합물

로서

C

6

-C

3

-C

6기본구조를가지며

, flavonoid

polyphenolic

성질은

superoxide, hydroxy radical

같은세포손상을

초래하는

free radical

없애주는 항산화활성을 나타낸

.

26)

DPPH radical 소거능 및 nitric oxide 소거능 − 건조온 도별비파잎추출물의항산화활성을비교하기위해실시한

DPPH radical

소거능은각종생약재의항산화활성을측정

비교하는보편적인방법으로

,

27,28)실험에서는원래의

radical

50%

소거하는데필요한시료의농도인

SC

50 하여

Table III

나타내었다

.

그리고퇴행성질환의중요한

요인으로작용하고

superoxide

음이온과쉽게반응하여 응성이매우높고독성이강한

peroxynitrite(ONOO

-

)

성하는

nitric oxide(NO)

소거할있는능력을측정하여

Table I.

Total phenolic compound content in dried leaf extract of E. japonica

Sample

conditions Total phenolic contents

(mg/g) Fluctuation range 40-15H 193.8±14.52

a1)

(%)

11.35

60-5H 171.8±10.23

b

15.19

80-3H 145.7±15.87

c

17.36

100-2H 120.4±14.00

d

1)

Values are mean ± SD (n=5). Different superscript letters in the same column show significant differences at

p

<0.05 by one-way ANOVA.

Table II.

Total flavonoid content in dried leaf extract of E.

japonica Sample

conditions Total flavonoid contents

(mg/g) Fluctuation range 40-15H 94.6±6.70

a1)

(%)

5.07

60-5H 89.8±7.40

a

3.23

80-3H 86.9±16.31

a

1.73

100-2H 88.4±11.14

a

1)

values are mean±SD (n=5). Different superscript letters in the same column show significant differences at

p

<0.05 by one-way ANOVA.

Table III.

Antioxidant ability of dried leaf extract from E.

japonica by DPPH radical scavenging test Sample

conditions SC

50

(mg/ml) Relative

ability (%) Fluctuation range (%) 40-15H 0.97±0.08

a1)

18.56

21.1

60-5H 1.23±0.06

b

14.63

28.4

80-3H 1.72±0.03

c

10.47

24.9

100-2H 2.29±0.08

d

7.86

VC

2)

0.18±0.01 100.00

1)

Values are mean±SD (n=5). Different superscript letters in the same column show significant differences at

p

<0.05 by one-way ANOVA.

2)

VC : ascorbic acid(vitamin C, positive control).

(4)

Fig. 1

나타내었다

.

건조온도별비파잎추출물의

DPPH radical

소거능에서대조군인

ascorbic acid(vitamin C)

각각

7.86~18.56%

상대적인

SC

50보였다

.

건조온도

와의연관성이유의성있게나타나

20

o

C

건조온도

가에 따라

21.2~24.9%

소거능저하를 나타냈다

.

이는

Table I

페놀성화합물함량과유사한양상의변화로

페놀성화합물함량이항산화활성의변화에직접적으로 영향을주는요인이라는판단을있었다

.

29)

Nitric oxide

소거능에서도

DPPH radical

소거능에서의결과와마찬가지

낮은건조온도조건인

40-15 H

60-5 H

소거능이

대적으로높은건조온도조건인

80-3 H

100-2 H

확실

차이가존재함을있었다

.

항균활성 − 건조온도별비파잎의기본적인항균력의

이를확인하기위해

5

종의병원성미생물을대상으로

disc

diffusion assay

실시하여결과를

Fig. 2

나타내었다

.

험에사용된모든균주에서비파잎추출물의항균활성이 인되었으며

,

특히

Staphylococcus aureus

Bacillus cereus

대해상대적으로높은항균활성을가지는것으로나타 났다

.

건조온도증가에따라모든시험균주에서예외없이

항균활성이감소하는것으로나타났다

.

다만

Staphylococcus

epidermidis

경우통계적으로유의한감소는아닌것으로

나타났다

.

또한비파잎추출물의유해균주에대한최소저해

농도

(Minimum inhibitory concentration, MIC)

측정한

과인

Table IV

에서보는바와같이가장높은건조온도

건인

100-2H

에서다른조건의시료에서보다높은농도의

MIC

나타남으로써높은건조온도가항균활성의저하에

영향을미치는요인임을확인할있었다

.

MTT assay에 의한 세포생존율 − 비파추출물의세포 독성을확인하기위해대식세포주

(macrophage)

RAW 264.7

대상으로실시한

MTT assay

결과를

Table V

나타

내었다

.

실험이실시된모든농도모든건조온도조건에

Fig. 1.

Nitric oxide scavenging ability of dried leaf extract from E. japonica . Values are mean±SD (n=3). Different superscript letters in the same concentration show significant differences at p <0.05 by one-way ANOVA.

VC

, ascorbic acid(vitamin C).

Fig. 2.

Antimicrobial activity of dried leaf extract from E.

japonica by disc diffusion assay. Diameter of clear zone including disc diameter of 8mm and sample concentration is 5mg/disc.

Bc ;

Bacillus cereus ,

Sa ;

Staphylococcus aureus ,

Se

;

Staphylococcus epidermidis ,

Ms ;

methicillin resistance Staphylococcus aureus ,

Vv ;

Vibrio vulnificus. Values are mean±SD (n=3). Different superscript letters in the same color of bar(same strain) show significant differences at p <0.05 by one-way ANOVA.

Table IV.

Minimum inhibitory concentration of dried leaf extract from E. japonica Sample

conditions Minimum inhibitory concentration (mg/ml)

S. aureus S. epidermidis B. cereus V. vulnificus MRSA

40-15H 0.5

1)

0.5 0.5 0.5 2.5

60-5H 0.5 0.5 0.5 0.5 2.5

80-3H 0.5 0.5 0.5 0.5 2.5

100-2H 0.1 0.5 0.5 1.0 2.5

1)

Values are minimum concentrations showed growth inhibition more than 30% in every plates(n=3).

(5)

100%

이상의세포생존율을보였는데

, RAW 264.7

정상세포에대한비파추출물의세포독성은안전한

수준임을있었다

.

반면

Fig. 3

4

에서보는바와

위암세포주인

AGS

자궁경부암세포주인

HeLa

대해

서는일정수준이상의암세포저해효과를가지는것으로 나타났다

.

위암세포

(AGS)

대해서는

5 mg/ml

농도처리군

에서

74.1~81.7%, 1 mg/ml

농도처리군에서

13.6~21.0%

증식저해율로모든건조온도조건에서유사한증식저해

율을보였으나

60-5H

조건의추출물에서다소낮은저해율

보였다

.

자궁경부암세포

(HeLa)

건조온도의영향이

명확하게나타났는데

, 5 mg/ml

농도처리군의낮은건조

온도조건인

40-15H

60-5H

에서는

72.2~73.4%

증식

해율을 보였으나

80-3H

100-2H

에서는 각각

36.7%,

18.3%

현저히낮아짐을확인할있었다

.

결 론

생약재의이용에있어서필수적으로거쳐야하는단계인 건조에서중요한변수로알려져있는건조온도에따른 잎의생리활성변화를확인하고자서로다른온도조건 으로건조를실시한비파에탄올추출물을대상으로 산화

,

항균암세포증식저해율등을비교하였다

.

생리

활성을나타낼있는총페놀성화합물과플라보노이드 측정에서플라보노이드의경우건조온도에따른유의적 함량차이를나타내지않았으나페놀성화합물은 조온도가낮을수록높은함량을나타냈다

.

항산화활성의

도를평가할있는

DPPH radical

nitric oxide

소거능에

서도가장낮은건조온도조건인

40-15 H

추출물이높은

활성을보였으며

,

항균활성에서도건조온도가높아짐에

항균활성이감소됨을확인할있었다

.

정상세포에

세포독성은모든조건의추출물이유사한수준으로 성이없음을있었으며

,

암세포주에대한저해활성에

서는주목할만한수준의증식저해활성이있음과동시에 암세포주에따라서는건조온도가증식저해율변화에유의 영향인자임을있었다

.

이상의결과로비파

잎을건조시키기위해열풍건조의방법을사용할경우 도를

60

o

C

이하로관리하는것이생리활성물질의보존에

리할것으로판단된다

.

Table V.

RAW 264.7 cell viability of dried leaf extract from E. japonica by MTT assay Sample

conditions RAW 264.7 cell viability (%)

0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 5.0 mg/ml 10.0 mg/ml

40-15H 101.7±1.79

1)

105.0±2.18 109.3±1.98 105.1±3.75

60-5H 102.4±6.12 108.6±2.02 111.1±3.50 122.9±8.45

80-3H 107.0±5.25 108.4±6.40 104.8±5.78 108.8±4.10

100-2H 105.6±4.77 108.1±1.55 113.8±4.89 120.9±2.59

1)

Values are mean±SD(n=3).

Fig. 3.

Anti-proliferation activity of dried leaf extract from E.

japonica against AGS by MTT assay. Values are mean±SD (n=5). Different superscript letters in the same concentration show significant differences at p <0.05 by one-way ANOVA.

Fig. 4.

Anti-proliferation activity of dried leaf extract from E.

japonica against HeLa by MTT assay. Values are mean±SD

(n=5). Different superscript letters in the same concentration

show significant differences at p <0.05 by one-way ANOVA.

(6)

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(2009년 7월 16일 접수)

수치

Table I.  Total phenolic compound content in dried leaf extract of  E. japonica
Fig. 1. Nitric oxide scavenging ability of dried leaf extract from  E. japonica . Values are mean±SD (n=3)
Table V.  RAW 264.7 cell viability of dried leaf extract from  E. japonica  by MTT assay Sample

참조

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