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서 론
진균(fungi)은 곰팡이류(molds), 버섯류(mushrooms) 및 효 모류(yeasts)의 생명체 집단으로서 대부분은 세포벽과 세포막 에 키틴(chitin)과 에르고스테롤(ergosterol)이 존재하며, 엽록 소가 없고 항생제에 대한 감수성이 결여되어 있으며 무성생식 혹은 유성생식 중 한가지로 번식하는 포자생식 방법을 지니고 있다(Madigan et al., 2011; Forbes et al., 2012).
진균은 현재 약 100,000종이 보고되어 있으며, 이 중 약 25 종이 사람 질병의 주요 원인체로 인식되고 있고 약 30종은 수 산생물에 질병을 일으킨다고 보고되어 있다(Egusa et al., 2006;
Ramaiah, 2006; Madigan et al., 2011; Park and Oh, 2011; For
bes et al., 2012; Hatai, 2012). 수산생물의 진균성 질병은 보편 적으로 수중에 존재하는 균류가 수산생물에 기생 번식하여 일 어나는 질병으로서 일단 발병하게 되면 유효한 치료법이 적어 양식현장에서는 큰 피해를 입게 된다(Egusa et al., 2006). 어 류에 발생하는 대표적인 진균성 질병으로는 유행성궤양증후 군(Epizootic ulcerative syndrome, EUS), Saprolegnia 감염증,
Branchiomyces 감염증, 이크티오포누스증(Ichthyophonosis) 등이 보고되어 있다(Egusa et al., 2006; Park and Oh, 2011).
2014년 천연물 첨가 사료 투여에 따른 넙치(Paralichthys olivaceus)의 생체 반응을 조사하기 위해 양식산 넙치를 구입 하여 실험하는 과정에서 진균 감염에 의한 폐사가 발생하였 다. 본 연구에서는 넙치에 감염되는 신종으로 추정되는 진균 성 질병에 대해 보고하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 시료 채집 및 질병 검사
2014년 전라남도 영광군에 위치한 양식장으로부터 넙치 치 어(전장 10.5±0.5cm, 체중 7.54±1.1g)를 분양 받아 전남대 학교 수산생명의학과 어류 사육실에서 2주간 순환 여과 수조 에 순치 후 저온실(사육 수온: 15±0.5℃)에서 30L 수조에 각 15마리씩 수용하여 매일 15L씩 2회 환수하며 시험 시료의 효 과를 알아보는 과정에서 폐사된 개체 또는 빈사상태의 개체 를 채집하여 실험에 사용하였다. 분양 받은 넙치는 Kim et al.
(2011)의 방법에 따라 기생충, 세균 및 바이러스 검사를 실시
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넙치의 미동정 진균 기생증
김위식·백근식1·김두운1·서중경·오명주·강소영
*
전남대학교 수산생명의학과, 1전남대학교 농식품생명화학부
A Mycosis of Unidentified Fungi in Olive Flounder(Paralichthys olivaceus) by Wi-Sik Kim, Keun Sik Baik1, Duwoon Kim1, Joong-Kyeong Seo, Myung-Joo Oh and So Young Kang* (Department of Aqualife Medicine, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea; 1Department of Food Science and Technology and Functional Food Research Center, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea)
ABSTRACT In 2014, high mortality was observed in olive flounder(Paralichthys olivaceus) during experimental infection. Diseased fish did not show any outward clinical signs, but numerous fungal hyphae were detected in the gills. No parasites or bacteria were isolated from the diseased fish. A high mortality rate(100%) resulted when cohabitation with fungi-infected fish were applied to healthy fish.
The affected fish exhibited sever fungi infection in the gills. Histopathological examination revealed numerous fungal hyphae and mycelium around gill filament, lamellar and racker. These results suggest that the fungi may be related with the mortality of olive flounder.
Key words: Paralichthys olivaceus, fungi, infection
* Corresponding author: So Young Kang Tel: 82616597176, Fax: 82616597176, Email: sykang1@jnu.ac.kr
KoReAN JoURNAl oF IChThYoloGY, Vol. 27, No. 4, 306-309, December 2015 ISSN: 1225-8598(Print), 2288-3371(online)
Received: october 30, 2015 Revised: November 18, 2015 Accepted: December 10, 2015
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하여 음성반응을 확인하였다. 채집된 시료는 외부 및 내부 증 상을 육안으로 관찰하였고, 아가미, 피부, 각종 장기를 대상으 로 광학현미경을 사용하여 기생충 및 진균 감염 여부를 조사 하였다. 세균 검사는 비장, 신장 및 간 조직을 무균적으로 채취 하여 brain heart infusion agar(BHIA, Difco) 한천평판 배지에 도말한 후, 15℃에서 7일간 배양하여 세균을 분리하였다. 진 균 검사는 아가미 조직을 채취하여 penicillin과 streptomycin 이 첨가된 sabouraud dextrose agar(SDA, Difco)와 PYGS agar (peptone 1.25g, yeast extract 1.25g, glucose 3g, agar 12~15 g, 해수 1,000mL)(Hatai, 2012) 한천평판 배지 위에 올려놓고 15℃에서 7일간 배양하였다. 또한, 아가미 조직으로부터 분리 한 진균에 proteinase K와 phenolchloroform 용액을 사용하 여 DNA를 분리한 후(Kim et al., 2005), 진균 검출용 primer 2 세트(ITS1: 5ʹTCCGTAGGTGAACCTGCGG3ʹ와 ITS4: 5ʹ
TCCTCCGCTTATTGATATGC3ʹ, ITS5: 5ʹGGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG3ʹ와 ITS4)를 사용하여 PCR을 실시하였다 (타켓 gene: ITS5.8SITS 부위)(White et al., 1990). PCR 반응 은 20pmol의 각 primer와 40mM KCl, 10mM TrisHCl(pH 9.0), 1.5mM MgCl2, 250μM의 각 dNTP, 1U Taq DNA poly
merase가 포함되어 있는 혼합물(PCR premix, Bioneer)에 추출
된 DNA 1μL(100ng/μL)를 첨가하여 실시하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 predenature시킨 후, 95℃에서 1분간 dena
ture, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 반 응을 35 cycles를 진행시키고, 72℃에서 5분간 postextension 하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel을 이용하여 확인 하였다. 양성 대조구로서는 Penicillium sp.를 사용하여 위와 동일한 방법으로 PCR을 실시하였다.
2. 감염실험
수온 15±0.5℃로 유지된 20L 수조 2개에 건강한 넙치(평 균 전장 8.2cm, 체중 3.71g)를 각각 10마리씩 수용한 후, 실험 구에는 진균에 감염된 넙치(진균 감염어)를 3마리 넣어 주었 고, 대조구에는 건강한 넙치 3마리를 넣어준 후 매일 10L씩 2 회 환수하며 7일간 누적 폐사율을 관찰하였다. 진균 감염어가 폐사될 경우, 신속히 제거한 후 살아있는 진균 감염어를 추가 로 넣어주어 3일간 진균 감염어가 3마리로 유지되게 하였으 며, 4일부터는 폐사어가 발생될 경우 신속히 제거하였다. 실험 에 사용한 넙치는 Kim et al.(2011)의 방법에 따라 기생충, 세 균 및 바이러스 검사를 실시하여 음성반응을 확인하였다.
Fig. 1. Diseased olive flounder, showing fungi infection(arrows) in the gills(A, B, C). Numerous fungal hyphae(D) and mycelium(m). Scale bar=1cm(A), 100μm(C), 20μm(D).
A B
C D
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3. 병리조직학적 검사
병리조직학적 검사를 위해 병어(자연 감염어와 인위 감염 어)의 아가미 조직을 10% 중성 포르말린액에 고정한 후 상법 에 따라 70%에서 100%까지 순차농도의 에탄올 수용액 내에 서 탈수하고, 자일렌으로 투명화하여 파라핀을 침투시켜 포매 후, 조직 절편을 만들어 hematoxylineosin(HE) 염색을 실시 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
결과 및 고찰
2014년 연구목적으로 양식산 넙치 치어를 구입하여 실험하 는 과정에서 대조구와 실험구에서 각각 26.7%(4/15마리)와 28.6%(30/105마리)의 폐사가 발생하였다. 폐사된 넙치는 죽 기 전까지 이상 유영을 보이지 않았다. 병어는 외관상 특이한 증상을 보이지 않았으나 해부검사 결과, 대부분의 개체에서 아가미 주위로 많은 양의 노란색 이물질이 덮혀 있는 것이 관 찰되었고(Fig. 1A, 1B), 병어의 내부 장기에는 특이적 병변이 관찰되지 않았다. 아가미 부위를 현미경으로 관찰한 결과, 새 엽 주위로 균사체(노란색 이물질)와 가늘고 나선형으로 꼬여 있는 균사(직경: 약 0.65μm)가 관찰되었다(Fig. 1C, 1D). 기생 충과 세균 검사 결과에서는 모든 개체에서 병원체는 분리되 지 않았다. 이상의 결과로 병어는 진균에 감염되어 있는 것이 확인되었다. 진균의 형태학적 특성 분석 및 동정을 위해, 진균 에 감염된 아가미 조직을 채취하여 진균 배지(SDA, PYGS)에 배양을 시도하였으나 진균은 배양되지 않았으며, 진균 검출 PCR에서도 음성반응으로 나타났다(data not shown). 양성 대
조구에서는 약 700bp의 PCR 산물(ITS5와 ITS4 primer 사용) 이 관찰되었다. 본 연구에서는 진균 진단에 일반적으로 사용 되는 배지와 PCR법을 적용하였으나 진균을 분리 동정하는 데 실패하였다. 따라서 넙치 아가미에 감염되는 진균은 기존에 어류에서 보고되어 있는 진균과는 차이를 보이는 것으로 사료 된다.
진균 감염으로 인해 넙치가 폐사되는지를 조사하기 위해, 진균 감염어를 건강한 넙치와 혼합 사육한 후, 건강한 넙치의 폐사 유무를 조사하였다. 진균 감염어와 혼합 사육한 수조에 서는 건강한 넙치가 5일째부터 폐사하기 시작하였고(폐사율:
50%) 7일째 100% 폐사하였다(Fig. 2). 수평 감염원으로 사용 된 진균 감염어는 실험 기간 중 혼합 사육 1일, 3일, 5일, 6일 째 각각 1마리가 폐사되었다. 대조구에서는 폐사가 관찰되지 Fig. 2. Cumulative mortality of olive flounder cohabitated with fungi-
infected fish. Cohabitation with fungi-infected fish and healthy fish (●), cohabitation with healthy fish and healthy fish(○).
Cumulative mortality(%)
Days after cohabitation Cohabitation with fungi-infected fish and healthy fish
Cohabitation with healthy fish and healthy fish
0 1 2 3 4 5 6 7 100
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Fig. 3. Histopathology of olive flounder infected with fungi. Numer
ous fungal hyphae(arrows) and mycelium(m) were observed in the adjacent gill filament(A) and lamellar(B). Scale bar=100μm(A), 20 μm(B).
A
B
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않았다. 실험구의 폐사어는 자연 감염어와 동일하게 아가미에 심한 진균 감염이 확인되었다(data not shown). 이상의 연구 결과, 진균 감염어와 건강한 넙치의 혼합사육을 통해 폐사가 발생됨이 확인되었고, 또한 폐사어는 자연 감염어와 동일한 증상을 나타내는 것이 확인되어, 본 연구에서 분리된 진균은 실험과정 중에 발생한 넙치의 폐사와 연관성이 있을 것으로 사료된다. 병어의 아가미를 대상으로 병리조직학적 검사를 실 시한 결과, 자연 감염어와 인위 감염어 모두 새엽, 새판 및 새 파 주위에 균사체와 다수의 균사가 관찰되었다(Fig. 3A, 3B).
그러나 아가미 조직 내부에서는 균사가 관찰되지 않았으며, 새엽 내의 출혈을 제외하고는 특이한 병변은 관찰되지 않았 다. 이상의 결과, 진균은 아가미에 침입하여 직접적으로 병변 을 유발하지 않는 것으로 확인되어 병어는 아가미 새엽과 새 판 주위에 있는 진균의 과다 증식에 의한 호흡 장애의 원인으 로 폐사된 것으로 추정된다. 넙치에 발생하는 진균성 질병으 로는 exophiala 감염증이 보고되어 있다(Kurata et al., 2008).
본 질병은 수온 17~21℃에서 사육 중인 넙치에서 발생하며, 원인병원체인 exophiala는 피부 궤양부위에서 관찰된다. 본 연구에서는 아가미에 감염되는 진균을 동정하지는 못하였으 나, 넙치에 발생하는 exophiala 감염증과는 감염 부위, 진균의 크기(exophiala 직경: 약 3μm), 배양 특성(exophiala: SDA와 PYGS 배지에서 배양됨)과는 차이를 보였다. 국내에서 어류에 발생하는 진균성 질병에 대한 보고 사례는 거의 없다. 본 연구 에서는 국내에서 처음으로 넙치에서의 진균 감염증을 확인하 였다.
요 약
본 연구에서는 2014년 넙치 치어를 사용하여 실험하는 과 정에서 폐사가 발생하였다. 병어는 외관상 특이한 증상을 보 이지 않았으나 아가미에서 많은 양의 균사가 관찰되었다. 기 생충과 세균은 병어로부터 분리되지 않았다. 진균에 감염된 넙치와 건강한 넙치를 혼합 사육한 결과, 건강한 넙치는 7일 이내에 100% 폐사되었고 폐사어는 아가미에 진균이 심하게 감염되어 있었다. 병리조직학적 검사 결과, 아가미의 새엽, 새 판 및 새파 주위에 균사체와 다수의 균사가 관찰되었다. 이상 의 연구 결과, 넙치의 폐사는 진균 감염과 연관성이 있을 것으 로 사료되었다.
사 사
이 논문은 2014년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한 국연구재단의 기초연구사업 지원을 받아 수행된 것임(NRF
2012R1A1A3014130).
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