Comparative Study of Digestive Enzyme in the Artemia Feeding Step of the Sweet Fish Plecoglossus altivelis, Rock Fish Sebastes schlegeli, Black Seabream Acanthopagrus schlegeli, and Olive Flounder Paralichthys olivaeus

서 론

소화효소 활성에 대한 비교 연구는 다양한 어류에서 진행되어 오고 있으며, 이러한 연구를 통해 어류의 건강도, 성장, 대사 능력을 비교 분석하는 지표로 적용되고 있다(Fish, 1960; Hsu and Wu, 1979; Kuz’mina and Kuz’mina, 1990; Hidalgo et al., 1999; Pedersen et al. 2003). 장내 소화효소 중 lipase의 활 성은 어종간의 생리적 특성 보다는 먹이와 서식지에 많은 영향 을 받고 있다(Kurtovic et al., 2009). 그러나 amylase 활성은 어종간 식성차이에 따라 protease의 활성보다 많은 변화의 폭 을 가지며, 이들 효소 활성량의 비교를 통해 어종간의 단백질 과 탄수화물 이용 능력을 평가하는데 이용되고 있다(Hidalgo et al., 1999). 이러한 소화효소 활성을 기초로 한 어류의 영양 요구에 대한 해석은 Dicentrarchus labrax (Zambonino Infant et al., 1996), Sparus aurata (Moyano et al., 1996; Kolkovski,

2001), Solea senegalensis (Ribeiro et al., 1999) 및 Kolkovski (2008) 등에서 보고된 바 있다.

일반적으로 초식성 어류는 두터운 세포벽을 갖는 식물성 단백질원의 섭취에 적합하도록 높은 proteolytic activity 및

amylase 활성을 보이나, 대부분 작은 어류나 갑각류를 주 먹

이원으로 하는 육식성 어류는 proteolytic activity 및 amylase 활성이 낮은 생리적 특성을 보인다. 그렇지만 현재 해면에서 적용되는 어류종묘 생산과정은 식성에 관계없이 동물성 먹이 생물인 rotifer와 Artemia, 미립자사료를 공급하는 먹이계열을 통해 종묘생산을 하고 있으나, 과연 적절한 양의 영양원을 공 급하고 있는지에 대해서는 의문시 되고 있다. 치어기 이후 적 정 단백질 요구량은 사료 내 영양소 함량 실험을 통하여 식성 에 따라 명백히 구분 지을 수 있는 것으로 보고되고 있으나(Bai et al., 1997; Lee and Kim, 1999; Jeong, 1992), 총 지질과 탄 수화물 요구량에 대해서는 식성과 종류에 따른 연구 자료는 찾 아보기 힘들다. 최근 각 어종에 적정한 미립자사료를 개발하 기 위해서 영양소의 균형, 사료제조 상의 공학적인 설계와 함

*Corresponding author: [email protected]

50

Artemia

공급 단계에서 은어(

), 조피볼락 (

), 감성돔(

) 및

넙치(

)의 소화효소 활성

이배익 . 김이청 . 김근업¹ . 권오남^2*

국립수산과학원 전략양식연구소, ¹강원도수산자원연구소, ²강릉원주대학교 해양생물연구교육센터

Comparative Study of Digestive Enzyme in the Artemia Feeding Step of the Sweet Fish Plecoglossus altivelis, Rock Fish Sebastes schlegeli,

Black Seabream Acanthopagrus schlegeli, and Olive Flounder Paralichthys olivaeus

National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-705, Korea

1Gangwon Province Fisheries Research Institute, Gosung 219-851, Korea

2Marine Biology Center for Research and Education, Gangneung-Wonju National University, Gangneung 210-853, Korea We compared the nutritional requirements of whole larvae of the black seabream Acanthopagrus schlegeli, sweet fish Plecoglossus altivelis, olive flounder Paralichthys olivaeus and rock fish Sebastes schlegeli. The larvae were 20, 30, 14 and 5 DAH (or spawning) of black seabream, sweet fish, olive flounder and rock fish, respectively. Specific α-amylase activity (mU/mg protein) was highest (8,324.9 mU/mg protein) in rock fish larvae (P<0.05). Specific trypsin-like prote- ase activity was highest (11,330.1 mU/mg protein) in black seabream larvae (P<0.05), which also exhibited the highest activity, 685.5 mU/mg dry weight (P<0.05). The specific activities per mg protein and mg dry weight of black seabream were the highest (187.4 mU/mg protein and 11.3 mU/mg dry weight, respectively) (P<0.05). A/P, P/L and A/L ratios of rock fish were 1.47, 90.3 and 133.1, respectively (P<0.05). We present here basic larval digestive enzymatic nutritional requirement data.

Key words; Fish larvae, Digestibility, A/P ratio, α-Amylase, Trypsin-like protease, Lipase

Bae-Ik Lee, Yicheong Kim, Geun-Up Kim¹and O-Nam Kwon^2*

께 소화기관의 생리학적인 측면도 매우 중요한 요인으로 작용 한다는 인식이 대두 되고 있다(Kolkovski, 2008). 또한 현재 시 판중인 미립자사료 조성보다 높은 수분, 단백질 및 지질을 함 유한 미립자 사료에 대한 검토 자료(Bai and Cha, 1997; Kvåle et al., 2006) 등을 고려한다면, 소화에 관련된 여러 생리학적 기초연구에 의해 미립자 사료 조성을 검토 할 필요가 있을 것 으로 사료 된다.

본 연구는 국내 양식생산량의 대부분을 차지하는 중요 산업 종으로 전형적인 육식성 식성을 가지는 감성돔(Acanthopagrus schlegeli), 넙치(Paralichthys olivaeus), 조피볼락(Sebastes schlege- li) 과 유어기 이후 초식성식성을 갖는 은어(Plecoglossus altive- lis) (Nakagawa et al., 2002)를 대상으로 rotifer와 Artemia로 대변되는 먹이생물 공급 다음 단계로 후기자어를 위한 적정 사 료원 공급의 기초 자료를 제공하고자 전어체를 대상으로 어종 별 소화효소 활성을 비교하였다.

재료 및 방법

실험에 사용한 은어와 넙치는 강릉원주대학교에서,조피볼 락 및 감성돔은 강원도 수산자원연구소에서 사육한 rotifer에 서 Artemia로 먹이전환 후 2-3일 경과한 형태학적으로 후기 자어에서 치어기로 이행하는 개체를 이용하였다(Table 1). 생 화학적 체성분 분석용 시료는 총 건중량이 20 mg 이상 되도 록 60-100마리의 개체를 수집하였으며, 이때 소화관 내에 들 어 있는 Artemia에 의한 영향을 배제하기 위하여 3-4시간 동 안 먹이생물이 없는 깨끗한 사육수조에 수용 후 채취하였다.

채취한 시료는 증류수로 깨끗이 세척한 후 1 mL의 3차 증류 수에 담가 -80℃의 급속 냉동고(Samwon, SW-UF-200)에 분 석 시까지 보관하였다. 표본은 분석에 앞서 전장과 체중을 측 정하였으며, 전장(total length, TL) 및 체폭(body width, BW) 은 해부현미경(OLYMPUS, SZ-45)하에서 0.01 mm 범위까지 측정하였고, 건조중량은 60℃에서 24시간 이상 건조하여 전자 저울(Percisa instrument Ltd., FR-200)을 이용하여 0.1 mg까 지 측정하였다.

소화효소 활성의 측정을 위해 실험에 사용한 각 어종의 시료 는 5 mL의 3차 증류수(18.2 mΩ 이상)를 넣고 glass homogenizers (Young ji, SHM-7200)로 1,800 rpm에서 1분간 균질화 시켰 다. 균질화된 시료는 냉장원심분리기(Hanil, Mega 17R)로 4℃

에서 20분간 6,000 rpm으로 원심 분리한 후 상층액을 조효소액 으로 사용하였다. 이 조효소액은 얼음 위에서 각각의 효소 분 석용 tube에 나눈 후 -80℃ 급속 동결시켜 분석 시까지 보관하 여 사용하였다.

효소분석은 α-amylase (EC 3.2.1.1), trypsin-like protease (EC 3.4.21.4), lipase (EC 3.1.1.3) 활성량을 측정하였으며 단 백질에 대한 비활성량을 조사하기 위해 수용성 단백질을 정 량 하였다. α-amylase 활성량 분석은 0.1 M phosphate-citrate buffer (pH 7.5)에 2% soluble starch solution을 기질로 한

Somogyi-Nelson colorimetric method (Robyt and Whelan, 1968)를 사용하였으며, Maltose를 표준물질로 하여, 활성 단 위(unit, 이하 U)는 1분간 maltose 1 mM을 생성하는데 필요로 하는 효소량을 α-amylase의 활성량으로 하였다. Trypsin-like enzyme 활성량은 Glass et al. (1987)에 따라 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0)에 1% (w/v) azocasein을 기질로 한 Kunitz (1947)의 방법을 변형한 Walter (1984)의 방법을 사용하였 다. Tyrosine을 표준물질로 사용하였으며, 활성의 단위(U) 는 1분간 tyrosine 1 mM을 생성하는데 필요로 하는 효소량을 trypsin-like enzyme 활성량으로 정의하였다. Lipase 활성량 은 0.5 M triethanoamine buffer (pH 8.5)에 58 mM emulsion olive oil을 기질로 사용한 Schmidt et al. (1974)을 사용하였다.

Stearic acid를 표준으로 사용하였으며, 활성의 단위(U)는 1분 간 Stearic acid 1 μM을 생성하는데 필요로 하는 효소의 량을 lipase의 활성량으로 정의하였다.

수용성 단백질량은 Folin-Phenol reagent를 이용한 Lowry method (Lowry et al., 1951)를 사용하였다. 각각의 효소활 성에 관한 실험 결과는 one-way ANOVA-test를 실시하여 duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 처리 평균간 의 유의성(P<0.05)을 SPSS (SPSS Inc. release 10.0.7, 2000) program으로 검정하였다.

결 과

소화효소 활성량 분석에 사용된 실험어 4종의 어체 정보는 Table 1에 나타내었다. 전장은 은어가 10.7 mm로 가장 길었으 며, 감성돔이 7.0 mm로 가장 짧았다. 체폭은 은어가 1.3±0.15 로 적었으나, 다른 3종은 1.5-1.8 mm로 큰 차이를 보이지 않 았다. 건조중량은 조피볼락 자어가 1.09 mg으로 가장 무거웠 으며, 은어 자어가 0.32 mg으로 가장 가벼웠으며, 수용성단백 질량에서도 조피볼락 자어가 50.0 µg/larva로 가장 높은 함량 을 보였으며, 은어가 자어 한 마리당 가장 적은 17.0 µg/larva 였다(P<0.05). 그렇지만 자어 mg 당 수용성단백질 함량은 감 성돔이 60.5 µg/mg larva로 유의적으로 가장 높은 값을 보였으 며, 조피볼락이 46.0 µg/mg larva로 유의적으로 가장 낮은 값 을 보였다(P<0.05).

4종류 어류 자어의 소화효소의 수용성 단백질 및 건조체중 에 대한 비활성량과 효소활성비는 Fig. 1과 2에 나타내었다.

α-amylase 수용성단백질 mg당 활성은 감성돔, 은어 및 넙치 에서 유의한 차이 없이 4,962.5-5,625.8 mU/mg protein으로 8,324.9 mU/mg protein의 활성을 보인 조피볼락보다 유의적 으로 낮은 활성을 보였다(P<0.05). 또한 건조중량 mg 당 활 성은 모든 자어에서 291.5-383.3 mU/mg dry weight로 유의적 인 차이가 없었다(P>0.05). Trypsin-like protease의 수용성단 백질 mg 당 활성은 11,330.1 mU/mg protein의 활성을 보인 감 성돔 자어에서 유의적으로 가장 높은 값을 보였지만(P<0.05), 은어의 9,197.9 mU/mg protein과 유의적인 차이는 없었으며

(P>0.05), 조피볼락이 가장 낮은 5,648.7 mU/mg protein 비활 성량을 보였다(P<0.05). 또한 건중량 mg 당 활성도 비슷한 경 향으로 감성돔에서 가장 높은 685.5 mU/mg dry weight로 조사 되었으며, 조피볼락에서 가장 낮은 260.1 mU/mg dry weight 활성을 보였다(P<0.05). Lipase 활성에서 수용성단백질 비활

성량과 건조중량당 비활성량에서 각각 감성돔이 187.4 mU/mg protein과 11.3 mU/mg dry weight의 활성으로 유의적으로 가 장 높은 활성을 보였지만, 조피볼락에서 유의적으로 가장 낮 은 62.5 mU/mg protein과 2.9 mU/mg dry weight의 활성을 보 였다(P<0.05). 그리고 소화효소 활성비에서 A/P (α-amylase/

Fig. 1. Activities (Mean±S.E.) of α-amylase, trypsin-like protease and lipase in the larvae of four fish species used this experiment. BS, SF, OF and RF were indicated black seabream Acanthopagrus schlegeli, sweet fish Plecoglossus altivelis, olive flounder Paralichthys olivaeus and rock fish Sebastes schlegeli, respectively. The different superscripts were indicated significant difference by one-way ANOVA (P <0.05).

Fish species Day after hatching

Body size

Body weight (mg)

Water soluble protein Length

(mm)

Width

(mm) µ g/larva µ g/mg larva

Black seabream 20 7.0±0.65 1.5±0.19 0.45±0.084 27.4±0.61^b 60.5±1.34^c

Sweet fish 30 10.7±1.11 1.3±0.15 0.32±0.042 17.0±0.05^a 53.2± 0.14^b

Olive flounder 14 8.5±0.49 1.7±0.20 0.65±0.055 32.7±0.78^c 52.1±1.25^b

Rock fish 5 8.1±0.39 1.8±0.12 1.09±0.101 50.0±0.50^d 46.0±0.46^a

The different superscript letters were indicated significant difference by one-way ANOVA (P <0.05).

(mU/mg DW) 800

600

400

200

0 d

c c

b bc b

a a

BS SF OF RF

12 10 8 6 4 2 0

(μU/mg DW) (mU/mg DW)

500 400 300 200 100 0

α-amylase

(mU/mg protein)

a a a

10,000 b 8,000 6,000 4,000 2,000 0

d c

b Lipase a

BS SF OF RF

(μU/mg protein) 200

150

100

50

0 c

bc b

a

Trypsin-like protease

(mU/mg protein) 15,000

10,000

5,000

0

(Pagrus major)의 경우 protease 비활성은 소화를 진행하는 소 화관 보다 간췌장과 비장과 같이 소화액이 분비되는 기관이 높 은 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Alliot et al., 1974;

Kitamikado and Tachino, 1996; Hidalgo et al., 1999). 그리고 장내 amylase 활성량은 위를 가진 육식성 어류에서는 낮으며, 위가 없는 잡식성과 초식성 어류에서는 높은 활성량을 가지며, 간과 비장에서의 활성이 높은 것으로 알려져 있다(Hidalgo et al., 1999). 이러한 결과로부터 소화기관을 적출하여 측정한 성 체의 결과와 전어체를 대상으로 하는 후기자어의 결과는 다를 수 있으며, 소화기능을 소화관내의 소화효소 활성만으로 판단 하기에는 부족할 것으로 판단된다.

일반적으로 어류의 식성과 소화력과의 관계에서 식물성 단 백질은 동물성 단백질에 비해 소화시켜 흡수하기에 힘들기 때 문에(Hidalgo et al., 1999), 육식성어류 보다 비육식성 어류에 서 높은 단백질 분해 잠재력을 가진다(Kuz’mina, 1990). 그리 고 육식성 어류인 경우 A/P ratio가 초식성 어류 보다 낮아서 탄수화물보다 단백질 요구량이 보다 많다는 것을 알 수 있다 (Hidalgo et al., 1999). Hidalgo et al. (1993, 1999)와 Furné et al. (2005)는 소화효소 분석을 통해 육식성인 참돔, 유럽산뱀장 어 및 철갑상어는 같은 육식성 어류인 무지개송어보다 탄수화 물 이용능력이 높다는 결과를 보고하였다. 이는 Suárez et al.

(2002)의 유럽산뱀장어는 높은 corn starch 사료조성을 요구한 다는 사육실험결과와 동일한 것으로 소화효소 활성량으로부터 유추한 탄수화물 이용능력과 사육실험 결과가 다르지 않음을 말해주는 것이라고 할 수 있다.

본 연구의 결과에서 감성돔과 은어 자어는 낮은 amylase 활 성과 높은 protease 활성으로 전형적인 육식성 어류의 경향을 보이는데, 이는 은어는 소상과정에서 부착성 규조류(Navicula spp., Amphora spp. 등)를 섭취하는 식물성 식성으로 바뀐다는 연구보고(Nakagawa et al., 2002)와 같이 소화효소 활성량으로 보아도 초기발육단계에서는 육식성 어류에 해당하는 소화생리 작용을 하고 있음을 알 수 있었다. 하지만 조피볼락 자어는 높 은 amylase와 낮은 protease 활성으로 인해 A/P ratio이 높게 나타났으나, 이것은 본 종이 초식성이기 때문에 나타나는 결과 trypsin-like protease) ratio는 다른 어류 자어 보다 조피볼락 자

어가 유의적으로 가장 높은 1.47로 조사되었고, 다른 어류 자 어는 유의적으로 차이 없이 0.44-0.70의 비를 보였다(P<0.05).

P/L (trypsin-like protease/lipase) ratio는 은어 자어에서 유의 적으로 가장 낮은 49.9로 조사되었지만, 가장 높은 ratio는 조 피볼락의 90.3이었다(P<0.05). 그리고 A/L (α-amylase/lipase) ratio도 조피볼락에서 가장 높은 133.1로 조사되었지만, 감성 돔과 은어에서 유의적으로 가장 낮은 26.5와 30.5로 각각 조사 되었다.

고 찰

어류의 성장은 그들이 가진 소화 및 흡수 능력에 맞는 적정 영양원이 공급되었을 때 최적의 성장을 보이고, 특히 소화기 관의 발육 초기단계에 해당되는 종묘생산 시기에는 먹이종류 에 따라 성장차가 큰 특징이 있다(Blier et al., 2002). 현재 종 묘생산이 원활히 진행되는 양식 어류 대부분은 육식성 식성 으로 고급 어분을 포함한 단백질을 요구하고 있어, rotifer와 Artemia 혹은 copepod의 먹이생물 공급 후, 치어기로의 이행 과정에서 식성에 맞는 미립자사료를 공급하는 먹이계열로 사 육되고 있다. 그러나 미립자 사료에 대한 연구는 경제적 논리 에 가려져 높은 수분, 단백질 및 지질을 함유한 일본 사료를 소 개한 Bai and Cha (1997)를 제외하고는 발표되지 않고 있다 가, 최근 Kvåle et al. (2006)은 Bai and Cha (1997)에서 소개 한 사료조성보다 높은 수분, 단백질 및 지질을 함유한 미립자 사료 개발에 대해 보고하였다. 그러나 이 사료는 단백질, 지질 혹은 탄수화물 단독 혹은 복합 공급실험을 통해 개발되었는데, Kolkovski (2008)와는 달리 자어기의 소화 생리학적 측면은 고 려하지 않고 있다.

Kolkovski (2008)는 사료 제조상의 공학적인 설계와 영양소 의 균형뿐만 아니라 소화기관의 생리학적인 측면도 매우 중 요한 요인으로 작용하는 것으로 보고하고 있다. 그러나 소 화효소에 대한 지견은 주로 소화기관을 적출하여 측정한 결 과가 대부분이다. 유럽산뱀장어(Anguilla Anguilla), 참돔

Fig. 2. Activity ratios (Mean±S.E.) of α-amylase (A), trypsin-like protease (P) and lipase (L) in the larvae of four fish species used this experiment. The different superscripts were indicated significant difference by one-way ANOVA (P<0.05).

A/P ratio A/L ratio

2.00

1.50

1.00

0.50

0.00

BS SF OF RF

P/L ratio A/L ratio

100.0

80.0

60.0

40.0

BS SF OF RF

160.0

120.0

80.0

40.0

0.0

BS SF OF RF

a a a

b

b

a a a

b c c

d

와 Furné et al. (2005) 자료와 같이 육식성어류 중에서도 어종 마다 탄수화물 이용능력이 다른 점을 반영한 것으로 이는 본종 의 서식환경과 생리학적인 특징과 연관된 것으로 생각된다. 또 한 본 연구에서 감성돔과 은어는 높은 lipase 활성과 낮은 P/L 및 A/L ratio를 나타내었는데, 이 사실로 보아 이들 두 종은 치 어기로의 이행기에 넙치, 조피볼락보다 높은 지질량을 요구할 가능성이 있는 것으로 판단되며, 또한 같은 육식성 어종이라도 이러한 소화기관의 생리학적인 측면을 고려하여 Artemia 영양 강화 방법을 어종마다 다르게 할 필요성이 있는 것으로 생각 된다. 그리고 은어의 높은 지질 요구량은 소상과정에서 식성 이 변할 시기 위 내용물을 확인한 결과 지질함량이 높은 부착 성 규조류(e.g., Navicula spp., Amphora spp. 등)를 섭식하는 식성(Nakagawa et al., 2002)과 관련이 있는 것으로 판단된다.

본 연구에서는 각 영양성분의 대표 효소(α-amylase, trypsin- like protease 및 TG-lipase)만을 분석한 것이기 때문에 각 영 양소의 세세한 유효성분이 어떤 것이지는 정확히 언급할 수 없 다. 그렇지만 소화효소 활성량과 효소활성비를 분석한 본 연구 를 통하여 어종 별 서로 다른 영양원에 대한 소화능력이 있어 서, 이를 응용하여 자치어기 때 미립자사료를 개발하는데 고가 의 어분단백질의 불필요한 사용을 줄이는 등 사료조성을 위한 기초 자료를 제공 할 수 있을 것으로 판단된다.

사 사

본 연구는 국립수산과학원 뱀장어 부화자어 사육기법 개발 연 구의 일환(RP-2011-AQ-063)으로 수행되었음.

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2011년 8월 10일 접수 2012년 1월 19일 수정 2012년 2월 2일 수리