발효우슬, 두충, 당귀 복합물의 Primary Chondrocyte 항염 효과 연구 김다경

(1)

49(6), 561～568(2020) https://doi.org/10.3746/jkfn.2020.49.6.561

발효우슬, 두충, 당귀 복합물의 Primary Chondrocyte 항염 효과 연구

김다경¹․이다솜¹․윤정문¹․정현철²․이성진²․손요한²․이정민^1,3

1경희대학교 의학영양학과

2SK 바이오랜드 바이오R&D센터

3경희대학교 임상영양연구소

Anti-Inflammatory Effect of Fermented Achyranthes japonica Nakai, Eucommia ulmoides Oliver and Angelica gigas Nakia

Extracts on Primary Chondrocyte Cells

Dakyung Kim¹, Dasom Lee¹, Jeong Moon Yun¹, Hyun Cheol Jeong², Sung-Jin Lee², Johann Sohn², and Jeongmin Lee^1,3

1Department of Medical Nutrition and ³Research Institute of Medical Nutrition, Kyung Hee University

2Bio R&D Center, SK Bioland Co., Ltd.

ABSTRACT Osteoarthritis (OA) is a chronic disease characterized by degeneration and cartilage pain. Improvement of joint health using functional materials has become an area of active research due to the side effects of drugs used in treatments. Fermented Achyranthes japonica Nakai, Eucommia ulmoides Oliver, and Angelica gigas Nakai compounds (FAEAC) are known to have anti-inflammatory and cartilage protection effects, and fermentation is known to potentiate active ingredients. The purpose of this study was to investigate the inhibitory effects of FAEAC on arthritis using chondrocytes. An animal model of arthritis H2O2 and LPS were used to cause apoptosis and inflammatory reactions in chondrocytes. Pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6), catabolic (PGE2, NF-κB, COX-2, MMPs), and anabolic (aggrecan, collagen type Ⅱ) factors were measured by PCR, ELISA, and morphological analyses. FAEAC in chondrocytes significantly increased expression of aggrecan and collagen type Ⅱ, and activities of NF-κB, COX-2, and MMPs as well as secretion of cytokines (TNF-α, IL-1β) significantly decreased. In conclusion, FAEAC seemed to be active in cartilage protection by reducing factors associa

Key words: osteoarthritis, Achyranthes japonica Nakai, fermentation

Received 27 December 2019; Accepted 6 May 2020

Corresponding author: Jeongmin Lee, Department of Medical Nutrition, Kyung Hee University, Yongin, Gyeonggi 17104, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-31-201-3838

Author information: Dakyung Kim (Graduate student), Dasom Lee (Researcher), Jeong Moon Yun (Researcher), Jeongmin Lee (Pro- fessor)

서 론

골 관절염(osteoarthritis, OA)은 비만, 부상, 노화 등 여 러 요인에 의해 발생하는데, 주요 특징으로는 연골파괴와 통증이 있으며 시간이 지남에 따라 악화되는 만성 질환이다.

이러한 골 관절염은 TNF-α, IL-1β, IL-6 등과 같은 염증성 cytokines, 단백질가수분해효소(proteolytic enzymes), 금 속단백분해효소(metalloproteinase, MMP) 및 전사인자 (nuclear factor kappa-chain enhancer of activated B cell, NF-κB) 등이 복합적으로 관여하여 만성적인 반응을 일으켜 발생하는 것으로 알려져 있다(Kapoor 등, 2011;

Felson 등, 2000). MMPs는 관절염 환자의 관절 조직에서

발현이 증가하는데, 이 중 MMP-3는 연골 조직을 합성하는 proteoglycan core protein 중 하나인 aggrecan의 분해에 관여하며, MMP-13은 collagenase로서 연골의 주요 구성 성분인 collagen type Ⅱ의 분해에 관여한다(Burrage 등, 2006; Yoshihara 등, 2000; Nagase, 1997). TNF-α, IL-1 β, IL-6는 연골의 이화작용을 일으키는 염증성 cytokine이 며, 이 중 TNF-α는 다른 cytokine의 분비를 유도하거나 NF-κB 경로를 활성화시켜 염증을 일으키는 prostaglandin E2(PGE2)의 발현을 유도하는 역할을 한다(Dinarello, 2000;

Feghali와 Wright, 1997).

OA 치료는 통증 감소와 관절 운동 유지가 주요 목표이며 치료제로는 주로 비스테로이드성 항염제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) 중에서 cyclooxygenase -2(COX-2) 경로를 차단하여 염증 반응을 억제하는 Ibupro- fen과 prostaglandin의 합성을 억제하여 통증을 완화시키는 acetaminophen이 대표적으로 사용되고 있다(Jordan 등, 2003; Adams 등, 1976). 그러나 이러한 약물은 장기 복용 시 심혈관 및 위장 질환 등의 심각한 부작용이 있다는 보고

(2)

가 있어 질병의 예방 및 부작용 없이 장기간 복용이 가능한 건강기능식품의 섭취와 수요가 증가하고 있다(Fung과 Kir- schenbaum, 1999; Solomon 등, 2019). Chondroitin sul- fate와 glucosamine sulfate가 대표적인 관절건강에 도움 을 주는 건강기능식품으로 알려져 있으나, 관절 통증 완화 효능 및 안전성에 대한 의문점들이 여러 차례 제기되어 왔 고, 메타분석 결과 통증 감소에 영향을 주지 않는다는 연구 결과도 보고되었다(Wandel 등, 2010; Clegg 등, 2006).

우슬(Achyranthes japonica Nakai)은 한국에서 통증 조 절 및 골관절염 개선에 널리 사용되고 있는 작물로 inokos- terone, oleanolic acid, saponin, ecdysone 등 골관절염 및 염증 억제에 효과적인 성분을 다량 함유하고 있으며, 항 염, 항암, 면역기능조절, 혈액 순환 등의 효능이 알려져 있다 (Kitajima 등, 2003; Han 등, 2005; Chen과 Tian, 2003;

Xie 등, 2001). 최근 발효기술을 접목시킴으로써 약제의 독 성제거, 약효성분 증대 및 체내 흡수율이 증가한다고 보고되 고 있는데, 발효우슬이 항염에 더 뛰어난 효과를 보이는 것 으로 보고된 연구 결과도 있다(Song과 Hong, 2013; Jung 등, 2007; Park 등, 2012; Suhr와 Jung, 2009).

두충(Eucommia ulmoides Oliver)은 나무껍질을 말려 사용하며 면역, 항염증, 고혈압 등에 그 효능이 알려져 있어 중국 전통 의학에서도 오랜 기간 사용되고 있는 약재이다 (Chen 등, 2010; Seo 등, 2015). 특히 두충 열수 추출물은 연골세포의 사멸 억제 및 기질 분해를 조절하여 연골 보호에 효과가 있다는 연구 결과가 보고되어 있다(Lu 등, 2013).

당귀(Angelica gigas Nakai)로 대한약전에서 인정하고 있는 참당귀의 뿌리를 건조하여 사용하며 뿌리에 함유된 decursin이라는 성분에 의해 항암, 항염증, 혈액 순환 등의 효과가 있는 약재로 여성들에게 많이 발병하는 빈혈, 어혈, 월경 장애 등에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Kwon 등, 2015a).

앞서 소개된 3가지 소재에 대한 항염증 효과는 여러 차례 보고되었으나, 이는 단일물에 한정된 결과로 본 연구에서는 3가지 소재를 복합하여 항염증 효과에 어떠한 효능이 있을 지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

추출 및 재료

본 연구에 사용된 발효우슬, 두충, 당귀 복합물(FAEAC) 은 SK 바이오랜드(Ansan, Korea)에서 제공받은 것으로 우 슬의 뿌리를 세척하여 95°C에서 4시간 동안 열수 추출하였 고, 추출물에 Lactobacillus plantarum 300 mL를 접종한 후 37°C에서 24시간 배양하여 여과하고 적어도 14°brix로 농축시켰다. 두충과 당귀는 95°C에서 6시간 동안 복합물 소재들 각각 원재료 대비 15배수의 상수로 95°C에서 우슬 은 4시간, 두충과 당귀는 6시간 동안 열수 추출한 후 여과, 농축하였다. 우슬 : 두충 : 당귀 : β-cyclodextrin＝30:15:22

:33의 비율로 혼합하여 분무 건조시켜 분말화하여 사용하였 고, 제조조건 선정을 위한 다양한 비율 복합물의 비교실험을 통해 확립되었다(Jeong 등, 2019)

연골세포(chondrocyte) 분리 및 배양

연골세포 분리를 위하여 (주)새론바이오(Uiwang, Korea) 로부터 5주령의 수컷 Sprague Dawley(SD) rat을 공급받아 이소플루란(Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA)과 호흡 마취 기기(NORVAP, North Yorkshire, UK) 를 이용하여 희생시킨 후 뒷다리 무릎관절이 드러나도록 하 였다. 관절 끝부분의 연골을 1~2 mm 정도로 얇게 채취한 후 0.1% EDTA-CMF(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 0.25% trypsin(HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)으로 처리한 후 2 mg/mL collagenase(Sigma- Aldrich Co.)를 첨가하여 100 rpm Shaker에서 overnight 하였다. 이후 얻어진 세포 부유액을 Hank’s balanced salt solution(HyClone Laboratories)과 함께 100 μm pore size cell strainer(BD Falcon, Flanklin lakes, NJ, USA)에 여과한 후 연골세포를 분리하였다. 분리한 연골세포는 10%

FBS(Gibco, Waltham, MA, USA)와 각각 1%의 penicil- lin-streptomycin(HyClone Laboratories), 1 M Hepes (HyClone Laboratories), 200 mM L-glutamine(HyClone Laboratories)을 첨가한 DMEM(HyClone Laboratories) 을 넣은 75T flask에서 37°C, 5% CO2 조건 하에서 배양하 였으며 passage는 5 이하로 사용하였다(KHUASP(SE)- 17-041).

Cell viability 측정

발효우슬, 두충, 당귀 복합물의 세포 사멸에 대한 억제능 을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 분리한 연 골세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well씩 분주하고 overnight 하여 안정화한 후 FAEAC을 세포에 독성이 나타 나지 않는 적정 농도 내로 설정한 100, 200, 400 μg/mL로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그다음 300 μM H2O2를 2시간 처리하고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di- phenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 20 μL씩 처리 하여 최대 4시간 동안 37°C, 5% CO₂incubator에서 배양하 였다. MTT 시약과 배지를 모두 제거 후 DMSO를 200 μL씩 처리하여 540 nm에서 ELISA reader(Bio-Rad Laborato- ries, Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였 다.

염증성 cytokines(TNF-α와 IL-1β) 측정

발효우슬, 두충, 당귀 복합물의 염증성 cytokine 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 ELISA 방법을 통해 측정하 였다. 연골세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well씩 분 주하고 overnight 하여 안정화한 후 FAEAC 100, 200, 400 μg/mL와 methyl sulfonyl methane(MSM) 200 μg/mL를

(3)

Table 1. Primer set sequence used for real-time PCR

Sequence name Forward sequence Reverse sequence

GAPDH Aggrecan Collagen type Ⅱ MMP-3

MMP-13 NF-κB COX-2 TNF-α IL-1β

TGG CCT CCA AGG AGT AAG AAA C GAA GTG GCG TCC AAA CCA A GCA ACA GCA GGT TCA CGT ACA GAG TGT GGA TTC TGC CAT TGA G ACG TTCAAG GAA TCCAGT CTC GCA CCA AGA CCG AAG CAA TT AGA GAA AGA AAT GGC TGC AGA GTT ACA AGG CTG CCC CGA CTA T

GGC TTC GAG ATG AAC AAC AAA AA

CAG CAA CTG AGG GCC TCT CT CGT TCC ATT CAC CCC TCT CA TCG GTA CTC GAT GAT GGT CTT G TTA TGT CAG CCT CTC CTT CAG AGA GGA TAGGGC TGG GTC ACA CTT GAA ACC CCA CAT CCT CTT CCT T AGC AGG GCG GGA TAC AGT

CTC CTG GTA TGA AGT GGC AAA TC GTC CAT TGA GGT GGA GAG CTT T

b bc c c

d a

40 60 80 100 120

NC C PC FAEAC100FAEAC200FAEAC400

Cell viability (%) .

FAEAC FAEAC FAEAC 100 200 400

Fig. 1. Effect of fermented Achyranthes japonica Nakai, Eucom- mia ulmoides Oliver, and Angelica gigas Nakai extracts (FAEAC) on the cell viability in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated with 200 μg/mL of PC (methyl sulfonyl methane) and various concentration (100, 200, 400 μg/mL) of mixture containing FAEAC. Chondrocyte treated for 24 h with FAEAC were incubated for 2 h with 300 µM H2O2. Cell viability was analyzed by MTT method. The results were expressed in mean±SD (n=6) values. Significance were indicated using Duncan’s multi- ple range test at P<0.05.

처리하고 lipopolysaccharide(LPS)(Sigma-Aldrich Co.) 50 μg/mL를 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 상층액을 이용하여 Rat Duo-set ELISA Kit(R&D System, Minne- apolis, MN, USA)을 사용하여 655 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

Real-time polymerase chain reaction에 의한 유전자 발 현 측정

발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 염증 반응에 관여하는 유 전자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR 방법 을 이용하였다. 연골세포를 6-well plate에 1×10⁶cells/

well씩 분주하고 overnight 하여 안정화한 후 FAEAC 100, 200, 400 μg/mL와 MSM 200 μg/mL를 처리하고 LPS (Sigma-Aldrich Co.) 50 μg/mL를 처리하여 24시간 배양 하였다. 그다음 RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Ger- many)을 이용하여 RNA를 추출한 후 iScript™ cDNA Syn- thesis Kit(Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 cDNA로 합 성하였다. 유전자 발현을 측정하기 위하여 cDNA와 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)를 혼합하여 CFX Connect^TM real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 측정하였다. 유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 Primer 염기서열은 Table 1에 나타내었다.

95°C에서 10분 동안 hot start 한 후 95°C에서 15초, 58°C 에서 15초, 72°C에서 30초 간 40 cycle을 반복하였다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melt- ing curve 분석을 실시하였고, 결과는 Bio-Rad Laborato- ries에서 제공하는 CFX Manager^TM software로 분석하였 다.

통계처리

본 실험의 결과 분석은 통계프로그램 SPSS(Version 23.0, Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였으며, 모든 실험은 3회 반복 하여 각 실험 항목의 측정 결과를 평균±표준편차(mean±

SD)로 표시하였다. 그룹 간 평균 차이는 one-way ANOVA 로 확인하였고 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05 수준에서 검정하였다.

결 과

세포 독성 평가

Rat 무릎 관절에서 primary culture 한 연골세포를 이용 하여 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 H₂O₂처리에 의한 세포 손상을 억제하는지 Fig. 1에 나타내었다. H₂O₂처리에 의해 세포 손상을 일으킨 후 발효우슬, 두충, 당귀 복합물을 처리 한 결과, 정상대조군(NC)을 100%로 기준하였을 때 고농도 로 갈수록 증가하였으며 400 μg/mL에서 80.67%의 생존율 을 보인 것을 확인하였다(P<0.05).

발효우슬 복합물이 염증성 cytokines(TNF-α와 IL-1β) 분 비에 미치는 영향

본 연구에서 primary culture 한 연골세포에 염증 반응을 일으켜 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 TNF-α와 IL-1β의 분비에 미치는 영향에 대한 결과를 Fig. 2에 나타내었다.

유전자 발현 정도와 마찬가지로 TNF-α 분비량은 정상대 조군(NC) 45.27±0.85에 비해 LPS만 처리한 Control군(C)

(4)

b c bc bc

a

d

0 20 40 60 80

TNF-α production (pg/mL) .

A

cd d bc b

a cd

0 30 60 90

IL-1β production (pg/mL) .

B

Fig. 2. Effect of FAEAC on TNF-α (A) and IL-1β (B) production in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated with 200 μg/mL of PC (methyl sulfonyl methane) and various concentration (100, 200, 400 μg/mL) of mixture containing FAEAC. Chondrocyte treated with FAEAC were co-incubated for 24 h with LPS 50 μg/mL. TNF-α and IL-1β production was analyzed by ELISA. The results were expressed in mean±SD (n=6) values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

cd d b bcd a

bc

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

mRNA expression of TNF-α .

A

b b b

b a

b

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

mRNA expression of IL-1β .

B

Fig. 3. Effect of FAEAC on mRNA expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated with 200 μg/mL of PC (methyl sulfonyl methane) and various concentration (100, 200, 400 μg/mL) of mixture containing FAEAC. Chondrocyte treated with FAEAC were co-incubated for 24 h with LPS 50 μg/mL. mRNA expression of TNF-α and IL-1β was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD (n=6) values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

이 65.02±1.20 pg/mL로 유의적으로 증가한 결과를 보여 염증 반응이 일어났음을 확인하였고, C군에 비해 LPS와 MSM을 처리한 군(PC)과 LPS와 발효우슬, 두충, 당귀 복합 물(FAEAC 100, 200, 400 μg/mL)군에서 각각 57.78±

1.27, 59.19±1.69, 59.4±1.0, 57.08±0.53 pg/mL로 감소 의 폭은 작으나 유의적으로 감소한 결과를 나타내었다(Fig.

2A). IL-1β 측정 결과도 NC군 57.09±1.21 pg/mL에 비해 C군 71.12±6.78 pg/mL로 유의적으로 증가하여 염증 반응 이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 FAEAC(100, 200, 400)군을 C군에 비교했을 때 각각 62.74±2.36, 65.27±

1.88, 58.26±1.22, 53.58±0.68 pg/mL로 유의적으로 감소 하였으며, 특히 FAEAC 400은 PC군보다 더 많은 감소를 보였다(Fig. 2B).

발효우슬 복합물이 염증성 cytokines(TNF-α와 IL-1β) 유 전자 발현에 미치는 영향

본 연구에서 primary culture 한 연골세포에 염증 반응을

일으켜 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 TNF-α와 IL-1β의 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 결과를 Fig. 3에 나타내 었다.

TNF-α 확인 결과 정상대조군(NC)에 비해 LPS만 처리한 Control군(C)은 1.62±0.5로 유의적으로 증가하여 염증 반 응의 발생이 확인되었다. LPS와 MSM을 처리한 군(PC)과 LPS와 발효우슬, 두충, 당귀 복합물(FAEAC 100, 200, 400 μg/mL)을 C군과 비교했을 때 각각 0.93±0.03, 1.13±0.09, 0.70±0.05, 0.56±0.05로 유의적으로 감소한 결과를 나타 내었으며, 특히 FAEAC 400군에서 가장 많은 감소를 보였 다(Fig. 3A). IL-1β의 유전자 발현 측정 결과 NC군에 비해 C군은 1.44±0.26으로 유의적으로 증가하여 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군과 FAEAC(100, 200, 400)군 을 C군과 비교했을 때 각각 1.00±0.08, 0.95±0.09, 1.00

±0.09, 0.77±0.10으로 유의적으로 감소한 결과를 나타내 었고, 모두 NC군 수준으로 감소하였다(Fig. 3B).

(5)

b a a a a

c 0 5 10 15

mRNA expression of MMP-3 .

A

c c b c a

c

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

mRNA expression of MMP-13 .

B

Fig. 5. Effect of FAEAC on mRNA expression MMP-3 (A) and MMP-13 (B) in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated with 200 μg/mL of PC (methyl sulfonyl methane) and various concentration (100, 200, 400 μg/mL) of mixture containing FAEAC. Chondrocyte treated with FAEAC were co-incubated for 24 h with LPS 50 μg/mL. mRNA expression of MMP-3 and MMP-13 was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD (n=6) values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

cd d b bc

a

b

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

mRNA expression of NF-κB .

A

bc

d d a ab

cd

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

mRNA expression of COX-2 .

B

Fig. 4. Effect of FAEAC on mRNA expression of NF-κB (A) and COX-2 (B) in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated with 200 μg/mL of PC (methyl sulfonyl methane) and various concentration (100, 200, 400 μg/mL) of mixture containing FAEAC. Chondrocyte treated with FAEAC were co-incubated for 24 h with LPS 50 μg/mL. mRNA expression of NF-κB and COX-2 was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD (n=6) values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

발효우슬 복합물이 NF-κB와 COX-2의 유전자 발현에 미 치는 영향

본 연구에서 primary culture 한 연골세포에 염증 반응을 일으켜 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 NF-κB와 COX-2의 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 결과를 Fig. 4에 나타내 었다. NF-κB의 결과 정상대조군(NC)에 비해 LPS만 처리 한 Control군(C)은 1.36±0.06으로 유의적으로 증가하여 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. C군에 비해 LPS와 MSM을 처리한 군(PC)과 LPS와 발효우슬, 두충, 당귀 복합 물(FAEAC 100, 200, 400 μg/mL)을 처리한 군은 각각 0.92

±0.1, 0.84±0.11, 0.71±0.07, 0.57±0.12로 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, FAEAC군은 높은 농도일수록 PC 군보다 더 많은 감소를 보였다(Fig. 4A). COX-2의 결과 NC 군에 비해 C군이 1.53±0.13으로 유의적으로 증가하여 염 증 반응이 일어났음을 확인하였다. PC 및 FAEAC(100, 200, 400)을 C군과 비교했을 때 각각 1.38±0.26, 0.81±0.05,

0.75±0.11, 1.21±0.06으로 PC군은 유의적인 차이를 나타 내지 않았지만, FAEAC(100, 200, 400)군은 유의적인 차이 를 나타내었다. 특히 FAEAC 100, FAEAC 200은 NC군 수 준으로 감소한 결과를 보였다(Fig. 4B).

발효우슬 복합물이 MMPs(MMP-3와 MMP-13) 유전자 발 현에 미치는 영향

본 연구에서 primary culture 한 연골세포에 염증 반응을 일으켜 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 MMP-3와 MMP-13 의 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 결과를 Fig. 5에 나타 내었다.

MMPs 유전자 발현 정도를 측정한 결과 MMP-3는 정상 대조군(NC)에 비해 LPS만 처리한 Control군(C)이 9.10±

1.17로 유의적으로 증가하여 연골세포에 손상이 일어났음 을 확인하였다. LPS와 MSM을 처리한 군(PC)과 LPS와 발 효우슬, 두충, 당귀 복합물(FAEAC 100, 200, 400 μg/mL)

(6)

a

b bc a

c a

0.0 0.5 1.0 1.5

mRNA expression of aggrecan .

A

a a a

b b a

0.0 0.5 1.0 1.5

mRNA expression of . collagen type II .

B

Fig. 6. Effect of FAEAC on mRNA expression aggrecan (A) and collagen type Ⅱ (B) in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated with 200 μg/mL of PC (methyl sulfonyl methane) and various concentration (100, 200, 400 μg/mL) of mixture containing FAEAC. Chondrocyte treated with FAEAC were co-incubated for 24 h with LPS 50 μg/mL. mRNA expression of aggrecan and collagen type Ⅱ was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD (n=6) values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

군을 C군과 비교했을 때 각각 7.65±0.88, 8.36±2.82, 7.47

±0.68, 4.14±0.98로 유의적으로 감소하였고, FAEAC 400 에서 가장 많은 감소를 보였다(Fig. 5A). MMP-13은 NC군 에 비해 C군이 1.57±0.02으로 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, PC군 및 FAEAC(100, 200, 400)군은 각각 1.09

±0.1, 1.33±0.08, 1.01±0.18, 0.98±0.06으로 C군과 비교 했을 때 유의적으로 감소한 결과를 보였다. 특히 FAEAC 100을 제외한 PC군 및 FAEAC 200, 400군은 모두 NC 수 준으로 감소한 결과를 나타내었다(Fig. 5B).

발효우슬 복합물이 연골 형성 인자(aggrecan과 collagen type Ⅱ) 유전자 발현에 미치는 영향

본 연구에서 primary culture 한 연골세포에 염증 반응을 일으켜 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 aggrecan과 collagen type Ⅱ의 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 결과를 Fig.

6에 나타내었다.

Aggrecan의 유전자 발현 정도를 측정한 결과 정상대조 군(NC)에 비해 LPS만 처리한 Control군(C)이 0.41±0.22 로 유의적으로 감소하여 연골세포에 손상이 일어났음을 확 인하였다. LPS와 MSM을 처리한 군(PC)과 LPS와 발효우 슬, 두충, 당귀 복합물(FAEAC 100, 200, 400 μg/mL)군을 C군과 비교했을 때 각각 0.94±0.06, 0.58±0.06, 0.65±

0.07, 0.9±0.1로 유의적으로 증가한 결과를 나타내었으며, 특히 PC군과 FAEAC 400군은 NC군 수준으로 증가한 결과 를 나타내었다(Fig. 6A). Collagen type Ⅱ의 측정 결과 NC 군에 비해 C군은 0.40±0.06으로 유의적으로 감소한 결과 를 보였지만, PC군은 0.30±0.01로 C군과 비교했을 때 유의 적인 차이가 나타나지 않았다. FAEAC(100, 200, 400)군은 각각 0.76±0.14, 0.87±0.05, 0.79±0.07로 C군에 비해 유 의적으로 증가한 결과를 나타내었으며, NC군 수준으로 증 가하였다(Fig. 6B).

고 찰

퇴행성관절염은 연골의 퇴행성 변화에 의해 발병하며 통 증이 주요 특징인 만성적인 질환으로 장기적인 약물 복용과 부작용으로 인해 건강기능식품의 섭취가 증가함에 따라 관 절 건강 개선 소재에 대한 지속적인 연구를 필요로 하는 질 환이다. 퇴행성관절염에 관한 연구의 핵심은 연골 보호 기전 으로, 동화작용 인자인 aggrecan 및 collagen의 발현 증가 와 연골 파괴와 관련된 단백 분해효소 인자인 MMPs의 발현 억제가 초점이 된다. 이외에도 염증반응과 관련된 cytokines 및 NF-κB 등 전사인자의 발현 억제에 대한 효능을 평가하 며 본 연구도 이러한 기전에 따라 효능 평가를 진행하였다.

발효는 미생물이 가진 효소를 이용한 대사과정을 통해 유 용한 물질의 생산을 뜻하며 현재 확인된 연구 결과들에 따르 면 독성 감소(Park 등, 2018), 활성 성분 증가(Park 등, 2010) 등 여러 이점들이 밝혀져 다양한 연구에서 활용되고 있다.

본 연구에 사용된 미생물은 젖산균의 한 종류인 L. planta- rum으로 관절염에서 항염증 활성을 보인 연구 결과가 보고 되었으며(Gohil 등, 2018), L. plantarum을 이용해 발효한 소재에서 항염증 활성의 증대(Park 등, 2010) 및 독성 감소 (Park 등, 2018)에 대한 효능이 밝혀져 발효에 사용할 미생 물로 적합한 균주인 것을 확인하였다.

우슬은 관절염에 대한 약리 효과가 널리 알려져 있으며 항염증 활성에 대한 연구 결과도 많이 보고된 소재이다. 특 히 우슬의 지표 물질인 20-hydroxyecdysone은 각종 염증 성 질환을 일으키는 cathepsin B라는 효소에 대하여 저해 활성을 보이기도 하였으며(Lee 등, 2005), LPS에 의한 골 손실 동물모델에서 항염증 활성을 보인 연구 결과가 보고되 었다(Kim 등, 2010). 두충은 연골 파괴와 관련된 MMP의 발현을 감소시키며(Lu 등, 2013), 골다공증(Lee와 Byun, 2001) 및 염증 억제(Do 등, 2017) 활성을 보여 복합물 소재 로서 선정하기에 적합한 것을 확인하였다. 당귀의 주성분인

(7)

decursin은 항염 작용이 있어 관절염 기전과 관련된 인자들 인 TNF-α, IL-1β의 발현 억제와 NO 및 NF-κB의 활성을 저해하는 것으로 확인되었으며(Son 등, 2009), 골 관절염 유발 동물모델에서 연골 소실을 억제한 연구 결과가 보고되 었다(Kwon 등, 2015b). 위의 연구 결과들로 미루어 보아 우슬을 L. plantarum으로 발효시켰을 때 활성 성분의 증대 와 두충과 당귀를 혼합하여 활성 성분들이 복합적으로 작용 하였을 때 관절염 억제에 대하여 기존 연구 결과들에 비해 더 증대된 활성을 기대하며 이를 확인하고자 하였다.

세포에 손상을 주기 위한 자극 물질로 H2O2와 LPS를 사 용하였다. H2O2에 의한 산화적 스트레스와 LPS의 수용체를 통한 활성 신호 전달은 NF-κB를 활성화하며, 활성화된 NF- κB는 핵으로 전이되어 염증성 cytokine, PGE2, COX-2 등 의 인자들을 생성하여 반응을 일으킨다(Kwon 등, 2015b).

NF-κB 경로를 통해 생성된 TNF-α는 NF-κB 재활성화에 사용되어 염증 반응을 더 빠르게 진행시키고(Dinarello, 2000; Feghali와 Wright, 1997), IL-1β는 MMP와 ag- grecanase 등 연골 파괴 인자들의 발현을 증가시켜 관절염 을 진행시킨다(Fan 등, 2005). MMP는 연골 파괴와 직접적 으로 관련이 있는 인자이며 metallopeptidase inhibitor에 의해 억제되는데, 두 인자 사이의 균형이 무너질 때 증가한 MMP에 의해 연골의 파괴가 일어나기 때문에 관절염에서 MMP 활성의 억제는 연골 보호에 핵심적인 기전 중 하나라 고 할 수 있다(Yoshihara 등, 2000). 연골세포에서 발효우 슬, 두충, 당귀 복합물의 염증 반응 억제에 대한 활성을 확인 한 결과, 변화의 폭은 작았지만 대조군에 비해 모두 유의적 으로 감소한 결과를 보여 발효우슬, 두충, 당귀 복합물이 염 증 억제에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

Aggrecan과 collagen type Ⅱ는 연골 형성과 관련된 대 표적인 동화작용 인자로 aggrecan은 연골 기질을 구성하는 proteoglycan core protein의 하나이며(Bhosale과 Ri- chardson, 2008; Buckwalter와 Mankin, 1997), collagen type Ⅱ는 연골의 대부분을 차지하는 단백질이다(Cohen 등, 1998). 관절염에서 동화작용 인자들은 합성에 비해 분해되 는 양이 많아 연골의 손실이 발생하는데, 세포에서 이에 적합 한 상태를 만들기 위해 세포 사멸을 유도하였으며 300 µM의 H2O2를 처리한 후 발효우슬, 두충, 당귀 복합물의 세포사멸 억제 효능을 확인하였다. Aggrecan과 collagen type Ⅱ를 측정한 결과 유의적으로 증가한 결과를 보였는데, aggrecan 은 고농도에서 높은 활성을 보였고 collagen type Ⅱ는 발효 우슬, 두충, 당귀 복합물을 처리한 모든 군에서 정상대조군 수준으로 증가한 결과를 나타내었다. MMP-3와 MMP-13 을 측정한 결과 C군에 비해 모두 유의적으로 감소한 결과를 나타내었으며 고농도군에서 가장 많은 감소를 보였다.

요 약

골관절염은 통증을 동반한 만성질환으로 염증성 cytokines,

금속단백분해효소, 단백질가수분해효소 등이 복합적으로 관여한다. 골관절염의 주요 치료 목표는 관절 운동유지 및 통증감소이며 치료 약물로는 주로 비스테로이드성 항염제 를 처방하고 있으나, 이러한 약물은 장기 복용 시 부작용이 따른다는 보고가 있어 장기간 복용이 가능한 건강기능식품 개발이 활발히 일어나고 있다. 본 연구에서는 관절염에 효능 이 알려진 우슬, 두충, 당귀를 소재로 선정하였고 그중 우슬 을 Lactobacillus plantarum으로 발효시켰으며, 이를 복합 물로 사용하여 연골세포의 항염증 효능을 확인하고자 연구 를 진행하였다. Primary 한 연골 세포에 발효우슬, 두충, 당귀 복합물을 처리한 후 NF-κB와 COX-2 유전자 발현, 염증성 cytokine의 활성 및 유전자 발현, MMPs 유전자 발 현, 연골 형성 인자의 유전자 발현 등을 측정하였다. 그 결과 발효우슬, 두충, 당귀 복합물 처리 시 MMP 발현(MMP-3, MMP-13)을 감소시키고 aggrecan 및 collagen type Ⅱ의 발현은 증가시켜 연골 보호 효과에 대한 활성을 확인하였으 며, 염증 반응에 관하여 NF-κB 활성 및 염증성 cytokines 의 발현을 억제시켜 항염증 효과에도 영향을 미친 것을 확인 하였다. 따라서 발효우슬, 두충, 당귀 추출 복합물이 연골세 포에서 항염증 효과를 가진 천연 기능성 식품의 개발에 있어 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

감사의 글

이 논문은 농림축산식품부의 재원으로 농립식품기술기획평 가원의 고부가가치식품개발사업의 지원을 받아 연구되었음 (117054-3).

REFERENCES

Adams SS, Bresloff P, Mason CG. Pharmacological differences between the optical isomers of ibuprofen: evidence for meta- bolic inversion of the (－)-isomer. J Pharm Pharmacol. 1976.

28:256-257.

Bhosale AM, Richardson JB. Articular cartilage: structure, injuries and review of management. Br Med Bull. 2008. 87:77-95.

Buckwalter JA, Mankin HJ. Instructional course lectures, the american academy of orthopaedic surgeons－articular cartilage. Part Ⅰ: tissue design and chondrocyte-matrix inter- actions. JBJS. 1997. 79:600-611.

Burrage PS, Mix KS, Brinckerhoff CE. Matrix metalloproteinases: role in arthritis. Front Biosci. 2006. 11:529-543.

Chen X, Sang X, Li S, Zhang S, Bai L. Studies on a chlorogenic acid-producing endophytic fungi isolated from Eucommia ul- moides Oliver. J Ind Microbiol Biotechnol. 2010. 37:447-454.

Chen XM, Tian GY. Structural elucidation and antitumor activity of a fructan from Cyathula officinalis Kuan. Carbohydr Res.

2003. 338:1235-1241.

Clegg DO, Reda DJ, Harris CL, Klein MA, O'dell JR, Hooper MM, et al. Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis. N Engl J Med.

2006. 354:795-808.

Cohen NP, Foster RJ, Mow VC. Composition and dynamics of articular cartilage: structure, function, and maintaining healthy state. J Orthop Sports Phys Ther. 1998. 28:203-215.

(8)

Dinarello CA. Proinflammatory cytokines. Chest. 2000. 118:503- 508.

Do HJ, Lee JH, Ha IH, Chung HJ, Lee JW, Kim MJ, et al.

Comparison of index compound content and anti-inflamma- tory activity of Eucommiae cortex by various drying methods.

J Korean Med Rehabil. 2017. 27:19-25.

Fan Z, Bau B, Yang H, Soeder S, Aigner T. Freshly isolated osteoarthritic chondrocytes are catabolically more active than normal chondrocytes, but less responsive to catabolic stim- ulation with interleukin-1β. Arthritis Rheum. 2005. 52:136-143.

Feghali CA, Wright TM. Cytokines in acute and chronic inflammation. Front Biosci. 1997. 2:d12-d26.

Felson DT, Lawrence RC, Dieppe PA, Hirsch R, Helmick CG, Jordan JM, et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: The disease and its risk factors. Ann Intern Med. 2000. 133:635-646.

Fung HB, Kirschenbaum HL. Selective cyclooxygenase-2 in- hibitors for the treatment of arthritis. Clin Ther. 1999. 21:

1131-1157.

Gohil P, Patel V, Deshpande S, Chorawala M, Shah G. Anti-ar- thritic activity of cell wall content of Lactobacillus plantarum in freund's adjuvant-induced arthritic rats: involvement of cel- lular inflammatory mediators and other biomarkers. Inflam- mopharmacology. 2018. 26:171-181.

Han SB, Lee CW, Yoon YD, Lee JH, Kang JS, Lee KH, et al.

Prevention of arthritic inflammation using an oriental herbal combination BDX-1 isolated from Achyranthes bidentata and Atractylodes japonica. Arch Pharm Res. 2005. 28:902-908.

Jeong HC, Lee SJ, Choi DH, Kwon MY, Sohn J, Lee SH. A novel strain of Lactobacillus plantarum SKB1234 having an improving effect on arthritis and a method for producing a mixture of the fermented Achyranthes japonica Nakai extract using the Lactobacillus plantarum SKB1234, Angelica gigas Nakai extract and Eucommia ulmoides Oliver extract. Korea Patent 10-2019-0049002. 2019.

Jordan KM, Arden NK, Doherty M, Bannwarth B, Bijlsma JWJ, Dieppe P, et al. EULAR Recommendations 2003: an evidence based approach to the management of knee osteoarthritis:

Report of a task force of the standing committee for interna- tional clinical studies including therapeutic trials (ESCISIT).

Ann Rheum Dis. 2003. 62:1145-1155.

Jung YJ, Han DO, Choi BH, Park C, Lee J, Kim SH, et al. Effect of fermented herbal extracts, HP-1 on enzyme activities and gene expressions related to alcohol metabolism in ethanol- loaded rats. Korean J Orient Physiol Pathol. 2007. 21:387-391.

Kapoor M, Martel-Pelletier J, Lajeunesse D, Pelletier JP, Fahmi H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011. 7:33-42.

Kim JH, Ki JY, Ann JY, Park HJ, Kim HJ, Kwak HB, et al.

Inhibitory effects of Achyranthis Bidentatae Radix on osteo- clast differentiation and bone resorption. Kor J Herbol. 2010.

25:65-74.

Kitajima J, Kamoshita A, Ishikawa T, Takano A, Fukuda T, Isoda S, et al. Glycosides of Atractylodes japonica. Chem Pharm Bull. 2003. 51:152-157.

Kwon JH, Han MS, Lee BM, Lee YM. Effect of Angelica gigas extract powder on progress of osteoarthritis induced by mono- sodium iodoacetate in rats. J Anal Sci Technol. 2015a. 28:

72-77.

Kwon JH, Han MS, Lee BM, Lee YM. Inhibitory effect of Angelica gigas extract powder on induced inflammatory cyto- kines in rats osteoarthritis. J Anal Sci Technol. 2015b. 28:260- 269.

Lee DS, Byun SY. Effects of the dietary mixture of Eucommia ulmoides Oliver on osteoporosis. Korean J Biotechnol Bioeng.

2001. 16:614-619.

Lee KS, Lee JI, Lee JK, Lee J, Kim GD, Oh MJ. Inhibition effect of Achyranthes japonica N. root extract on cathepsin B. Korean J Food Preserv. 2005. 12:275-281.

Lu H, Jiang J, Xie G, Liu W, Yan G. Effects of an aqueous extract of Eucommia on articular cartilage in a rat model of osteoarthritis of the knee. Exp Ther Med. 2013. 6:684-688.

Nagase H. Activation mechanisms of matrix metalloproteinases.

Biol Chem. 1997. 378:151-160.

Park HJ, Jung DH, Joo HM, Kang NS, Jang SA, Lee JG, et al. The comparative study of anti-allergic and anti-inflammatory effects by fermented red ginseng and red ginseng.

Korean J Plant Res. 2010. 23:415-422.

Park MJ, Park HJ, Lee EH, Jung HY, Cho YJ. Anti-inflammatory effect potentials of ethanol extracts from fermentated Caryopteris incana by Lactobacillus plantarum on induced to LPS with Raw 264.7 cell. J Appl Biol Chem. 2018. 61:141- 150.

Park MR, Yoo C, Chang YN, Ahn BY. Change of total poly- phenol content of fermented Gastrodia elata Blume and radi- cal scavenging. Korean J Plant Res. 2012. 25:379-386.

Seo CS, Kim JH, Shin HK, Kim BS. Quantitative determination of the six marker compounds in Eucommiae Cortex by proc- essing method. Kor J Pharmacogn. 2015. 46:123-132.

Solomon DH, Shao M, Wolski K, Nissen S, Husni ME, Paynter N. Derivation and validation of a major toxicity risk score among nonsteroidal antiinflammatory drug users based on da- ta from a randomized controlled trial. Arthritis Rheumatol.

2019. 71:1225-1231.

Son CY, Baek IH, Song GY, Kang JS, Kwon KI. Pharmacologi- cal effect of decursin and decursinol angelate from Angelica gigas Nakai. Yakhak Hoeji. 2009. 53:303-313.

Song MK, Hong SU. The effects of probiotics-fermented Mag- nolia denudata in ovalbumin induced allergic rhinitis animal model. J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol.

2013. 26:35-49.

Suhr SS, Jung SK. Antiviral effects of fermented Lonicerae Flos on A type influenza virus. Korean J Orient Int Med. 2009.

30:465-480.

Wandel S, Jüni P, Tendal B, Nüesch E, Villiger PM, Welton NJ, et al. Effects of glucosamine, chondroitin, or placebo in patients with osteoarthritis of hip or knee: network meta-anal- ysis. BMJ. 2010. 341:c4675. doi: 10.1136/bmj.c4675.

Xie F, Li X, Sun K, Chu Y, Cao H, Chen N, et al. An experi- mental study on drugs for improving blood circulation and removing blood stasis in treating mild chronic hepatic damage.

J Tradit Chin Med. 2001. 21:225-231.

Yoshihara Y, Nakamura H, Obata K, Yamada H, Hayakawa T, Fujikawa K, et al. Matrix metalloproteinases and tissue in- hibitors of metalloproteinases in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis or osteoarthritis. Ann Rheum Dis.

2000. 59:455-461.