Comparison of osteoinductive efficacy of freezing, freeze-drying and defat-freezing implant preparation for allograft in rabbit

(1)

219

토끼 동종골이식에서 이식골편의 동결법, 동결건조법, 탈지 후 동결법 처리에 따른 신생골 형성능력 비교

이종일·송하나¹·김남수^2,*·최인혁²

동경대학교 농학생명과학대학원, ¹전주 서신동물병원, ²전북대학교 수의과대학 (게재승인: 2007년 2월 2일)

Comparison of osteoinductive efficacy of freezing, freeze-drying and defat-freezing implant preparation for allograft in rabbit

Jong-Il Lee, Ha-Na Song

¹

, Nam-soo Kim

^2,

*, In-hyuk Choi

²

Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan

1

Seosin Animal Hospital, Jeonju 560-821, Korea

2

College of Veterinary Medicine, Chonbuk National University, Jeonju 561-756, Korea

(Accepted: February 2, 2007)

Abstract : Bone allograft had been increased the need because autogenous bone graft is associated with donor site morbidity and is restricted in quantity. The bone allograft implants have to prepare properly for increasing osteoinductive ability and decreasing immune responses before providing to graft. The purpose of this study was to investigate the efficacy on new bone formation in bone allografts by treatment of implants. Cortical bone allografts were transplanted to experimental defects on midshaft of diaphyseal fibulae in 15 rabbits, which were divided to 3 experimental groups according to the preparation methods-freezing, freeze-drying, defat-freezing. The grafted regions of fibulae of all groups had been radiographed biweekly for 16 weeks to observe new bone formation and union between implant and recipient bone. Bone Alkaline Phosphatase (BALP) in all groups was evaluated biweekly till the end of the experiment to determine osteoblast activities. Unions between implant and recipient bone were observed at 30% (3 of 10 cases) of freezing, 50% (5 of 10 cases) of freeze-drying and 80% (8 of 10 cases) of defat-freezing. BALP was increased over 100% from before graft at 2 weeks of graft procedures in all union cases of freezing and defat-freezing group, then gradually decreased till 16th week. In non-union cases, there is no significant variation in BALP value. Defat-freezing method for allograft implants might be more effective for osteoinductive efficacy of implants than freezing and freeze-drying method.

Key words : allograft, BALP, defat-freezing, freeze-drying, freezing

서 론

골이식은골결손부의복구나 빠르고 강력한골유합 이요구되는외과적처치에서많이적용되어왔다

[1, 2,

8, 16, 17, 24, 25, 30, 43].

골이식에있어서신선자가

골이식이가장우수하고만족할 만한결과를 얻을수 있으나

,

^자가골^이식의^골채취의^제한이나 ^{이중수술로}

인한단점

[12, 16, 19-21, 23]

^이^{문제점으로} ^제기되어

왔기때문에자가골을대체할동종골이나이종골이식 의필요성이증가되고있다

.

동종골이나이종골을이식 하는데 있어서가장 중요한문제점은면역거부반응의 억제

,

신생골형성촉진 및적절한지지력을 유지할수 있도록처리하는것이다

.

^이러한^목적을^위하여^지금까

지알려진이식골의처리방법은동결법

[2, 11, 16, 24,

*Corresponding author: Nam-soo Kim

College of Veterinary Medicine, Chonbuk National University, Jeonj 561-756, Korea [Tel: +82-63-270-2800, Fax: +82-63-270-3778, E-mail: [email protected]]

(2)

32, 38, 39],

^{동결건조법}

[3, 5, 7, 9, 10, 17, 30, 31, 33, 43],

^탈회법

[4-6, 27, 29],

^탈단백법

[28, 40],

^{탈회동결법}

[4, 29]

등이알려져있고

,

이중비탈회법으로는동결법

과동결건조법이가장많이이용되고있다

.

^골^조직에서

단순한동결법만으로이식이가능한것은뼈의기질에 는면역성거부반응 물질이가장적게함유되어 있고

[14, 15, 42]

^동결로^인한^면역억제^{기능만으로도}^이식이

가능하기때문이다

.

일반적으로동결법은액화질소보

존법과−

80

^o

C

의

deep freezer

동결법이이용되고있으나

이방법은골형성원성물질

(bone morphogenetic proteins;

BMP) [18, 22, 34, 41]

의보존력은 우수하나 면역원

성 물질의억제가 단순한동결만으로 이루어지기 때 문에이식후면역거부반응의발현이다른이식골처 리방법에비해많은것이단점으로지적되고있다

[5, 24, 26].

동결건조법의처리과정은연구자에따라서다소차이 는있으나일반적으로면역거부반응물질을가장많이 함유하고 있는연부조직을 물리적으로 제거한다음

chloroform-methanol solution(CM sol)

^에^침지하여^치밀

골내에함유된

BMP

의손상을억제하고면역원성물질 인지방등을추출한다

.

탈지과정이끝나면−

40

^o

C

이하 의저온에서동결건조처리과정을지난다

.

^이^과정은^골

의수분함유량을

5%

이내로건조시켜뼈에함유된모 든유기물이나단백질및효소의활동과변성을억제시 키고동결건조처리에의해서치밀골의미세공인영양공 이나

Harversian canal

과

Volkmann canal

의유통을원활

히함으로써

ethylene oxide gas

^의^{멸균효과를}^촉진시키

는것으로알려져있다

.

^건조를^마친^{이식골편은}^마지막

으로

ethylene oxide gas

로멸균처리하여상온에보존한

다

.

동결건조처리는이식골의보존과수송에편리하고 실온에서보존할수있는장점을가지고있으나

,

^신생골

의형성능력이다른이식골처리방법에비해낮고재생 골이취약한단점을가지고있는것으로알려져있다

[7, 9, 10, 33].

한편

,

이식골편의구성물의종류에따라치밀골이식

,

해면골이식또는치밀골과해면골의혼합골편의이식 등으로나눌수있고

,

동결법과동결건조법을이용한 치밀골이식은해면골이식에비해골유도능력은떨어지

지만결손부에대한구조적지지력을갖출수있어

[12,

21, 23, 36]

지지강도가 요구되는사지골에사용될 수

있다

.

동종골이식에서가장이상적인방법은면역거부반응 물질을최대한억제하고신생골의형성을극대화할수 있는처리방법이라고할수있다

[19-21, 28, 35].

그러 나동결법은동결건조법에비해면역억제능력이미약한 반면골형성원성물질의보존능력은높아이식골에함

유된골형성원성물질에미치는영향이적은반면

,

^동결

건조법은면역억제능력은우수하나신생골의형성이미 흡하다

.

따라서본연구에서는동결법과동결건조처리법의단 점을보완하여이식골의신생골형성능력을최대화하고 면역거부반응물질을최대한억제할수있는방법을모 색하여탈지후동결법을제시하였다

.

^이^방법은^이식골

편에서연부조직을물리적으로제거한후동결건조처리 과정의탈지과정인

CM sol

에침지시킴으로서면역원성 물질을제거하고탈지한치밀골을액체질소에동결법으 로보존하여

BMP

의기능을극대화할수있는방법이 다

.

이것은 동결건조법의처리과정중동결건조단계에 서

BMP

^의^손상^또는^손실이^의심되기^때문에^탈지과정

이후동결보존과정을채택하였으며새로운처리방법에 따른이식골편의신생골유도능력을검토하기위하여 동결법과동결건조법의결과와비교하였다

.

신생골형성은이식후

16

주까지매

2

주간방사선학 적인관찰과혈청

bone alkaline phosphatase(BALP)

의측 정을통해감시하였다

.

^{골형성지표로서}^제시될^수^있는

BALP

는골아세포의골형성과정에서분비되는특이적 인

ALP [37]

로본실험에서는

BALP

의

N-acetylgluco-

samine

^이

wheat germ lectin

^과^결합하여^결정을^형성하

는침전반응원리를 응용하여혈청중에서

BALP

만을

선택적으로침전시켜그량을측정하였다

[13].

또한비 탈회경조직표본을제작하여이식부위에서의 조직학 적평가를통해이식골편과주변신생골의변화를관찰 하였다

[9, 17, 35].

재료 및 방법

실험동물

임상적으로건강한것으로확인된

New Zealand White

토끼

15

^두

(

^연령

8.3

^±

1.8

^개월

,

^체중

4.3

^±

0.7 kg)

^를

2

^주

간예비사육후암수구별없이실험에공여하였다

.

^이

식골처리방법에따라

5

두씩

3

군으로구분하였다

.

이식골편의 준비

동종이식골편은같은종토끼에서채취한상완골과 대퇴골의치밀골로준비하였다

.

^채취된^치밀골은^연부

조직을물리적으로제거한다음

,

이식에적합한길이인

약

20 mm

크기로가공하였다

.

이식골편의 실험군별 처리방법

1)

동결법

(Freezing)

준비된이식골편을액체질소

(

⁻

196

^o

C)

^에

7

^일간^보관

후이식에공여하였다

.

(3)

2)

^{동결건조법}

(Freeze-drying)

준비된이식골편을

chloroform-methanol(1 : 1)

^용액에

서

3

일간탈지한후액체질소에서

1

일간예비동결과정 을 거쳐 −

80

^o

C

^{동결건조기}

(OPR-FDC-8032; Operon Engineering,

^한국

)

^에서

3

^일간^동결건조^하였다

.

^건조된

이식골편은

ethylene oxide gas

로멸균포장하여상온에 서보관한후이식에공여하였다

[9, 10].

3)

탈지후동결법

(Defat-freezing)

준비된이식골편을

chloroform-methanol(1 : 1)

^용액에

서

3

일간탈지하였고액체질소에

7

일간보관후이식에 공여하였다

.

이식골편의 이식

마취는전마취제로

atropine sulfate(0.025 mg/kg)

를사 용하였으며

xylazine hydrochloride(2 mg/kg)

^와

ketamine hydrochloride(20 mg/kg)

로합병마취하였다

.

수술은 일반적인술식에따랐으며비골은하퇴부의 외측근위부로접근하였다

.

^노출된^비골의^근위^골간부

를길이약

20 mm

절제하였다

.

절제된비골결손부위에각실험군에따라준비된 동종이식골편을이식하였고상법에따라봉합하였다

.

후처치로시술시부터

3

일간

enrofloxacin(5 mg/kg, IM, bid)

만을투여하였고포대는상황에따라적절히교체하 였으며내

,

^{외부고정은}^하지^않았다

.

방사선학적 검사

이식후

16

^주^동안

2

^주^간격으로^이식^부위를^방사선

촬영하여이식골의상태와신생골의형성및유합과정 을조사하였다

[9].

골아세포의 활성도 검사

모든실험동물에게서이식후

16

^주^동안

2

^주^간격으

로채취한혈청을

deep freezer(

⁻

80

^o

C)

^에^{보관하였다가}

4

^o

C

냉장고에서

24

시간해동한후

UV spectrophotometer

(UVIKON 922; KONTRON, Italy)

^를^이용하여

640 nm

로측정하였다

. Rosalki and Foo

의방법을변형시킨

Behr and Barnert

의방법

[13]

을이용하였다

.

비탈회골조직 표본제작

모든실험동물에이식후

12

주

, 14

주에

oxytetracycline

(25 mg/kg, IM, sid)

^을^각각

2

^일간^주사하여 ^신생골에

tetracycline double labeling

표지를하였다

[17, 35].

이식 후

16

주째실험종료후각군에서방사선학적관찰시 유합이확인된

1

^두씩^선별하여^이식골의^{유합부위를}^절

취하였다

.

절취된골편을 길이약

5 mm

^크기로 ^잘라내

70%

methanol

^에

3

^시간 ^고정시킨 ^후

Villanueva bone stain solution(Polyscience, USA)

에

3

일간보관하여염색하였

다

[9].

^염색이^끝난^절편은

ethanol

^에서^농도^상승^순으

로탈수시키고

, Technovit 7200 VLC(EXAKT, Germany)

에농도상승순으로포매시킨후

Light polymerization

unit(Exakt 520; EXAKT, Germany)

^으로^블록을 ^만들었

다

.

이후

micro cutting machine(Exakt 300 CP; EXAKT,

Germany)

을이용하여

200

µ

m

두께로절편을만든다음

,

micro grinding machine(Exakt 400 CS; EXAKT, Germany)

으로

30

µ

m

까지연마한후형광현미경

(Nikon E-400 with UV-2B Filter; NIKON, Japan)

하에서관찰하였다

.

통계처리

각실험군간측정치의 통계처리는

Student’s

t

-test

로

하였으며 p

< 0.05

^를^유의한^차이의^한계로^하였다

.

결 과

방사선학적 결과

각실험군에서신생골형성을칼슘이침착되는시기 즉

,

^{방사선으로}^음영이^관찰되는^시기로^평가한^결과는

Table 1

과같다

.

1)

^동결골^이식군

총

10

예의이식중

7

예에서신생골형성이관찰되었 으며

,

^이중

3

^예에서^이식골과^{숙주골간의}^유합이^관찰

되었다

(Table 2).

^유합이^관찰된^예에서는^이식^후

2~4

주에신생골형성이관찰되었으며

8~12

주에유합이형

성되었다

(Fig. 1).

^그러나^{이식골편은}^완전히^흡수되지

않았음이경조직표본을통해확인할수있었다

(Fig. 7).

유합이관찰되지않은

4

예에서는결손부 근위

,

원위단 에서신생골이발생되었으나미약하여이식골편과유합

되지못하였다

(Fig. 2).

나머지

3

예는신생골형성이관찰되지않았으며

,

이 식골편의흡수도관찰되지않았다

.

Table 1. New bone formation in the transplanted grafts Case Freezing Freeze- drying Defat-

freezing No new bone formation 3

New bone formation but

Non-union 4 5 2

New bone formation and

Union 3 5 8

(4)

2)

^{동결건조골}^이식군

총

10

예의이식중

10

예모두에서신생골형성이관 찰되었으며

,

이중

5

예에서이식골과숙주골간의유합이

관찰되었다

(Table 3).

^유합이^관찰된

5

^예에서^이식^후

4~

8

주에신생골형성이관찰되었으며

, 12~16

주에유합이 이루어졌다

(Fig. 3).

동결골이식군과마찬가지로이식골

Table 2. Radiographic appearance of freezing group

Case no. Weeks

0 2 4 6 8 10 12 14 16

1

− −

+ + + + U U U

2

+ + + + + U U U

9

− − − − − − − − −

10

− − − − − − − − −

−

: no new bone formation.

+ : new bone formation.

U : union of graft and host bone.

Fig. 1. Serial radiograph of union case in freezing group

(0~16 weeks after graft). Fig. 2. Serial radiograph of non-union case with new bone formation in freezing group (0~16 weeks after graft).

Table 3. Radiographic appearance of freeze-drying group

Case no. Weeks

+ + + + + + +

−

: no new bone formation.

+ : new bone formation.

U : union of graft and host bone.

(5)

편이완전히흡수된경우는관찰되지않았으며이식골 의

1/2

^흡수가^가장^많이^흡수된^예이다

(Fig. 3 & 8).

^신

생골은생성되었으나유합이관찰되지않은

5

예는이식 골편주변에서도미약한신생골형성을관찰할수있었 다

(Fig. 4).

3)

이형성되어동결골

,

^{동결건조골}^{이식군보다}^빠른^유합

을관찰할수있었으며

,

^{이식골편의}^흡수와^{숙주골로의}

치환도관찰할수있었다

(Fig. 5 & 6).

이는조직학적관

찰로도확인되었다

(Fig. 9).

나머지

2

^예는^이식^후

4

^주에^신생골이^{형성되었으나}

미약하였고유합이관찰되지않았다

.

조직학적 변화

동결골을이식했던군에서방사선학적관찰상유합 이확인된예에서의검체의표본이지만이식골편은흡 수되지않고잔존하고있었으며이식골편을둘러싼결

Fig. 3. Serial radiograph of union case in freeze-drying group (0~16 weeks after graft).

Fig. 4. Serial radiograph of non-union case with new bone formation in freeze-drying group (0~16 weeks after graft).

Table 4. Radiographic appearance of defat-freezing group

Case no. Weeks

+ + U U U U U

−

: no new bone formation.

+ : new bone formation.

U : union of graft and host bone.

Fig. 6. Serial radiograph of union case in defat-freezing group (0~16 weeks after graft).

Fig. 5. Serial radiograph of union case in defat-freezing

group (0~16 weeks after graft).

(6)

합조직위에서골막성신생골이미약하게발생하고있 는모습을확인할수있었고

,

^유합이^완전하지^않았음을

관찰할수있었다

(Fig. 7).

동결건조골을이식했던군에서채취한검체에서도이 식골편이흡수되지않고남아있음이관찰되었으며

,

^이

식골편주위에서미약한골막성신생골이생성되고있 음을관찰할수있었다

.

한편

,

이식골편주변에자라났 던결합조직들속에서활발한신생골형성이관찰되어 탈지후동결골보다유합이지연되고있음을관찰할수 있었다

(Fig. 8).

탈지후동결골을이식했던군의표본은검체를채취 할시기에방사선학적인관찰결과이미이식골편과숙 주골간의유합이완료되었고숙주골로치환되었던것 으로판단되었으며

,

^{조직학적인}^{관찰에서도}^{골재구성과}

정

(remodeling)

의일부로서신생골내부에서골수가형

성되고신생골이재형성되는것으로확인할수있었다

(Fig. 9).

BALP치의 변화

동결골과탈지후동결골을이식했던실험군에서신

생골의형성과유합이관찰된예의평균

BALP

^치가^이

식후

2

주에

100%

이상증가하였다가

4

주이후부터서

서히감소하였으나

,

^{동결건조골을}^이식했던^{실험군에서}

는신생골형성과유합이관찰된예의평균

BALP

^치가

이식후

6

주까지계속증가하였다가

, 8

주부터서서히감 소하였다

.

동결골이식군에서유합이관찰된

2

두의

BALP

치의 변화는이식전평균

27.01

±

7.67 IU/l

에서이식후

2

주 에평균

54.52

^±

7.44 IU/l

^으로

101.9%

^{증가하였다가}^이

후

16

주까지계속감소하였고

,

동결건조골이식군에서는

유합이관찰된

4

두의

BALP

치의변화는이식전평균

26.19

^±

6.91 IU/l

^에서^이식^후

6

^주째에

43.29

^±

12.69 IU/l

으로최고

65.3%

증가하였다가이후

16

주까지점차감

소하였다

.

탈지후동결골이식군에서유합이관찰된

4

두의

BALP

^치^변화는^이식^전^평균

28.41

^±

7.00 IU/l

^에서

이식후

2

주에평균

66.35

±

7.37 IU/l

으로

133.5%

증가하 였으며이후

16

주까지계속감소하였다

.

세실험군의 유합된예의전실험기간동안유지된

혈중

BALP

치의농도를비교하면탈지후동결골이식군

은이식후

16

주까지평균

47.15

±

11.23 IU/l

이었으며

,

동

결골이식군은이식후

16

^주까지^평균

39.13

^±

7.98 IU/l

이었고

,

동종동결건조골이식군은이식후

16

주까지평

균

32.08

±

8.19 IU/l

로탈지후동결골을이식한군이가

장높은혈중

BALP

^치^농도를^보였다

.

^이중^탈지^후^동

결골을이식한군과동결건조골을이식한군간의

BALP Fig. 7. Photomicrograph of non-decalcified histologic

sample from freezing group (Villanueva bone stain, tetracycline labeling, Nikon UV-2B Filter,

×

40).

FI: Freezing implant, arrow head: New bone formation.

Fig. 8. Photomicrograph of non-decalcified histologic sample from freez-drying group (Villanueva bone stain, tetracycline labeling, Nikon UV-2B Filter,

×

40).

FDI: Freeze-dried implant, arrow head: New bone formation.

Fig. 9. Photomicrograph of non-decalcified histologic sample from defat-freezing group (Villanueva bone stain, tetracycline labeling, Nikon UV-2B Filter,

×

40).

BM: Bone marrow, arrow: Osteoclast, arrow head: Double

labeled new bone formation.

(7)

변화량에유의성

(

^p

< 0.05)

^이^{인정되었다}

(Fig. 10).

유합이일어나지않은예에서는전실험기간동안큰 변화가없었다

.

고 찰

대부분의연구자들이공통적으로추구하는이식골의 이상형은이식시발생하는면역반응을최소화시키고 골의신생을최대한촉진하며

,

강한역학적지지력을갖

추도록하는것이다

[19-21, 23, 28].

^특히^{동종골이식에}

있어서면역억제능력을향상시키는 처리방법과골유도 능력을촉진시키는처리방법은서로상반되는작용을 하기때문에두가지모두충족시키기는어렵지만다양 한방면에서이를극복하고자하고있다

[1, 12, 26, 27, 29, 36, 40].

동종골을동결처리하거나동결건조하여이식한여러 연구자들의결과는실험동물이나동결온도및이식부위 에따라다양한연구결과를보고하고있으며

,

^보고자들

마다큰차이가있는실정이다

.

사람에서의연구로는조

[8]

등은동종동결골이식결과

57.1%

의성공률을보

고하였고

, Myerson [32]

^등은^{동결법으로}^처리한^동종치

밀골이식에서

92%

의성공률을보고하였으며

, Brown

등

[16]

은 −

20

^o

C

로동결처리한동종골이식으로

94%

의성 공률을보고하였다

.

⁻

10 ~

⁻

20

^o

C

^로^동결^보존한^동종^동

결골이식을개에서임상적으로적용한

Henry

와

Wad- sworth [25]

는

36%

의성공률을보고하였으며

, Sinibaldi [36]

^는

96%

^의^성공률을^{보고하였고}

, Amillo

^등

[11]

^은

토끼에서 −

80

^o

C

로동결처리한동종골이식에서

80%

가 성공했다고보고하였다

.

최등

[9]

은개에서동결건조한 동종골 이식결과

80%

^가^{유합되었다고} ^{보고하였고}

,

Burchardt

등

[17]

은동결건조한동종골이식결과

14%

의성공률을보고하고있다

.

본연구에서는방사선학적인평가를통해동종동결 골의이식결과

70%

의신생골형성을관찰할수있었으

며이식골과숙주골의완전한유합을이식의성공으로 생각할경우

30%

^의^성공률을^보였고

,

^동종^{동결건조골}

과동종탈지후동결골의이식결과신생골형성은모 든예에서관찰할수있었으며

,

^{동결건조골은}

50%

^의^유

합율을

,

^탈지^후^동결골은

80%

^의^유합율을^보여^동결법

보다우수한결과를얻었다

.

이상의결과는탈지후동 결법이동종이식골처리과정에서다른이식골처리법 에비해더우수한신생골유도능력을갖고있음을반 영하며

,

동결법의경우다른연구자들의연구결과에비 해낮은결과를보였다

.

이

[5]

는이식골내부의지방이골형성에방해가되

는인자라고주장하였으며

, VandeVord

등

[42]

은이식골

편내흩어져있는

collagen

^파편들을^주^{원인물질로}^제시

하였고

, Thoren

등

[38, 39]

은세포막을주원인물질로주

장하였다

. Bolano

와

Kopta [14]

는

collagen

과

proteoglycans

등을제시하였으며

,

^골에는^{면역반응을} ^일으킬^물질이

적지만면역물질들이숙주에게감지되어면역반응이일 어나면이식골편에로의맥관화가늦어져이식이실패한 다고주장하였다

.

^이식골을^{동결법으로}^처리할^경우^동

결과정에서면역원성물질이억제된다고알려져있으나

[11, 14, 16, 32]

아직논란이많으며다른처리법에비

해면역억제능력이상대적으로미약하다

[2, 7, 24, 26, 28]. Heyligers

와

Klein-Nulend [26]

는이식골편을 −

80

^o

동결법에비해더많이생존해있었음을반영한다고생 각되다

.

^이에^따라^{이식골편에}^대한^숙주의^{면역거부반}

응이작용하여이식골내에함유된골형성원성물질의 작용도방해한것으로생각되며탈지후동결법과동결 건조법에비해낮은신생골형성율을보인원인도같은 기전에의한것으로생각된다

.

이는이식골을동결법으로처리한군에서는혈청내

BALP

치를측정한결과에서탈지후동결처리한 골에 비해전실험기간동안더낮은혈청내농도가관찰되 었고

,

^이^결과로^보아^숙주의^{골아세포의}^활성^역시^면

역거부반응의작용에영향을받아탈지후동결법보다 촉진되지못한것으로생각된다

.

또한

,

동결법은유합예 도적으면서모두탈지후동결법보다느린지연유합을 보였다

.

이들유합된예의조직학적관찰에서나타난흡 수되지않고잔존된이식골편과이를둘러싼결합조직 들은면역반응의결과로추정되며

[4, 12],

^그^주변에서

신생골이발생되는것은이식골이함유한골형성원성물