배합 비율에 따른 황련과 황금의 혼합 전탕액 및 개별 전탕 혼합액 내 성분 함량 분석
김한영#, 김정훈*
부산대학교 한의학전문대학원 약물의학부
Quantitative analysis of the marker compounds in the decoctions of
Coptis chinensis-Scutellaria baicalensis
at different proportion producedby ‘Mixed decoction’ and ‘Single decoction mixture’
Han-Young Kim#, Jung-Hoon Kim*
Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University.
Yangsan, Gyeongnam 50612, Republic of Korea
ABSTRACT
Objective : The present study aimed to evaluate the change of the content of 7 active components in decoctions produced by various proportional pairs of Coptis chinensis Franch and Scutellaria baicalensis Georgi in ‘Mixed decoction (MD)’ and ‘Single decoction mixture (SDM)’.
Methods : The samples of MDs were prepared by decocting C. chinensis : S. baicalensis with the ratios of 10 g:10 g, 10 g:20 g, and 20 g:10 g. Those of SDMs were prepared by blending each single decoction from C. chinensis and S.
Baicalensis with the ratios of 1:1, 1:2, and 2:1. The samples were evaluated by high-performance liquid chromatography with statistical analyses.
Results : The analytical methods, which were optimized and validated, were reliably applied to present research. The content of all components in both MDs and SDMs at C. chinensis : S. baicalensis = 1:1 ratio were reduced compared with single herb decoction. The components from each compositional herb in MDs were proportionally increased with the ratio of original herb increased, but inversely proportional to paired herb. The contents of components in MDs were significantly lower than those in SDMs at all ratios, except for high content of baicalin at C. chinensis : S.
baicalensis = 2:1.
Conclusion : It was concluded that MDs and SDMs as well as the proportions of herbs could affect the contents of the components from original herbal medicines. These results provide the information for the quality control of herbal medicine combined C. chinensis with S. baicalensis. 1)
Key words : Coptis chinensis; Scutellaria baicalensis; active components; mixed decoction; single decoction mixture
Ⅰ. 서 론
황련(黄連)과 황금(黄芩) 배합은 《傷寒論》에서 처음 제시되
었으며, 二黃湯, 黃連阿膠湯, 葛根芩連湯, 黃連解毒湯, 瀉心湯 등의 한약 처방에서 구성되어 있는 배합의 일종이다1-4). 黄連은 황련 Coptis chinensis Franch (Ranunculaceae, 미나리아
*Corresponding author : Jung-Hoon Kim, Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University, 49, Busandaehak-ro, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea.
·Tel : +82-51-510-8456 ·Fax : +82-51-510-8456 ·E-mail : [email protected]
#First author : Han-Young Kim, Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University, 49, Busandaehak- ro, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea.
·Tel : +82-51-510-8456 ·Fax : +82-51-510-8456 ·E-mail : [email protected] ·Received : 09 April 2020 ·Revised : 18 may 2020 ·Accepted : 25 may 2020
재비과)의 뿌리줄기로 味苦, 性寒하며 心胃實熱을 清熱瀉火하는 효능으로 消穀善飢, 口乾口渴 증상을 치료하고, 黄芩은 황금 Scutellaria baicalensis Georgi (Lamiaceae, 꿀풀과)의 뿌 리로 味苦, 性寒하여 清熱燥濕, 瀉火解毒의 효능으로 清肺火 한다5).황련과 황금 배합이 구성되면 中二焦의 邪熱을 清泄함과 清熱燥濕, 瀉火解毒하는 효능이 증강되며1) 황련의 清熱止嘔 효능과 황금의 凉血安胎 효능이 相合하여 강화된 清熱安胎의 효능이 나타난다5).
이러한 황련과 황금 배합은 단일 약재의 효능에 변화를 주는 역할을 하기 때문에, 한약 처방을 구성하는 개별 약재 간 상호 작용을 연구하는데 중요한 단서가 된다. 기존의 연구에서 정상 랫드와 제2형 당뇨병이 유발된 랫드에 황련과 황금 개별 전탕 액과 혼합 전탕액을 각각 투여한 결과, 유익균의 성장촉진 및 유해균의 성장억제 작용이 개별 전탕 투여군보다 혼합 전탕 투여군에서 더 강하게 나타났다6). 백호가계지탕을 구성하는 약재 간 배합에 관한 연구에서도 단일 약재 전탕액 투여군보다 혼합 전탕액 투여군에서 항염, 항알러지 효능이 빠르게 발현 되었다7). 또한 황기 육계의 배합에 따른 면역활성 비교8), 백 개자, 나복자 및 두 배합 약물의 천식 동물 모델에 대한 효과9), 천식모델을 이용한 호도, 파고지 및 두 배합약물의 실험적 연 구10), Collagen Ⅱ-induced Arthritis 생쥐에 대한 오수유, 모과 및 배합약물의 관절염 억제 효과에 대한 연구11) 등에서 단일 약재 전탕액 투여군보다 혼합 전탕액 투여군의 효능평가가 높게 나타나 혼합 전탕 시 개별 약재 간 상호작용에 의해 효능이 향상되는 것으로 보고된다.
황련과 황금 배합의 성분학적 연구로는 해당 배합 중, 황금 유래 4종 성분의 HPLC 측정12), 황금과 황련 유래 11종 성분 HPLC 동시분석13), 황금-황련-황백 배합 추출물 총 9종 성 분의 HPLC 동시분석14), 그리고 UPLC-MS/MS을 활용한 7종 성분 프로파일링 분석15) 등이 보고되었다. 이러한 분석법을 바탕으로 황련과 황금 배합 비율에 따라 baicalin과 berberine 의 추출에 최적인 전탕법을 제시16)하였으며, H-NMR을 활용 하여 황금-황련 혼합 전탕 시 발생하는 침전물이 baicalin- berberine과 wogonoside-berberine 복합체에서 기인함을 규명한 연구17)도 이루어져 있다. 또한 황련과 황금 배합의 반응 메커니즘 연구18)로서 단일 약재 추출물과 황련과 황금 1:1 배합 비율 추출물에 대해 baicalin, berberine 2종의 지표성분을
HPLC 동시분석법으로 측정하였고, 혼합 전탕 시 두 성분을 더욱 효과적으로 추출할 수 있다고 보고하였다. 더불어 개별 전탕 혼합 방식으로 제조한 황련해독탕 혼합단미엑스제와 혼합 전탕 방식을 통해 제조되는 전탕액 간의 동등성평가 또한 HPLC 동시분석법을 기반으로 이루어져 있다19).
그러나 기 실행된 연구들은 충분한 수의 지표성분과 다양한 배합비율 및 전탕방법에 대해 이루어지지 않았다는 점에서 한 계가 있다. 따라서 다성분에 대한 동시분석법을 적용하여 복수 의 표적에 작용하는 한약의 상호작용을 파악할 필요가 있다20). 따라서 본 연구에서는 황련의 지표성분인 coptisine, palmatine, berberine, 황금의 지표성분인 baicalin, baicalein, wogonoside, wogonin 등 총 7종의 성분을 선정하여 HPLC를 이용한 동시분석법을 확립하였고, 이를 바탕으로 황련과 황금을 서로 다른 비율로 배합하여 조제한 혼합 전탕액 (mixed decoction)과 개별 전탕 혼합액 (single decoction mixture) 성분을 비교하였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험재료
HPLC 분석을 위해 지표성분인 coptisine, palmatine, berberine, baicalin, baicalein (이상 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.; Chengdu, Sichuan, China), wogonoside (Chem Faces; Wuhan, Hubei, China), wogonin (Wako Pure Chemical Industries Ltd.; Chuo-Ku, Osaka, Japan) 등을 구입하여 사용하였고, 각 지표성분들의 순도는 모두 98% 이상이었다. 각 지표성분의 화학구조는 Figure 1에 나타내었다.
분석에 사용한 HPLC 등급의 acetonitrile과 water, methanol는 J.T. Baker Inc (Center Valley, PA, USA)에서 구입하였고, trifluoroacetic acid (TFA)와 sodium dihydrogen phosphate는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 황련 (C. chinensis), 황금 (S.
baicalensis) 은 광명당제약 (울산, 대한민국)에서 규격품을 구입하였고, 부산대학교 한의학전문대학원 김정훈 교수의 동 정을 거쳐 확정하였다.
Figure 1. Chemical structures of seven standard compounds in Coptis chinensis-Scutellaria baicalensis combination.
2. HPLC 분석조건
주요 성분 함량은 auto-sampler, degasser, quaternary solvent pump, 및 diode-array detector로 구성된 Agilent 1200 (Agilent Technologies, CA, USA)로 분석하였다.
CAPCELL PAK ADME column (4.6 × 250 ㎜, 5㎛; Osaka soda, Japan)을 사용하여 혼합 성분을 분리하였으며, column 온도는 30℃를 유지하였다. 시료의 주입량은 10㎕이었고, UV 검출기의 파장은 250, 275, 350 ㎚로 설정하였다.
HPLC 분석에서 이동상은 유속 1.0 ㎖/min로 설정하였고, water (0.1% TFA 포함, A)와 acetonitrile (B)에 대해 기울 기용리법을 이용하여 0-30min (20-39%, B); 30-40min (39-55%, B); 40-45min (55-55%, B) 조건으로 분석하고 1분 후 (B)용매를 20%로 하고 9분간 유지하여 다음 분석을 준비하도록 하였다.
3. 표준용액의 조제
Coptisine, palmatine, berberine, baicalin, baicalein, wogonoside, wogonin 등 7종의 지표성분의 무게를 정확하게 측정하고 메탄올에 녹여 모두 1000 ㎍/㎖ 농도의 stock solution을 조제하여 4℃에 보관하였다. 사용 전에 희석하여 working solution을 조제하여 사용하였다.
4. 황련, 황금 전탕액 및 검액의 제조
혼합 전탕액 (mixed decoction)을 만들기 위해 황련과 황금 10 g:10 g 의 경우, 각 약재를 10 g씩 칭량하여 총 약재량을 20 g으로 하였고 10 g:20 g의 경우는 황련 10 g, 황금 20 g을 칭량, 20 g:10 g의 경우는 황련 20 g, 황금 10 g을 칭량하여 총 약재량을 30 g으로 혼합하였다. 혼합된 약재를 둥근바닥 플라스크에 넣고 500 ㎖의 1차 증류수를 추가하여 디지털 히 팅맨틀 (MS-DM; 미성과학기기㈜, 서울, 대한민국)을 이용 해서 100℃에서 2시간동안 환류추출하였다. 각 탕액을 1 ㎖씩 취하여 vial에 옮겨 담았고, 여기에 HPLC등급의 water와 methanol을 1:1로 혼합한 혼합용매 4 ㎖을 추가하여 혼합한 후, 0.2 ㎛ syringe filter (BioFact, 대전, 대한민국)로 여과 하여 검액으로 사용하였다.
개별 전탕 혼합액 (single decoction mixture)을 만들기 위해서 황금, 황련을 각각 10g씩 정확하게 칭량하여 500 ㎖의 1차 증류수와 함께 둥근바닥 플라스크에 넣고 디지털 히팅맨틀 (MS-DM; 미성과학기기㈜, 서울, 대한민국)을 이용해서 100℃
에서 2시간동안 환류추출하였다. 1:1 배합 혼합액은 각 개별 약재 탕액을 1 ㎖씩 정확히 취하고 HPLC등급의 water 1 ㎖과 methanol 2 ㎖를 첨가하여 제조하였고, 1:2 배합 혼합액은 각 개별 약재 탕액을 1 ㎖, 2 ㎖씩 취한 후, HPLC등급의 methanol 2 ㎖를 첨가하여 원액의 1/5배로 희석된 농도로 만든 후 0.2 ㎛ syringe filter (BioFact, 대전, 대한민국)로 여과하여 검액으로 사용하였다.
5. 분석법 검증
1) 직선성 (linearity), 검출한계 (limit of detection) 및 정량한계 (limit of quantification)
7종의 지표성분에 대하여 7가지 농도에 대한 피크면적을 토대로 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선은 상관계수 (correlation coefficient, r2)를 구하여 직선성을 판단하였다.
지표성분의 검출한계 (limit of detection) 및 정량한계 (limit of quantification)는 각각 신호 대 잡음비 (signal to noise ratio)를 3과 10으로 설정해서 계산하였다.
2) 정밀성 (precision) 측정
정밀성 (precision)은 지표성분에 대한 3가지 농도 (저농도, 중농도, 고농도)로 준비된 검액을 하루 내에 3회 반복 측정하 거나 (일내 정밀성, intra-day precision), 3일 동안 측정한 (일간 정밀성, inter-day precision) 결과를 상대표준편차 (relative standard deviation, %)를 통해 평가하였다.
3) 회수율 (recovery) 측정
회수율 (recovery)을 통한 정확성 (accuracy) 측정은 각각 서로 다른 3가지 농도의 지표성분 (저농도, 중농도, 고농도)을 시료에 첨가하고 분석 조건에 따라 시료를 분석하여 농도를 측정하였다. 농도가 측정된 시료에서 첨가한 지표성분의 농도를 구한 후, 다음의 공식을 통하여 계산하였다.
Recovery(%)
= [(detected concentration–initial concentration) / spiked concentration) × 100]
4) 안정성 (stability) 평가
전탕액 및 혼합액의 안정성 평가를 위해 황금과 황련 탕액 (개별 전탕 혼합액 및 혼합 전탕액, 1:1 비율)을 10 ㎖씩 취 하여 코니칼 튜브에 옮기고 5℃ 온도에서 일정기간 보관한 후, HPLC 분석 직전에 검액화한 후 분석하였다. 검액의 안정성 평가를 위해 위의 각 탕액을 ‘재료 및 방법-4. 황련, 황금 전 탕액 및 검액의 제조’에서 제시한 방법에 따라 검액화하여 HPLC의 autosampler (5℃) 상에서 일정 시간 동안 유지한 뒤 분석하였다.
개별 전탕 혼합액의 탕액과 검액의 안정성은 4시간 단위로 3회, 12시간 단위로 4회 분석하였고, 혼합 전탕액의 탕액과 검액은 6시간 단위로 2회, 12시간 단위로 3회 반복 분석하였다.
정해진 시간에 분석된 각 성분의 피크면적을 계산하여 안정성을 평가하였다.
6. 통계분석
Tukey test를 통해 황금-황련 배합 비율별 전탕액 실험군 간의 지표성분 함량을 비교하여 유의성을 표시하였다 (*: p<
0.05, **: p< 0.01, ***: p< 0.001). 또한 혼합 전탕과 개별 전탕 혼합액에서의 지표성분 함량 간의 차이에 대해 t-test를 시행하여 유의성을 표시하였다 (*: p< 0.05, **: p< 0.01,
***: p< 0.001). 다중회귀분석 (multiple regression analysis)
을 통해 황금과 황련의 배합 비율별 성분함량 변화에 대한 상 관성을 분석하였다. 모든 통계분석은 통계프로그램인 R (ver.
3.6.1)을 이용하여 진행되었다.
Ⅲ. 결 과
1. 분석조건의 확립
황련과 황금의 지표성분인 coptisine, palmatine, berberine, baicalin, baicalein, wogonoside, wogonin 등 총 7종의 성 분에 대한 동시분석을 실시하기 위해 컬럼, 이동상의 기울기 용리 조건과 종류, UV 검출파장을 최적화하여 분석을 진행하 였다.
컬럼은 C18 (250 × 4.6 ㎜, 5 ㎛)과 ADME (250 × 4.6 ㎜,
5㎛) column을 비교하였고, 이동상은 B 용매로 acetonitrile을 사용하고 A 용매로 water에 20 mM (w/v)sodium dihydrogen phosphate, 0.1% (v/v) TFA 등 다양한 modifier가 적용된 조건을 비교하였다21-23). 먼저 20 mM (w/v) sodium dihydrogen phosphate의 (A)이동상 조성에서 C18 column으로 분석조건을 탐색하였으나22), wogonoside와 황련:황금 비 1:1 개별 전탕 혼합 샘플의 미확인 피크 간의 분리도가 부적합하여 기존 C18
작용기 대신에 adamantyl 작용기가 코팅된 ADME column 으로 교체함으로써 분리능을 향상시켰다 (Figure 2A). 이후 황련의 alkaloid 성분들의 피크에서 관찰되는 끌림현상 (tailing)으로 인한 비대칭성을 개선하기 위하여 20 mM (w/v) sodium dihydrogen phosphate의 (A)이동상 조성을 0.1%
(v/v) TFA로 교체하여 각 peak별 대칭성 (symmetry)을 향상 시키는 것으로 최적화된 분석조건을 결정하였다 (Figure 2B).
Figure 2. Comparison of HPLC chromatograms of ‘Single decoction mixture’ at the ratio of 1:1 analyzed by C18 and ADME column at the detection wavelength of 350nm (A). Comparison of symmetries of seven standard compounds in HPLC chromatograms analyzed by sodium dihydrogen phosphate (SDP) and trifluoroacetic acid (TFA) at the detection wavelength of 275nm (B-a) and 350nm (B-b).
기울기용리 조건은 0.1% (v/v) TFA가 함유된 water (A)와 acetonitrile (B)을 이용하여 최적의 분리조건을 0-30min (20-39%, B), 30-40min (39-55%, B), 40-45 min (55- 55%, B)로 결정하였다. 또한 지표성분들의 최대흡광파장을
확인하여 baicalin, baicalein, wogonoside, wogonin은 275 ㎚, coptisine, palmatine, berberine은 350 ㎚ 파장에서 각각 피크면적을 측정하였다. 7개의 지표성분들은 주어진 분석 조건에서 완전하게 분리되었다 (Figure 3).
Figure 3. HPLC chromatograms of standard mixture (A), the decoction of S. baicalensis (B), the decoction of C. chinensis (C), ‘Mixed decoction’
(C. chinensis:S. baicalensis = 1:1) (D), and ‘Single decoction mixture’ (C. chinensis:S. baicalensis = 1:1) (E). All chromatograms were analyzed at the detection wavelength of 275 ㎚. 1. Baicalin, 2. coptisine, 3. wogonoside, 4. palmatine, 5. berberine, 6. baicalein, 7. wogonin.
2. 분석법 검증
1) 직선성, 범위, 검출한계 및 정량한계
7개의 지표성분의 검량선에 대한 직선성은 상관계수 (r2) 으로 표현되며, 0.9997에서 1.0000의 범위에 있는 것으로 확인 되었다. 검출한계는 0.16-0.68 ㎍/㎖이고 정량한계는 0.55- 1.37 ㎍/㎖였다 (Table 1).
2) 정밀성 (Precision) 평가
각 지표성분에 대한 일내정밀성과 일간정밀성은 상대표준 편차 (RSD, %)값으로 표현되었고, 일내정밀성은 3개의 농도에 대해 3.5% 미만으로 측정이 되었으며, 일간정밀성은 3개의 농도에 대해 모두 3% 미만으로 측정되었다 (Table 2).
Compound Linear equation r2 Linear range (㎍/㎖) LOD* (㎍/㎖) LOQ† (㎍/㎖)
Coptisine y = 33.995x + 17.742 1.0000 4.38-140.00 0.16 0.55
Palmatine y = 41.369x + 11.701 1.0000 1.88-60.00 0.23 0.78
Berberine y = 33.843x + 123.540 1.0000 21.88-700.00 0.68 1.36
Baicalin y = 31.093x + 114.450 0.9997 21.88-700.00 0.41 1.37
Wogonoside y = 34.971x + 27.490 1.0000 6.25-200.00 0.39 0.78
Bacalein y = 60.525x - 16.999 1.0000 1.88-60.00 0.28 0.94
Wogonin y = 57.555x + 5.173 0.9999 0.63-20.00 0.31 1.04
*LOD, limit of detection, †LOQ, limit of quantification
Table 1. Linear equations, correlation coefficients (r2), LOD, and LOQ values for the seven marker compounds in the decoction of Coptis chinensis and Scutellaria baicalensis
Compound Conc.
(㎍/㎖)
Intraday (n = 3) Interday (n = 3)
Detected conc.
(㎍/㎖) RSD (%) Accuracy (%) Detected conc.
(㎍/㎖) RSD(%) Accuracy (%)
Coptisine
17.50 17.91 2.19 102.35 18.46 1.91 105.46
35.00 36.08 1.87 103.08 36.51 1.14 104.31
70.00 71.60 0.26 102.29 72.64 0.46 103.77
Palmatine
7.50 7.54 2.51 100.57 7.72 1.71 103.00
15.00 15.15 1.66 101.03 15.41 1.03 102.74
30.00 30.25 0.35 100.82 30.65 0.75 102.17
Berberine
87.50 95.37 2.07 109.00 97.95 1.53 111.94
175.00 185.28 1.84 105.87 187.23 1.03 106.99
350.00 360.42 0.21 102.98 365.15 0.48 104.33
Baicalin
87.50 88.10 0.96 100.69 89.96 1.77 102.81
175.00 178.16 1.11 101.81 178.37 1.17 101.93
350.00 357.35 1.37 102.10 355.45 0.49 101.56
Wogonoside
25.00 25.39 0.08 101.55 25.94 1.64 103.77
50.00 51.30 1.05 102.60 51.34 1.22 102.69
100.00 102.47 1.23 102.47 101.75 0.55 101.75
Bacalein
7.50 7.36 3.46 98.18 7.39 2.93 98.57
15.00 14.47 1.70 96.49 14.60 1.59 97.35
30.00 29.10 1.71 96.99 29.11 0.84 97.03
Wogonin
2.50 2.53 0.66 101.35 2.58 2.73 103.05
5.00 5.05 1.15 101.02 5.07 1.95 101.42
10.00 10.17 1.24 101.68 10.10 0.82 101.03
Conc., concentration. RSD (%), relative standard deviation (%) = (SD/mean)×100.
Table 2. Intra- and Inter-day precisions of the seven marker compounds in the water extract of C. chinensis and S. baicalensis
3) 회수율 (Recovery) 평가
각 지표성분의 회수율은 97.36%-109.21%의 범위로 측정되었으며, 상대표준편차 (RSD, %)는 4% 미만으로 측정되었다 (Table 3).
Compound Initial conc.
(㎍/㎖)
Spiked conc.
(㎍/㎖L)
Detected conc.
(㎍/㎖)
Recovery (%)
RSD (%)
Coptisine 64.52
17.50 83.58 103.61 3.22
35.00 101.28 103.95 0.30
70.00 136.97 101.84 1.81
Palmatine 34.46
7.50 42.30 97.36 0.91
15.00 50.25 103.03 0.86
30.00 65.70 102.87 0.90
Berberine 200.60
87.50 294.41 102.93 3.52
175.00 387.27 105.85 0.45
350.00 567.19 103.46 1.38
Baicalin 420.22
87.50 526.16 109.21 2.00
175.00 616.47 105.38 2.73
350.00 782.41 98.67 2.50
Wogonoside 102.60
25.00 131.69 108.47 2.61
50.00 158.37 107.19 1.28
100.00 208.89 103.75 1.01
Bacalein 24.91
7.50 32.84 107.07 0.52
15.00 41.00 105.67 2.06
30.00 56.36 103.88 1.99
Wogonin 7.98
2.50 10.73 104.09 1.85
5.00 13.32 102.31 2.23
10.00 18.64 105.11 0.73
Conc., concentration. RSD (%), relative standard deviation (%) = (SD/mean)×100.
Table 3. Recovery of the seven marker compounds in the water extract of C. chinensis and S. baicalensis (n = 3)
4) 안정성 (stability) 평가
시간경과에 따른 성분 피크면적의 변화 추세는 크게 coptisine, berberine, baicalin 군과 palmatine, wogonoside, wogonin 군, 그리고 baicalein으로 구분되는 경향성을 보였다.
또한 모든 성분에서 개별 전탕 혼합군이 혼합 전탕군보다 초기 피크 면적이 높게 측정되었으며 혼합 전탕군 보다 개별 전탕 혼합군에서, 탕액군보다 검액군에서 피크면적값의 변화가 큰 결과를 보였다 (Figure 4).
3. 전탕방법 및 배합비율 별 성분함량비교
황금과 황련 전탕액 내 지표성분 분석 결과, 개별 전탕 혼 합군에 비해 혼합 전탕군에서 각 성분의 함량이 대체로 낮게 측정되었다. 통계적 유의성은 황련과 황금을 1:1로 배합된 전 탕액 내 wogonoside를 제외한 모든 성분, 2:1비율의 전탕액 및 혼합액 내 palmatine, baicalin, 1:2비율의 전탕액 및 혼 합액 내 palmatine에서 나타났으며 모두 혼합 전탕군에서 낮은 측정값을 보였다. 그러나 baicalin은 2:1비율의 혼합 전탕군
에서 개별 전탕 혼합군보다 높게 측정되었다 (Table 4).
배합비율 별 비교에서는 단일 전탕에 비해 황련과 황금을 1:1로 배합한 개별 전탕 혼합군에서는 berberine과 baicalin 이 유의적으로 감소하였고 혼합 전탕군에서는 coptisine, berberine, baicalin, baicalein이 감소하였다. 황련과 황금이 2:1비율인 경우, parmatine, berberine의 증가와 baicalin, baicalein의 감소를 보였으며, 1:2비율에서는 개별 전탕 혼합 군과 혼합 전탕군에서 공통적으로 berberine의 감소와 baicalin, wogonoside, baicalein, wogonin의 증가가 관찰되었다. 또한 1:1비율이 2:1비율로 될 경우, 개별 전탕 혼합군에서 palmatine 이 증가하였고 baicalin은 감소하였으며, 혼합 전탕군에서는 coptisine, palmatine, berberine이 증가하였고 baicalin이 감소하였다. 1:1비율이 1:2비율로 됨에 따라 개별 전탕 혼합 군과 혼합 전탕군 모두 baicalin, wogonoside, baicalein, wogonin이 증가하였고, 혼합 전탕군에서만 coptisine이 증가 하였다. 2:1비율과 1:2비율의 비교에서는 황련과 황금 약재 배합 비율에 따라서 각 약재 유래 성분의 함량이 높게 측정되 었다.
Figure 4. Stabilities of the seven standard compounds in the ‘Single decoction mixture’ (C. chinensis : S. baicalensis = 1:1, A) and the
‘Mixed decoction’ (C. chinensis : S. baicalensis = 1:1, B). ‘Preparation’ means the prepared decoction in vial by sample preparation methods which was stored in the autosampler tray (5℃). ‘Decoction’ means the decocted sample in a conical tube which was stored in refrigerator (5℃).
Sample Decoction
†Average content (㎍/㎖)
p-value
1:0 1:1 2:1 1:2
Coptisine
SDM 67.37±5.67 60.04±9.81# 67.13±9.00 49.88±8.87 -
MD 67.37±5.67 38.45±3.20 68.36±4.01 49.10±1.93 a***, c**, d***, e*, f**
Palmatine
SDM 40.07±1.55 41.30±2.18## 79.86±4.05## 43.10±2.05## b***, d***, f***
MD 40.07±1.55 35.84±1.10 68.17±1.90 36.31±2.12 b***, d***, f***
Berberine
SDM 218.03±11.59 148.09±29.04## 157.01±11.98 110.94±30.32 a*, b*, c**
MD 218.03±11.59 76.93±12.35 167.56±13.02 92.74±11.02 a***, b**, c***, d***, f***
Table 4. The average content of the seven marker compounds in the water extract of C. chinensis and S. baicalensis (n = 3)
Sample Decoction
†Average content (㎍/㎖)
p-value
1:0 1:1 2:1 1:2
Baicalin SDM 407.07±11.33 323.04±37.74# 92.97±8.01 647.06±31.06 a*, b***, c***, d***, e***, f***
MD 407.07±11.33 243.32±21.02 174.68±12.78### 653.76±40.75 a***, b***, c***, d*, e***, f***
Wogonoside
SDM 89.50±3.97 87.64±3.62 85.70±2.97 174.91±6.80 c***, e***, f***
MD 89.50±3.97 84.81±7.65 79.91±8.43 167.76±12.08 c***, e***, f***
Baicalein
SDM 21.74±1.52 19.38±1.06## < LOQ 35.45±3.19 c***, e***
MD 21.74±1.52 14.82±0.99 11.81±0.50 32.69±1.48 a***, b***, c***, e***, f***
Wogonin
SDM 2.20±0.24 2.17±0.22# 1.97±0.18 4.36±0.44 c***, e***, f***
MD 2.20±0.24 1.72±0.11 1.63±0.22 3.76±0.14 b*, c***, e***, f***
SDM, single decoction mixture; MD, mixed decoction.
†Average content (μg/mL) of the marker compounds are represented as mean content ± standard deviation.
a,the difference of contents between 1:0 (C. chinensis or S. baicalensis only) and C. chinensis:S. baicalensis = 1:1 with significance at
*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
b, the difference of contents between 1:0 and 2:1 with significance at *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
c, the difference of contents between 1:0 and 1:2 with significance at *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
d, the difference of contents between 1:1 and 2:1 with significance at *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
e, the difference of contents between 1:1 and 1:2 with significance at *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
f, the difference of contents between 2:1 and 1:2 with significance at *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
#, the difference of content between SDM and MD with significance at *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
4. 약재 배합 비율과 성분함량 간 상관성 분석
개별 전탕 혼합군에서 황금 성분인 baicalein, baicalin, wogonin, wogonoside는 모두 황금의 비율에 비례하였다.
또한 황련의 비율에 반비례하여 증가하였는데, 특히 baicalein 과 baicalin은 다른 두 성분에 비해 큰 유의성을 보였다. 황련
성분인 berberine, coptisine palmatine은 모두 황련 비율에 비례하여 증가하였다. 그러나 황금의 비율에 대해서는 berberine, coptisine은 반비례하는 경향을 보이는데 반해, palmatine은 영향을 받지 않는 것을 관찰하였다 (Figure 5 및 Table 5).
Figure 5. Response surface plots of the seven standard compounds in C. chinensis-S. baicalensis combination of single decoction mixture.
Compound Estimated coefficient
Multiple R2 p -value Intercept Coptis chinensis Scutellaria baicalensis
Baicalein 4.02* -3.47* 17.72* 0.9832 < 0.001
Baicalin 127.55*** -157.05*** 323.53*** 0.9694 < 0.001
Wogonin 0.08 -0.12 2.18*** 0.9762 < 0.001
Wogonoside 1.99 -1.90 87.46*** 0.9964 < 0.001
Berberine 101.85** 78.51** -53.54* 0.6597 < 0.01
Coptisine 24.06* 33.57*** -8.75 0.7116 < 0.001
Palmatine -0.58 39.93*** 1.51 0.9933 < 0.001
Table 5. Multiple regression analysis of the seven standard compounds in C. chinensis-S. baicalensis combination of single decoction mixture
이러한 특성은 혼합 전탕군에서도 대체로 유사했으나, 황금 성분인 baicalein, wogonin, wogonoside에 대한 황련의 반 비례성과, 황련 성분인 berberine, palmatine에 대한 황금의
반비례성이 개별 전탕 혼합군에 비해 상대적으로 두드러지는 것을 관찰하였다 (Figure 6 및 Table 6).
Figure 6. Response surface plots of the seven standard compounds in C. chinensis-S. baicalensis combination of mixed decoction.
Compound Estimated coefficient
Multiple R2 p -value Intercept Coptis chinensis Scutellaria baicalensis
Baicalein 4.83*** -4.97*** 16.34*** 0.9891 < 0.001
Baicalin 85.08 -116.19*** 326.88*** 0.9744 < 0.001
Wogonin 0.27* -0.29** 1.88*** 0.9843 < 0.001
Wogonoside 5.31 -4.79 83.88*** 0.9864 < 0.001
Berberine 89.91** 83.78*** -62.64** 0.7585 < 0.01
Coptisine 19.61* 34.18*** -9.14 0.7894 < 0.001
Palmatine 3.88* 34.08*** -1.88 0.9895 < 0.001
Table 6. Multiple regression analysis of the 7 standard compounds in C. chinensis-S. baicalensis combination of mixed decoction
Ⅳ. 고 찰
본 논문에서는 황련 성분 3종, 황금 성분 4종을 동시 분석할 수 있는 HPLC 분석법을 개발하고 황련과 황금의 배합 비율 별 개별 전탕 혼합액, 혼합 전탕액 간 지표성분을 비교하였다.
이를 바탕으로 전탕방법과 배합비율의 차이가 황련과 황금으로 구성된 추출물의 지표성분 함량에 미치는 영향을 파악하고자 하였다.
전탕방법별 차이는 혼합 전탕군에서 개별 전탕 혼합군에 비해 각 성분의 함량이 낮게 측정되었는데 황련:황금 비 1:1 에서 통계적 유의성은 wogonoside를 제외한 모든 성분에서 관찰되었다. 이러한 혼합 전탕에 따른 특성은 계지, 작약, 감 초의 비율 변화가 각 약재의 화학적 성분 추출률에 미치는 영 향을 연구한 논문24) 및 열수추출 과정에서 삽주, 백출 (큰꽃삽 주), 북창출 배합이 감초 성분의 추출률에 미치는 영향을 연구 한 논문25)에서 서술한 바와 같이, 혼합 전탕으로 상대 약재의 비율이 증가함에 따라 개별 약재로부터 용매로의 유효성분에 대한 질량이동이 저해되고 각 성분들의 상호작용에 의해 용해 도가 감소한다는 해석으로 설명할 수 있다. 또한 2:1의 비율 에서는 혼합 전탕군의 baicalin 함량이 개별 전탕 혼합군에 비해 더 높게 측정되었는데 황금, 황련 배합 전후의 주요 화학 성분 함량변화에 대한 연구26)에 따르면 특정 비율에서의 혼합 전탕에 의한 성분 간 상호작용이 baicalin의 추출을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 이러한 사실로 보아 본 연구의 실험법을 적용하여 당귀와 황기의 배합변화가 DPPH 자유기 소거에 미 치는 영향에 대한 연구27), 당귀보혈탕의 배합비율에 따른 대 장암 세포주 HCT116의 세포사멸 효과에 대한 연구28), 그리고 배합비율에 따른 좌금환의 간보호 효과에 대한 연구29) 등 복 수의 약재들을 특정 비율로 배합 시 효능평가가 높게 나타났 음을 규명한 연구들의 결과에 대해 성분학적 해석이 가능할 것으로 판단된다.
성분별로 살펴보면 전탕방법에 관계없이 황련과 황금의 단일 전탕에 비해 1:1비율에서 공통적으로 berberine과 baicalin이 유의적으로 감소하였다. 다만 혼합 전탕군에서 개별 전탕 혼합 군보다 유의성 있게 감소하였는데, 이러한 결과는 충분한 시간 하에서 약재들이 혼합되어 전탕됨에 따라 원활한 성분 간 상호 작용이 발생하였기 때문인 것으로 사료된다.30) 이와 같은 결 과는 약재 간 배합에 관한 연구에서 단일 약재 전탕액 투여군 보다 혼합 전탕액 투여군의 효능이 더욱 우수함을 규명6-11)한 결과에 비추어 유효성분의 함량이 감소하는 혼합 전탕방식보 다는 개별 전탕방식이 권장되는 것으로 상반된 결과라 할 수 있다. 그러나 단일약재가 아닌 복수약재의 혼합으로 처방되는 한약의 효능은 유효성분의 함량뿐만 아니라 구성비에 의해서도 나타날 수 있고 효능 평가 상 단순히 함량 의존적으로 나타나지 않을 가능성도 있기에31) 본 연구의 실험대상인 전탕방법 및 배합비율별 전탕액에 대한 효능평가가 후속 연구로서 요구된다.
또한 coptisine과 berberine, baicalein의 경우 1:1비율을 제외한 나머지 비율에서 전탕방법 간 지표물질 농도값의 평균은 큰 차이가 없으나 혼합 전탕군에 비해 개별 전탕 혼합군에서 낮은 유의성으로 평가되었는데, 이러한 결과는 개별 전탕 혼 합군에서 측정된 3반복 실험값의 편차가 크게 발생한 것이 원 인으로 추정된다.
개별 전탕 혼합군의 큰 편차는 낮은 안정성에서 기인하는데, 혼합 전탕군에 비해 약재 성분 간 상호작용이 일어날 수 있는 전탕 시간이 상대적으로 부족한 것이 그 원인으로 사료된다.
그리고 palmatine은 개별 전탕 혼합군에서 황련의 단일 전탕과 1:1비율에 비해 1:2비율로 조절 시 오히려 증가하였다. 이를 황련 alkaloid에 속하는 coptisine, berberine과 palmatine의 화학적 구조의 차이를 통해 결과를 해석해보면 benzodioxole 고리가 있는 coptisine, berberine이 methoxy 작용기만을 갖는 palmatine보다 강한 분자 상호작용을 보인다32)는 점에서 황금 flavonoid와의 상호작용이 coptisine, berberine에서 주로 이루어져 상대적으로 palmatine의 약재로부터 용매로의 질량이동이 증가할 수 있는 여건을 조성하였을 것으로 추정된다.
그러나 이러한 현상은 혼합 전탕군에서는 관찰되지 않아, palmatine과 황금 flavonoid 간 상호작용은 충분한 시간의 혼합 전탕 조건에서 발현된다고 할 수 있다.
본 연구 결과 단일 전탕에 비해 황련과 황금을 1:1 비율로 배합하여 조제 시, 성분 간 상호작용으로 지표성분들의 함량이 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 황련과 황금을 2:1 비율과 1:2 비율로 배합한 경우에는 늘어난 각 약재의 비율에 따라 대체로 해당 약재의 지표성분의 증가에 유의적인 영향을 주었고 상대 약재의 지표성분에 대해서는 감소시키는 경향을 보였다.
다만 지표성분 간 증감의 정도에 차이가 존재하고 1:2비율의 혼합 전탕군에서 황금의 양이 증가했음에도 황련의 coptisine 이 증가한 것과 같이, 상대 약재의 지표성분을 오히려 증가시 키는 경우도 있어 약재 배합비율의 조절로는 개별 지표성분의 조절은 어려울 것으로 사료된다. 또한 2:1비율의 혼합 전탕군 에서 baicalin이 개별 전탕 혼합군 보다 높게 측정된 것처럼, 서로 다른 전탕방법에 의해 지표성분의 차이가 발생한다. 이는 개별 전탕 혼합 방식으로 제조되는 혼합단미엑스제와 혼합 전탕 방식을 통해 제조되는 전탕액 간의 동등성에 영향33)을 초래할 수 있으므로, 향후 개별 전탕 혼합액과 혼합 전탕액 간에 보다 높은 동등성의 확보를 위한 연구가 필요하다.
Ⅴ. 결 론
본 논문에서는 황련 성분 3종, 황금 성분 4종을 동시 분석할 수 있는 HPLC 분석법을 개발하고 황련과 황금의 배합 비율별 및 개별 전탕 혼합법과 혼합 전탕법 간의 7종 지표성분 함량 차이를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 본 연구에서 설정한 분석법은 정밀성 (precision), 회수율 (recovery), 반복성 (repeatability)을 충족시켰고, 신뢰 성 있게 황련과 황금 배합 전탕 추출물에 대한 7개의 지 표성분의 정량에 적용될 수 있었다.
2. 혼합 전탕군과 개별 전탕 혼합군 모두 황련과 황금을 1:1 비율로 배합하여 조제 시, 지표성분들의 함량이 감소 하는 것을 확인하였고 2:1 비율과 1:2 비율의 경우에는 1:1 비율 대비 늘어난 각 약재의 비율에 따라 대체로 해당 약재의 지표성분은 증가시키고, 상대 약재의 지표성분에 대해서는 감소시키는 경향을 보였다.
3. 혼합 전탕법에서 개별 전탕 혼합법에 비해 대체로 각 성 분의 함량이 낮게 측정되었으며 1:1비율에서 wogonoside 를 제외한 모든 성분, 2:1비율에서 palmatine, 1:2비 율에서 palmatine이 통계적 유의성을 보였고, 2:1비율 에서는 baicalin의 함량이 개별 전탕 혼합법보다 혼합 전탕법에서 높게 측정되었다.
본 연구 결과를 바탕으로 황련과 황금 배합 처방에 대한 전 탕방식 및 배합비율별 성분차이를 파악하는 참고자료로 활용 할 수 있을 것으로 판단한다.
감사의 글
이 과제는 부산대학교 기본연구지원사업 (2년)에 의하여 연구되었음.
References
1. Oh G (吳謙). Eochan Uijong geumgam [御纂醫宗金鑑].
Seoul : Bubin munhwa Publishers Co. 2006 : 428.
2. Jang JG (張仲景). Sanghannon translation and interpretation [傷寒論譯釋]. Seoul : Jibmundang Publishers Co. 2005 : 191, 564.
3. Wang D (王燾). Oedae biyo [外臺秘要]. Beijing : People's Medical Publishers Co. 1955 : 72.
4. Kwak DR. Geumgwe yoryak translation [金匱要略譯 解] Seoul : Sungbo Publishers Co. 2002 : 406.
5. Bei QH. A collection of traditional Chinese medicine herb pair [中药药对大全]. Beijing : China Press of Traditional Chinese Medicine. 1996 : 111-2.
6. Jun Xu. Study on the interaction between scurellaria- coptis herb couple and intestinal bacteria. Master’s degree. Nanjing Univ. of Chinese medicine, Nanjing, China. 2014.
7. Peng P，Tian RH，Du J，Duan JJ，Li JS，Zhang B.
Quality characterization analysis of single decoction and merger decoction of Baihu and Guizhi. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2018 ; 43(16) : 3263-9.
8. Jung DY, Ha HK, Lee HY, Lee NH, Shin HK.
Comparative analysis on immune response of combination with Astragali Radix and Cinnamomi Cortex. Kor. J. Herbology 2011；26(4)：187-94.
9. Kim CM, Lee YC, Lee JC. The Effects of Sinapis Semen, Raphani Semen, and mixture decoction on the asthmatic mouse model. Kor. J. Herbology 201 3；28(6)：15-23.
10. Kwon TH, Lee YC, Lee JC. The synergistic effect of Juglans sinensis, Psoralea corylifolia, and their combination on the asthmatic murine model. Kor.
J. Herbology 2009；24(2)：39-48.
11. Park DJ, Lee YC, Lee JC. Inhibitory effect of a decoction composed of Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. and Chaenomeles sinensis Koehne and its component herbal medicines on collagen Ⅱ- induced arthritis mice. Kor. J. Herbology 2014；
29(4)：35-44.
12. Sheng JQ, Zhang CH, Xiong SP, Yu M, Tu XY, Chang YF, Deng MZ. HPLC determination of four constituents from extract of herb pair of Radix Scutellariae and Rhizoma Coptidis. Zhongyao Xinyao Yu Linchuang Yaoli. 2016 ; 27(2) : 259-62.
13. Hou XZ，Zhang ZQ，You CX，Yang C，Liang S，
Bao FW. HPLC determination of 11 constituents in combination extracts of Coptidis Rhizoma and Scutellariae Radix. Chin J Pharm Anal. 2013 ; 33(1) : 57-62.
14. Su JH，Zhang C，Sun L, Wang MZ，Gu BR.
Simultaneous determination of nine components in couplet medicine Scutellariae Radix－Coptidis Rhizoma－Phellodendri Chinensis Cortex of Huanglian shangqing tablets by HPLC. Chin J Pharm Anal. 2015 ; 35(11) : 1940-5.
15. Wang YL，Liu W，Yang DB，Qing YJ，Du P，Jin Y. UPLC-MS/MS Fingerprint of Coptidis Rhizoma- Scutellariae Radix herbal pair. Zhongguo Shi Yan Fang Ji Xue Za Zhi. 2017 ; 23(13) : 80-5.
16. Liu R. The study of Rhizoma Coptidis and Radix Scutellariae extracted alone or mixed. Asia-Pacific Traditional Medicine. 2018 ; 14(5) : 65-6.
17. Jing RW. Takashi T, Hong Z, Isao KN, Zhi HJ.
Formation and conformation of baicalin–berberine and wogonoside–berberine complexes. Chem Pharm Bull. 2012 ; 60(6) : 706–11.
18. You L, Wu XM, Chi ZL. Compatibility mechanism of traditional Chinese medicine Coptis Chinensis Franch and Scutellaria Baicalensis Georgi. Zhongguo Zhong yi yao ke ji. 2018 ; 25(5) : 672-4.
19. Lee JB, Choi HM, Kim JB, Kim JO, Moon SO, Lee HD. Evaluation on pharmacological effects and compound contents of Hwangryunhaedok-tang formulation for tablet. Kor. J. Herbology. 2018；
33(2)：9-18.
20. Zhou X, Seto SW, Chang D, Kiat H, Razmovski- Naumovski V, Chan K, Bensoussan A. Synergistic effects of Chinese herbal medicine: A Comprehensive Review of Methodology and Current Research.
Front. Pharmacol. 2016 ; 12(7) : 201.
21. Su JH, Zhang C, Sun L, Wang MZ, Gu BR.
Simultaneous determination of nine components in couplet medicine Scutellariae Radix－Coptidis Rhizoma－Phellodendri Chinensis Cortex of
Huanglian shangqing tablets by HPLC. Chin J Pharm Anal. 2015 ; 35(11) : 1940-5.
22. Chen B, Yi AC, Wang N. Determination of berberine hydrochloride in Shangqing pills by HPLC. Central South Pharmacy. 2008 ; 6(6) : 719-21.
23. Yang HJ, Weon JB, Ma JY, Ma CJ. Simultaneous analysis of three marker components in Hwangryunhaedok-tang by HPLC-DAD. Yakhak Hoeji. 2011 ; 55(1) : 64-8.
24. Kim JH, Ha WR, Park JH, Lee G, Choi G, Lee SH, Kim YS. Influence of herbal combinations on the extraction efficiencies of chemical compounds from Cinnamomum cassia, Paeonia lactiflora, and Glycyrrhiza uralensis, the herbal components of Gyeji-tang, evaluated by HPLC method. J Pharm Biomed Anal. 2016 ; 10(129) : 50.
25. Kim JH. Chemical influences of the rhizomes of Atractylodes japonica, A. macrocephala, or A.
chinensis on the extraction efficiencies of chemical compounds in the roots and rhizomes of Glycyrrhiza uralensis during hot-water extraction.
Kor. J. Herbology. 2019；34(5)：39-47.
26. Zhang ZW, Zhang NN, Li YM. Content change of main chemical composition before and after compatibility of Scutellaria baicalensis and Coptis chinensis. Zhongguo Shi Yan Fang Ji Xue Za Zhi.
2012 ; 18(24) : 58.
27. Kang SA, Oh MS, Kim DR, Kang JU, Kim WN, Chang MS, Park SK. Compositions of Astragali Radix and Angelicae Radix by DPPH radical scavenging activity. Kor. J. Herbology. 2006；
21(1)：17-24.
28. Kim BW, Yun HJ, Yun HJ, Kim CH, Park SD. Effect of Dangguibohyultang and its combinations on apoptosis in human colorectal adenocarcinoma HCT116 cells. Kor. J. Herbology. 2006；21(2)：
37-46.
29. Choi OC, Lai YS, Park SD. Effect of Joagumhwan and its components on acetaminophen induced hepatoxicity in rats. Kor. J. Herbology. 2004；
19(4)：67-79.
30. Lei YL, Sun L, Yan H, Wang WP, Formation rules of baicalin-berberine complex. Chinese Traditional Patent Medicine. 2018 ; 40(3) : 577-82.
31. Caesar LS, Cech NJ. Synergy and antagonism in natural product extracts: when 1 + 1 does not equal 2. The Royal Society of Chemistry. 2019 ; 36 : 869-88.
32. F. Papi, M. Ferraroni, R. Rigo, S. Da Ros, C.
Bazzicalupi, C. Sissi, P. Gratteri. Role of the benzodioxole group in the interactions between the natural alkaloids chelerythrine and coptisine and
the human telomeric G-Quadruplex DNA. A Multiapproach Investigation. J. Nat. Prod. 2017 ; 80 : 3128−35.
33. Ha WR, Park JH, Yun DI, Lee JC, Kim JH. Quality assessment of Ijung-tang preparations using a HPLC analysis. Kor. J. Herbology. 2016；31(3)：
29-35.
