DOI 10.17480/psk.2016.60.2.78
페닐티오우레아 유도체와 카테콜 산화효소와의 상호작용에 대한 분자역학적 모의실험
박 경 래#
충남대학교 약학대학 제약학과
(Received February 18, 2016; Revised March 16, 2016; Accepted March 16, 2016)
The Interaction of Phenylthiourea Derivatives as Catechol Oxidase Inhibitors by Molecular Mechanics Simulation
Kyung Lae Park#
Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
Abstract — N-Phenylthiourea derivatives and catechol oxidase receptor complex was studied using molecular mechanics method. The starting structure was adopted from the protein databank and the calculation of energy minimization and molecular dynamics was performed with AMBER package. The molecular dynamics showed that the simulation time span of 20 ns was long enough to observe the interaction profile and stationary ligand-receptor configuration in the complex. The conformation of the ligand was related to the interaction to the receptor and the efficacy was also interpreted in this context.
Keywords □ metalloprotein, catechol oxidase, molecular mechanics, ligand-receptor complex
자연계의 일부 동물과 식물군에 존재하는 일련의 금속함유 단 백질1)은 생체기능에 필요한 산소의 운반과 활성화에 중요한 역 할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 그들 중 두 개의 구리금속이 온을 함유하는 카테콜 산화효소는 페놀성중합체의 산화과정과 멜라닌 복합체의 연속적 생성에도 관여하고 있는 것으로 파악되 고 있다. 최근에는 멜라닌형성에 관여하는 타이로시나아제에 대 한 관심이 높아지고 있는데 멜라닌생성이 동식물의 색소형성에 주된 역할을 하므로서 농작물의 갈변현상과 인간의 피부변색 등 의 원인으로 인식되는 바, 식품업계2)및 화장품업계3)의 시장성 에도 연관될 수 밖에 없으므로 많은 과학자들이 이에 관심을 가 지게 되었다.
이와 같은 구리함유 산화효소의 구조에 관해서는 Klabunde et al.4)은 감자의 카테콜 산화효소와 이의 저해제에 대한 X-선 결정 구조를 밝혀낸 바, 그에 따라 여러 가지 사실이 알려지게 되었는
데 두 개의 구리이온은 그 산화상태에 따라 그 복합체 내에서 산 소원자의 이동을 조절하는 기능을 수행하는 것으로 파악되고 있 다. 또한 최근 어느 그룹에서는 페닐티오우레아의 페닐기에 여 러가지 곁가지를 도입하여 멜라닌형성 저해 효과를 측정하여5) 구조 중 파라치환체가 활성에 유효함을 일부 밝혔으나 치환체의 구조의 다양성과 효과와의 일관된 연관성을 찾을 수 없었다. 그 것은 저해제로 언급된 페닐티오우레아 분자 자체가 아주 작은 유 기분자이며 따라서 수용체와의 상호작용이 변별력있게 나타나기 가 어렵기 때문으로 해석될 수 있다. 이에 본 연구진은 분자역학 적 알고리즘에 바탕으로 한 분자동력학적 모의실험을 통하여 저 해제와 수용체간의 상호작용을 구별할 수 있는 방법을 찾아보고 자 하였다. 분자동력학실험(Molecular Dynamics: MD)은 바로 저해제와 수용체가 특정 화학결합이 아닌 복합체를 형성했을 경 우 형태구조의 변화와 상호작용의 분석과 추적이 용이한 수단인 것이다.
이 연구에서는 분자역학의 AMBER12 프로그램6)을 사용하여 가능한 한 긴 시간단위인 20 ns간에 일어 나는 복합체 내의 모 든 원자들의 동력학을 실시간으로 모의실험을 함으로써 저해제 의 형태구조의 변화, 단백질 수용체의 2차구조의 변화, 복합체의 형태구조, 그리고 저해제의 구조변화에 의하여 유발되는 복합체
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Corresponding Author Kyung Lae Park
Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
Tel.: 042-821-5938 Fax.: 042-823-6566 E-mail: [email protected]
Short Report
종설내 상호작용의 변화를 추적해 보았다.
실험 방법
이 연구에 사용된 초기구조로 RCSB Protein Data Bank의 1BUG.PDB를 취하였다. 페닐 유도체의 편집과 수소첨가 등의 기초적인 편집은 AMBER12 프로그램을 사용하였으며 힘장은 ff997)을 바탕으로 하였다. X-선 구조에는 서열중간과 끝에 몇 개 의 아미노산의 위치가 불확실하게 명시되어 있으나 이는 AMBER 의 기본기능으로 복구하여 341개의 모든 아미노산의 펩타이드복 합체를 구성하였다. 리간드인 N-페닐티오우레아(C7H8N2S)는 원 전대로 URS로 명명하였다. 그 외에도 이 복합체내의 히스티딘 잔기 중 하나는 특이하게 시스테인과 공유결합으로 연결되어 수 소원자 하나가 줄어든 상태로 편집하여 구조를 형성하였다. 이 들 특별한 히스티딘 원자들의 부분전하는 본 그룹의 지난 연구 보고서에 발표된8)자료를 사용하였다.
리간드는 Klabunde의 리간드 URS의 빈 원자가만을 수소로 채웠고, 별도로 오쏘(ortho)와 파라 위치(para)에 삼차부틸기를 도입하여 각각 PTO와 PTP로 명명하였다(Fig. 1). 유도체 URS, PTO 및 PTP 원자들의 부분전하는 AMBER의 힘장에서 찾기 에 적합하지 않으므로, 본 연구진의 지난 연구결과8)로부터 그대 로 도입하였으며 이는 반경험적 AM1-BCC9) 방법에 기반한 것 으로 일반화된 AMBER의 GAFF10)에 적응시킨 값들이었다.
이렇게 만들어진 리간드 유도체는 원래의 단백질 수용체의 리 간드 위치에 삽입하여 복합체를 형성하였다. 우선 341개의 아미 노산을 조사한 결과 이 복합체가 결정화된 중성 용매조건에서 순 수 단백질 수용체만의 총전하는 −8가였고 두 개의 구리원자의 +2가 전하를 감안하면 전체 복합체는 −4가의 전하를 가지며 이 를 중화시키기 위한 양전하는 4개의 Na 이온으로 대체삽입 하
였다. 이 세가지 리간드의 행동을 절대적으로 비교하기 위하여 하나의 시스템에서는 리간드를 제거한, 즉 수용체 단백질과 구 리이온만으로 구성된 복합체를 설정하였다. 이 리간드 없는 복 합체를 co라 칭하였고 다른 URS, PTO 및 PTP 리간드를 포함 하는 복합체를 각각 cpu, cpo 및 cpp라 명명하여 복합체 시스 템을 구성하였다.
이들 복합체에 공통적으로 전체 −4가의 음전하를 중화하기 위 한 Na 이온을 첨가하였고, 이를 다시 절삭팔면체용기(truncated octahedron box)11)에 넣었으되 용질분자와 용기 벽면과의 최소 거리를 8 Å이 되도록 하였으며 빈 공간에는 TIP3P 물12)로 채워 주기적 경계조건(periodic boundary condition)을 설정하였다. 이 때에 얻어진 시스템 구성원자의 상황은 Table I에 표시하였다.
이렇게 형성된 복합체들은 co를 제외하고는 수소와 곁가지의 도입과 Na 이온, 그리고 용기 안에 임의로 주입한 물 분자들에 의한 일종의 장력, 또는 긴장상태에 있게 되므로 이 장력을 이완 시키는 절차를 수행하였다. 이 에너지 최소화 절차는 2단계13)에 걸쳐서 실행되며 첫 과정은 우선 50단계의 최대경사법(steepest descent)14)으로 초기의 급격한 긴장상태를 이완시키고 두 번째 는 1950단계의 결합기울기(conjugated gradient)법15)으로 긴장을 서서히 완화시켰다. 이 과정에서 단백질과 리간드 분자의 좌표 는 실험적으로 관찰된 것으로서 1000 kcal/mol Å2의 힘의 상수 로 위치를 고정 보존시키고,16)물 분자와 Na 이온에 대해서는 1.0 kcal/mol Å2의 힘을 사용하여 위치고정계산을 수행하였다.
이 계산이 끝난 복합체는 분자동력학적 모의실험의 출발점의 구조로 사용되었다. 이 시점에서는 온도 파라메터의 도입에 의 한 운동에너지효과로 결합된 모든 원자들의 실시간 운동을 모의 하게 되는데 진동주파수가 아주 빠른 C-H 결합을 일정상수로 고 정시키는 SHAKE 알고리즘17)을 써서 모의실험의 실시간 간격을 0.002 ps로 고정함으로써 연산시간을 단축하도록 하였다. 또한 상 호작용의 한계를 8 Å 이내로 국한시킴으로써 불필요한 계산을 절제하였다.
Fig. 1 − Atomic numbering of 3 N-phenylthiourea derivatives, URS, the original ligand from 1BUG.PDB without substituent;
PTO, t-butyl group on C2 and PTP, on C6 atom of phenyl group.
Table I − The topology information of catechol oxidase complex with different inhibitor derivatives, URS, PTO and PTP.
For comparison of the dynamics the first system, co contains no inhibitor besides the neutralizing counter ions and solvent waters
Complex system co cpu cpo cpp
Ligand name - URS PTO PTP
AA residue 341
AA atom 5281
Cu(II) ion 2
Ligand atom - 18 30 30
Na+ ion 4
Solute atom 5287 5305 5317 5317
TIP3P water 6278 6281 6269 6291
Total no. of atoms 24121 24148 24124 24190
분자동역학의 출발은 온도가 정의되지 않았던 초기시스템을 가열하는 과정으로서 상온인 300 K의 온도를 50 ps의 시간 안에 도달하도록 하였다. 다음에 이어지는 50 ps의 모의실험에서는 일 정압력하에 주변과의 압력스케일을 1.0 ps로 설정하였다. 첫 번 째와 두 번째 단계의 계산에서는 위치제한 힘의 상수를 각각 2.0 및 1.0 kcal/mol · Å2로 단계적으로 자유운동을 허용하였으며 최 종적으로 50 ps의 자유 동력학을 도입하여 복합체가 분자동력학 적 평형상태로 진행하는 과정을 유도하였다.
이와 같이 초기의 분자동력학이 안정화된 이후에는 0.002 ps 의 모의실험을 수행하며 5000단계(10 ps)마다 복합체 구조를 기 록하여 총 10,000,000단계의 모의 실험을 총 20 n의 시간을 수 행하였다. 분자동력학 계산은 LINUX 운영체제의 Intel Xeon 5500 연산기에서 수행하였다.
결과 및 고찰
저해제-리간드 복합체의 에너지 최소화 과정을 살펴보면 도입 된 분자역학적 계산이 올바르게 진행되었음을 알 수 있다. Fig.
2는 시스템의 구조가 어떤 과정을 거쳐서 최적화되는지를 보여 준다. 복합체의 위치에너지 중 결합성 에너지는 복합체 형대구 조의 변화에 의하여 크게 달라지지 않는 반면, 비결합성에너지, 즉, 정전기 인력(a)과 반데르발스 상호작용(b)은 구조최적화의 전 형적인 패턴을 보여준다. 각 시스템에 따라 돌발적인 계산의 불 규칙성이 발견되지만 전체적으로는 정전기적 인력은 큰 폭의 에 너지 감소(~30,000 kcal/mol)에 기여하며(a), 반데르발스 상호작 용은 소폭(~5,000 kcal/mol)의 감속으로 최저에너지 도달 후 다
시 상승하는 전형적인 Lennard-Jones18)함수와 유사한 형태를 보인다. 이 소폭의 상승은 물론 정전기인력의 작용에 의한 총에
Fig. 2 − Potential energy profile of 4 complex system co, cpu, cpo and cpp during the energy minimization process from the starting structure. The total energy (kcal/mol · Å
2) include also the bond, angle, and torsion dihedral angles.
Fig. 3 − Ramachandran diagram verified the conservation of secondary structure of protein receptor (a) from the beginning to the end of
molecular dynamics, and (b) for all complex system co, cpu, cpo and cpp with the same degree of dispersion of (φ, ϕ) points. φ and
ϕ is represented in horizontal and vertical axis, respectively.
너지 감소(c)로 안정화됨을 알 수 있다.
최소에너지의 복합체를 출발로 한 20 ns의 분자동력학실험의 안정성을 분석한 결과는 Fig. 3에 재구성하였다. 폴리펩티드 결 합에서의 이면각 φC-N-Ca-C와 ϕN-Ca-C-N를 각각 가로축과 세로축에 정의한 좌표면에 해당 단백질의 좌표값을 도식한 라마찬드란 도 식19)은 초기복합체, 초기 평형동력학에 도달한 복합체, 그리고 20 ns에 도달한 최종 구조를 한 도식(a)에 표현하였고, 20 ns에 도달한 4개의 복합체 채, cpu, cpo 및 cpp 복합체를 도식(b)에 표시하였다. 즉, (a)에는 341개의 아미노산으로 연결된 3개의 단 백질에서 총 340*3=1020개의 좌표점이, (b)에는 4개의 단백질 에서 1360개의 좌표점을 확인할 수 있다. 그림의 왼쪽 아래 알 파나선영역과 왼쪽 윗 부분의 베타판 영역의 점들의 밀도와 분 산도가 거의 유사함에서 보듯이 분자동력학의 시작에서 종료에 도달할 때까지(a), 그리고 4개의 서로 다른 복합체(b)에서도 단백 질수용체의 2차구조는 항상 유지된 상태로 분자의 동적 운동이 진행됨을 알 수 있다.
복합체내의 구성성분으로 단백질, 구리금속, 리간드 간에는 직 접적인 화학결합이 형성되어 있지 않으므로 그들의 운동성과 운 동의 상호의존성을 파악하기 위한 분석으로 원자들의 분자동력 학에 따른 유동성을 분석하였다. Fig. 4를 분석하면 리간드가 빠 진 co계에서의 유동성이 가장 큰 것은 당연한 예측의 결과이다.
모든 복합체에서 구리이온의 유동성이 가장 작은 것도 금속원자 에 대한 주변의 여러 리간드가 구리의 유동성을 제한하기 때문 일 것이다. 여기서 오쏘 위치와 파라 위치의 삼차부틸기가 분자 의 전체의 유동성에 큰 영향을 주는 것으로 보이는 바, 이를테면 곁가지의 큰 부피가 오쏘 치환체의 자유로운 운동성을 제한하거 나 파라치환체의 경우는 오히려 모든 성분의 유동성을 증가시키 고 있는데 이는 삼차부틸기의 동력이 리간드 분자계의 전체에 영 향을 주는 것으로 해석할 수 있다.
원자의 유동성에서 구리이온 주변원자들의 공간적 배치에 대 한 의문이 제기되는 바, 가장 단순한 두 개의 구이이온간의 거리
를 분석해 보았다. 초기분자동력학 실험에서 모든 구성원소들의 위치제한 동력학은 기대한 행동을 보였다. 즉, Fig. 5(a)에서 위 치제한이 유효한 구간에서는 거리정보의 변화가 거의 없으며 제 한이 풀리는 구간인 100 ps 이후에는 변화를 관찰할 수 있다. 리 간드를 포함하지 않는 co 복합체에서 6개의 히스티딘이 두 개의 구리이온을 붙들고 있음에도 불구하고 구리-구리간의 거리가 제 한이 풀린 직후 곧바로 증가하는 것은 의외의 현상이었다. 사실 초기의 구조에서도 co와 다른 복합체 cpu, cpo 및 cpp 간에는 거리의 차이를 볼 수 있었다. co에서는 이미 구조최적화 이후 Cu-Cu 거리가 6 Å으로 확장되어 있었다. 이 금속-금속간의 거리 가 주 분자동력학 과정에서는 10 ns 시점에서 10 Å 이상의 최대 값을 보이다가 그 이후에는 정류상태로 판단되는 8 Å에서 안정 화 현상을 나타내었다. 이 그림에서 판단하면 저해제 리간드가 존재하는 복합체에서는 구리-구리금속간의 거리가 일정한 값을 유지함으로써 리간드 역할의 중요성을 강조하여 보여주고 있다.
또한 이 분자동력학적 결과를 기준으로 판단하면 항상 논란거리 가 되고 있는 모의실험의 수행시간에 대한 기준을 제시한다고도 볼 수 있다. 즉, 20 ns 정도의 시간 폭은 일정한 형태구조의 정 착을 위해서 충분한 시간이라 판단된다.
단백질 수용체 내에 결합된 리간드 분자의 형태구조는 수용체 와 그 주변의 환경에 의존할 수 밖에 없다. 리간드 분자구조 자 체만으로 판단하면 티오우레아기와 페닐기의 상대적 구조는 중 간의 회전 자유도에 의하여 독립적인 형태구조를 가질 것으로 예 상되지만 분자동력학 중 이 구조를 결정짓는 두 개의 이면각의
Fig. 4 − The atomic fluctuation in Å during the 20 ns simulation
time. The averaged values were calculated from the Cα atoms for the protein backbone, two copper ions, S, C, N atoms for thiourea head, and 6 C atoms for phenyl group.
Fig. 5 − The monitoring of the intermetallic distance between the
two copper during the MD simulation. For comparison the
stable distance from copper to NE2 of 6 histidines are also
given.
변화를 보면 수용체의 형태와 페닐기의 곁가지가 중요한 변수임 을 알 수 있다. 페닐티오우레아의 형태구조 중 우레아 평면과 페 닐기 간의 각도를 간접적으로 표현하는 이면각 θC7-N1-C3-C4과 유 황과 페닐기와의 거리를 간접적으로 표현하는 θS1-C7-N1-C3은 각 각 N1-C3 결합축과 C7-N1축의 회전을 표시하는 것으로 초기의 x선 구조에서는 각각 −43o도와 151o이었으며 이는 우레아와 페 닐평면은 거의 동일평면에 가깝고 유황원자는 페닐환으로부터 멀리 떨어진 구조임을 말한다. 이 이면각도에 대한 분자동력학 중의 궤적은 Fig. 6에 요약되어 있다.
분자동력학이 시작된 후 100 ps 이후 위치제한이 풀리자 마자 형태구조는 그 궤적을 달리하기 시작하여 장시간의 분자동력학 이 시작되는 시점에서는 이미 특정 이면각의 평형값에 도달하였 다. 이 특정 각도는 페닐환의 치환체 위치에 따라 확연히 구분되 어 새로운 이면각을 찾아 안정화 된다. 결과적으로 cpp 복합체 의 파라치환 리간드 PTP는 원래의 URS와 유사한 형태구조를 가지며 오쏘 치환 리간드 PTO는 URS와는 완연히 다른 형태구 조를 가짐을 알 수 있다.
이 형태구조를 시각적으로 표현한 것이 Fig. 7이며 cpu, cpo 및 cpp 복합체내 리간드의 형태변화를 순차적으로 나타내었다.
Fig. 7(a)는 세가지 복합체를 N1-C7-N2 평면을 기준으로 겹쳐 표현한 것으로 흡사 오쏘와 파라 치환체가 페닐환 하나에 결합 된 것으로 보이며 결과적으로 초기의 형태구조가 같음을 나타낸 다. (b)는 초기 동력학이 완료된 후의 구조를 같은 방법으로 겹 쳐놓았으며 복합체 내의 상호작용에 의한 리간드의 운동역학이
다른 방향으로 진행함을 확인할 수 있다.
삼차부틸기를 가진 오쏘 치환체 PTO 및 파라 치환체 PTT의 복합체는 각각 (c) 와 (d)에 중심 금속이온과 같이 표현하였는데 티오우레아 기의 구조에 대한 페닐환의 방향이 전혀 달라져 있음 을 알 수 있다. 단순하게 해석하면 오쏘 치환체의 큰 부피로 인하 여 티오우레아기의 N2 원자와 유황원자가 삼차부틸로부터 동시 에 멀어지는 형태구조를 가질 수 밖에 없으니 그 중 치환되지 않 은 오쏘 위치에 유황이 배열된 구조(c)가 당연한 형태구조임을 알 수 있다. 파라 치환체 PTT의 경우(d)에는 어떠한 배위에도 그러 한 입체적 방해요인이 없으며 원래의 URS와 유사한 형태구조를 가지는 것으로 확인되었다. 물론 리간드에 대한 이러한 해석은 수
Fig. 6 − The monitoring of the torsion dihedral angles θ
S1-C7-N1-C3(a, b) and θ
S1-C7-N1-C3(c, d). The starting single conformation divided into two
conformation and orientation depending on the substituent position.
Fig. 7 − The snapshot structure (a) after optimization, (b) after initial MD of URS (cpu), PTO (cpo) and PTP (cpp), (c) and (d) after 20 ns MD run of PTO and PTP respectively.
Every structures are fitted to N1-C7-N1 atoms (a, b) and
copper atoms are given for comparison of the orientation.
용체 단백질의 결합부위와의 상호작용을 일단 고려하지 않은 것 으로 그에 대한 분석은 좀 더 긴 시간의 모의실험을 통하여 더 많 은 형태구조공간의 검색이 수반되어야 할 것으로 사료된다.
결 론
단백질 수용체와 리간드는 일반적인 화학결합이 아닌 상호작 용에 의하여 복합체를 형성하며 그들 내부의 구성성분간의 상호 작용은 분자역학적 방법으로 연구할 수 밖에 없으며 본 연구에 서는 페닐티오우레아와 카테콜 산화효소와의 복합체를 분자동력 학적으로 모의실험하여 그들의 상호작용과 리간드의 형태구조에 대하여 연구하였다.
분자역학 프로그램인 AMBER를 이용한 동력학 모의실험은 페 닐티오우레아 복합체에 대하여 설계된 시간구간 20 ns에 대하여 매우 안정적인 결과를 보여 주었으며 에너지 프로파일과 형태구 조에 관한 의미 있는 결과를 산출하였다. 우선 4개의 복합체의 분자동력학은 모두 단백질의 2차구조의 골격이 거의 손상되지 않고 보존됨을 확인하였다.
리간드의 역할을 비교하기 위하여 도입한 ‘리간드 없는’ 복합체 co는 구리이온과 수용체만을 포함하고 있으며 두 개의 구리이온 은 6개의 히스티딘의 NE2에 의하여 루이스염의 안정적 형태를 가질 것으로 예상되었다. 실제 모의실험 결과는 두 개의 구리이 온은 초기의 간격이 점차로 증가하기 시작하여 최대 11 Å에 도달 한 후 점차로 8 Å의 평형값에 도달하였다. 리간드를 포함하는 복 합체 cpu, cpo와 cpp 복합체에 대한 모의실험을 분석한 결과로 페닐티오우레아의 유황원자가 각각의 구리이온에 4번째의 루이스 염기의 역할을 함으로서 안정화에 크게 기여함이 증명이 되었다.
이러한 안정성을 기반으로 리간드 분자는 수용체 내의 환경 안에서 가능한 모든 형태구조를 보여주었다. 티오우레아기 주변 의 공간을 방해하는 오쏘 치환체의 존재로 cpo 복합체의 PTO 리간드는 원래의 형태구조로부터 많은 큰 변화를 보인 반면, 파 라 치환체는 원래의 형태구조를 거의 그대로 유지하였다.
일부 문헌에 보고된 오쏘 치환체 PTO와 파라 치환체 PTP의 실험적 효과의 차이는 즉 이러한 형태구조의 차이에 따른 수용 체와의 결합력의 차이에서 기인하는 것으로 판단된다.
감사의 말씀
이 연구는 충남대학교의 학술연구비 지원에 의한 것으로 이에 감사를 표한다.
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