Role of Nitric Oxide in the TRPV1-mediated Melanogenesis

DOI 10.17480/psk.2020.64.5.387

TRPV1에 의한 멜라닌 생성에 미치는 산화질소의 역할

이 용 수^#

덕성여자대학교 약학대학

Role of Nitric Oxide in the TRPV1-mediated Melanogenesis

Yong Soo Lee^#

College of Pharmacy, Duksung Women's University

(Received June 12, 2020; Revised August 19, 2020; Accepted August 21, 2020)

Abstract We investigated the possible role of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) in melanogenesis in B16 melanoma cells. Capsaicin (CAP), a TRPV1 agonist, increased production of melanin and nitric oxide (NO) in a dose- dependent manner, which was inhibited by capsazepine (CPZ), a TRPV1 antagonist. The CAP-induced melanin synthesis was blocked by L-NAME and cPTIO, an inhibitor of NO synthase and a NO scavenger, respectively. CAP increased intracellular Ca²⁺ concentration and BAPTA/AM, an intracellular Ca²⁺ chelator, inhibited the CAP-induced production of NO and melanin. These results suggest that TRPV1 may stimulate melanogenesis through intracellular Ca²⁺-mediated production of NO.

Keywords TRPV1, melanogenesis, capsaicin, nitric oxide, B16 melanoma cell

서 론(Introduction)

Transient receptor potential (TRP) 은 비선택적 양이온 통로로서 척추동물에서 28종이 보고되어 있으며, 이것은 canonical (TRPC), vanilloids (TRPV), melastatins (TRPM), mucolipins (TRPML), polycystins (TRPP) 과 ankyrin (TRPA1) 등 6개의 아종으로 분류 된다.

TRP 는 온도, pH, 활성산소종, 삼투성 스트레스 및 세균 독 등 다양한 인자에 대한 수용체로 작용하고 있다.

이 중 transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) 은 세포막에 존재 하는 비선택적 양이온 통로로서 이 통로가 열리면 세포 내로 칼 슘이온을 들어오게 하며 이 통로를 열게 하는 인자로는 내인성 으로 온도, pH, 지방 대사물 등이 있고

, 외인성으로 고추의 매 운 맛

을 내는 캡사이신이 가장 잘 알려져 있다.

TRPV1은 주 로 지각신경에서 발견되고 있으나, 혈관내피세포, 간세포, 지방 세포, 평활근세포, 섬유세포, T세포, 비만세포, 피부세포 등 다양 한 세포 및 조직에서도 발현되고 있다.

이러한 넓은 분포와 더 불어 TRPV1은 통증과 온도조절, 삼투압조절, 기침 및 과민성방 광 등 다양한 생리 및 병태생리학적인 기능을 가지고 있다.

또 한, TRPV1은 피부에서 matrix metalloproteinase (MMP)의 발현

을 유도하여 자외선에 의한 피부의 광노화(photoaging)에 관여한 다고 보고된 바 있다.

Cannabinoid (CB) 및 TRPV1, 두 가지 수 용체에 대해 효능제로 작용하는 anandamide에 의한 멜라닌 합 성 촉진작용이 보고된 바 있으나 이 연구에서는 이 효과와 TRPV1 과의 연관성에 대해서는 밝히지 않았다.

산화질소(nitric oxide, NO)는 생체의 중요한 신호분자로서 혈 관 이완을 매개하는 작용

을 비롯하여 신경계,

면역계

등 다른 여러 장기에서도 중요한 역할을 담당하고 있고, 최근 류마 치스 관절염 등 염증성 질환에 대한 치료제로의 개발 가능성에 대해서도 주목을 받고 있다.

또한, 산화질소는 피부세포에서도 합성되고 있으며 크기가 작고 전하를 띄지 않고 지질 용해성을 나타내는 화학적 특성 때문에 세포와 조직 사이에서 쉽게 확산 되는 물질로서 상처 회복의 촉진, 피부 혈류의 조절, 홍반 생성, 피부 방어 및 색소침착 등 피부에서 여러 조절작용에 관여하고 있다.

산화질소는 세 개의 합성 효소(nitric oxide synthase, NOS), 즉, 내피형(endothelial, eNOS), 신경형(neuronal, nNOS) 및 유도형(inducible, iNOS) 효소에 의해 합성된다.

실제로 이 세 가지 아형 모두 사람 피부세포에서 발견된다.

이 중 내피형 및 신경형 효소는 기본구성효소(constitutive enzyme, cNOS)로서 그 활성을 위해서는 칼슘이온이 필요하며 피부의 항상성 조절을 담 당하고 있다.

반면, 유도형 효소는 칼슘이온과는 무관하게 세 포-특이성 흥분물질에 반응하여 한꺼번에 많은 양의 산화질소를 생성하고 건선 등 피부의 염증성 질환과 관련이 있다.

자외선 을 조사하면 멜라닌세포에서 기본구성효소가 활성화되고 이로

#

Corresponding author

Yong Soo Lee, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Seoul 01369, Korea

Tel: +82-2-901-8396, Fax.: +82-2-901-8386

E-mail: [email protected]

인해 생성된 산화질소가 멜라닌의 생성을 유도한다고 보고되었 다.

이러한 멜라닌 합성에 관여하는 산화질소의 작용기전은 아 직 확실하지는 않지만, 잘 알려진 guanylyl cyclase 및 cGMP- dependent protein kinase (PKG) 의 활성화를 통해 멜라닌 합성에 필수적인 효소인 티로시나제(tyrosinase)를 활성화하거나

그 발 현을 증가시켜

멜라닌 합성을 유도한다. 다른 연구에서는 산 화질소가 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 인산화를 통하여 티로시나제를 활성화시켜 멜라닌 합성을 촉진 한다는 보고도 있다.

TRPV1 은 칼슘 통로로 작용하고 있으므 로 세포 내 칼슘 농도를 증가시키면 그 활성이 칼슘이온에 의 존적인 기본구성 산화질소 생성 효소(cNOS)의 활성화를 유도할 수 있다. 실제로, TRPV1이 혈관 내피세포에서는 eNOS,

신경 세포에서는 nNOS

의 활성화를 유도한다는 사실이 밝혀졌다.

멜라닌 합성과 관련한 TRPV1의 역할에 대한 연구는 아직까 지 미비한 실정이다. TRPV1은 칼슘이온을 증가시켜 cNOS를 활 성화하고, 또한 산화질소는 멜라닌 합성에 중요한 신호로 작용 하고 있다는 사실을 바탕으로 하여 본 연구에서는 TRPV1이 산 화질소의 생성을 통해 멜라닌 합성을 촉진할 것으로 가정하고 이를 규명하고자 하였다.

실험 방법(Experimental Methods)

시약

Capsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide), capsazepine (N- (2-(4-chlorophenyl)ethyl)-1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-ben- zazepine-2-carbothioamide), N

-nitro-L-arginine methyl ester (L- NAME), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bro- mide (MTT) 및 각종 용매와 염류는 Sigma-Aldrich (미국)로부터 구입하였다. 2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylinidazoline-1- oxyl-3-oxide (cPTIO) 는 Tocris Bioscience (영국)에서 구입하였다.

4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2 DA)는 Alexis Biochem- icals (미국)에서, 1-(2,5-carboxyoxazol-2-yl-6-aminobenzfuran-5- oxyl)-2-(2'-amino-methylphenoxy)-ethane-N,N,N'N'-tetraacetoxylme- thyl ester (Fura-2/AM) 및 bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'- tetraacetic acid/acetoxymethyl ester (BAPTA/AM)은 Molecular Probes ( 미국)에서 구입하였다.

세포 배양

B16 흑색종 세포는 서울대학교 한국세포주은행에서 구입하였 다. 구입한 세포는 10% Fetal bovine serum (FBS)와 penicillin 100 IU/mL와 streptomycin 50 μg/mL을 함유한 Dulbecco’s modi- fied Eagle’s medium (DMEM) 용액으로 37

C 로 유지되는 5%

CO

배양기(Forma, 미국)에서 배양하였다.

세포 생존율 측정

살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의 해 MTT가 MTT-formazan으로 전환되므로 이것의 양을 재면 살

아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 세포는 1 mL 배지에 여러 가지 약물 또는 약물을 녹인 용매만을 처리하여 24 well plate에 서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 MTT 용액(2.5 mg/mL H

O) 100 μL를 첨가하여 37

C 에서 4시간 동안 반응시켰 다. 생성된 MTT-formazan 결정체를 분리하기 위하여 세포 현탁 액을 eppendorf tube에 옮겨 원심분리하였다(1500 rpm, 4분). 상 등액을 조심스럽게 제거하고 DMSO 100 μL를 첨가하여 결정체 를 용해시킨 후 540 nm에서 ELISA reader (Molecular Device, 미국)로 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군과 비교하 여 흡광도의 백분율로 나타내었다.

멜라닌 정량

B16 세포에서 멜라닌을 측정할 때에는 phenol red가 없는 DMEM을 사용하여 24 well plate에 mL 당 5×10

개로 분주하 고 12시간이 지난 뒤 세포가 plate에 완전히 부착된 것을 확인 한 후 시료를 처리하고 48시간 지난 뒤에 세포를 수집하여 세 포수를 측정하고, 1200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 침전한 후, 1 mL 균질완충액(50 mM sodium phosphate pH 6.5, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 로 용해시켰다. 여기서 얻은 세포 pellet을 1 N NaOH, 10% DMSO 용액 200 μL를 첨가하고 vortex 후 멜 라닌을 완전히 녹인 다음 96 well plate에 옮긴 후 ELISA reader (Molecular Device, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 멜라닌 표준품을 이용한 표준 검량선을 이용하여 멜라 닌 양을 산출하였다. 멜라닌 생성량은 단위세포(10

개)에서의 멜 라닌 생성량으로 비교하였다.

산화질소 측정

살아있는 세포에서 산화질소의 형성을 측정하는 방법으로 DAF 형광법을 사용하였다. DAF-2 DA는 형광 색소로서 세포를 투과 할 수 있는 DAF-2의 유도체이며 세포 내에 존재하는 에스트라 제에 의해 가수분해 되어 산화질소에 민감한 색소인 DAF-2를 유리한다.

산화질소가 DAF-2와 반응하면 녹색 형광을 방출하 는 triazolofluoresceins으로 변하므로 이 색소에 특이적인 여기-발 광(각각 485 및 535 nm)을 이용하여 이 물질에 의한 형광세기 를 측정할 수 있다. 이 실험을 위하여 세포를 검정색 96-well plate 에 48시간 동안 배양시킨 후 L-arginine (10 μM)을 포함하는 DPBS 및 HEPES (500 μM)에서 25분간 방치하고 DAF-2 DA (10 μM)를 가해 30분간 더 방치한 후 완충용액으로 세척하였다.

새로운 완충용액을 가한 후 세포에 약물을 가하고 형광세기를 fluorescent plate reader (BMG technologies, 미국)로 관찰하여 10 분 동안 그 변화를 측정하였다. 형광 세기의 증가는 세포에서 발생한 산화질소의 양과 비례한다.

세포내 칼슘이온 측정

B16 세포를 EBSS로 세척한 후 5 μM Fura-2/AM을 가해 37

C

에서 30분간 배양하였고 비봉입 Fura-2/AM은 150 g에서 30분간

원심분리하여 제거하였다. 세포를 Krebs-Ringer 완충액(125 mM

NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl

, 1.2 mM KH

PO

, 1.2 mM MgSO

, 5 mM NaHCO

, 25 mM HEPES, 6 mM glucose 및 2.5 mM probenecid, pH 7.4) 에 세포 밀도가 mL당 2×10

개가 되도 록 현탁시켰다. Fura-2가 봉입된 세포를 형광측정 전까지 25

C 에서 90분간 유지시킨 후 교반봉이 들어있는 quartz cuvette에 0.5 mL 세포 현탁액을 주입하여 Hitachi F4500 형광분석기를 사 용하여 여기 파장을 340 및 280 nm에서 반복하게 하고 형광 발 광을 510 nm에서 측정하였다. 세포 내 칼슘 농도는 340:380 nm 형광비로써 나타내었다.

자료분석 및 통계적 검정

모든 실험은 네 번 반복해서 실시하고 실험 결과는 대조군의 조건에 대한 백분율로 나타내었다. 실험 결과는 평균값±SEM으 로 표시하고 ANOVA로 분석하며 각각의 유의성 비교는 Student- Newman-Keul’s test 를 이용하여 실시하였다. P값이 0.05 이하인 경우에만 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

TRPV1 효능약인 캡사이신의 세포 독성

본 연구에서는 TRPV1에 결합하여 직접적으로 활성화시키는 효능약으로 캡사이신

을 사용하였다. 연구에 사용할 캡사이신의 농도를 결정하기 위하여 실험에 사용된 B16 흑색종 세포에 대 한 캡사이신의 독성 여부를 MTT 분석을 통하여 확인하였다. 캡 사이신의 세포 독성을 측정한 결과, 100 μM 농도 이상에서 세 포 생존율이 농도에 비례해서 유의성 있게 저하되었다(Fig. 1).

따라서 추후 실험에서는 캡사이신을 세포 독성을 나타내지 않

는 농도인 50 μM 이하로 하여 사용하였다. 다른 연구에서도 캡 사이신 및 유사물질이 고농도에서 흑색종 세포에 대하여 독성 을 나타낸다는 결과가 보고된 바 있다.

멜라닌 생성에 미치는 TRPV1의 역할

멜라닌 생성에 미치는 TRPV1의 역할을 규명하기 위하여 이 통로에 대해 효능약으로 작용하는 캡사이신의 영향을 관찰하였 다. 분석이 가능한 정도의 충분한 멜라닌 생성이 이루어지는 시 간인 48시간 동안 캡사이신을 투여하고 세포를 배양한 후 멜라 닌 양을 측정한 결과, 캡사이신을 처리한 군에서 농도 의존적으 로 멜라닌 생성이 증가되었으며, 30 μM 농도 이상의 처리군에 서 대조군에 비해 약 2배 이상으로 증가하여 통계적으로 유의 한 촉진 효과를 나타내었다(Fig. 2). 캡사이신에 의한 효과가 TRPV1 에 의해 일어나는 가를 검정하기 위하여 TRPV1에 대하 여 길항작용을 나타내는 약물인 캡사제핀

에 의해 캡사이신의 효과가 상쇄되는 지를 조사하였다. 캡사제핀(10 μM)은 캡사이신 에 의한 멜라닌 생성 촉진 작용을 현저히 억제하였다(Fig. 2). 이 결과는 멜라닌 생성에 TRPV1이 중요한 매개체로 작용한다는 사실을 시사한다.

멜라닌 생성은 사람의 질병과도 연관이 있지만 이를 억제하 는 물질을 이용하여 미백 기능성을 가진 화장품으로 개발하고 자 하는 시도가 매우 활발히 이루어지고 있다. 이와 관련하여 멜라닌 생성을 저해하는 특히 식물유래 화합물의 발굴에 관한 연구가 많이 발표되었다.

미백화장품의 개발을 위해서는 우선 Fig. 1. Effects of CAP, a TRPV1 agonist, on cell viability in B16

melanoma cells. Cells were incubated with or without each concentration of CAP for 48 h. Cell viability assay was done by the MTT staining method. Results are expressed as a percentage of control condition in which cells were grown in medium without CAP.

*p<0.05 compared to negative control (in OD value 1.05±0.04).

Abbreviations: CAP, capsaicin; OD, optical density.

Fig. 2. Involvement of TRPV1 in the CAP-induced melanogenesis in B16 melanoma cells. Melanin content was measured by the method described in the Method section. Briefly, the cells were initially grown for 12 h in order to attach them to the bottom of the culture flasks. Then, the cells were incubated with each concentration of CAP for 48 h. A TRPV1 antagonist, CPZ (10 µM), was added 30 min before treatment with CAP. *p<0.05 compared to negative control (2.45±0.03 pg/cell).

p<0.05 compared to CAP alone.

Abbreviations: CAP, capsaicin; CPZ, capsazepine.

멜라닌 생성 과정에 대한 이해가 필수적이며 이에 대한 정보는 개발 연구의 기초 자료로 활용될 수 있다는 점에서 중요할 것 이다. 식물유래 천연물질인 α-spinasterol이 TRPV1에 대하여 선 택적인 길항작용을 나타낸다는 사실이 보고되었다.

본 연구의 결과를 활용하면 α-spinasterol과 같은 천연물질은 TRPV1에 대

한 길항작용으로 멜라닌 생성을 억제함으로써 미백화장품의 원 료로 쓰일 가능성이 있다고 추측할 수 있으며 이를 증명하기 위 해서는 추후 후속 연구가 필요하다.

TRPV1-매개 멜라닌 생성에 미치는 산화질소의 역할

TRPV1 의 활성화로 인한 세포 내로의 칼슘이온 유입은 그 활 성이 칼슘에 의존적인 cNOS를 자극하여 산화질소를 생성시킨 다.

따라서 본 연구의 결과(Fig. 2)에서 보여준 TRPV1에 의한 멜라닌 생성 촉진 효과에 산화질소가 연루되어 있다고 가정하 고 이를 규명하고자 하였다. 캡사이신은 농도 의존적으로 산화 질소의 생성을 증가시켰으며 20 μM 이상의 농도에서 대조군에 비해 통계적으로 유의한 효과를 나타내었다(Fig. 3). 또한, TRPV1 길항제인 캡사제핀(10 μM)은 캡사이신에 의한 멜라닌 생성 촉 진작용을 유의적으로 억제하였다(Fig. 3). 이 결과는 TRPV1의 활성에 의해 산화질소가 생성된다는 사실을 의미한다. 여러 세 포에서 TRPV1을 통해 증가된 칼슘이온이 그 활성이 칼슘이온 에 의존적인 eNOS 혹은 nNOS의 활성을 증가시켜 산화질소의 생성을 유발한다는 사실이 밝혀졌다.

흑색종 세포에서도 eNOS 및 nNOS가 발현되고 있으므로

이러한 효소의 활성화를 통하 여 산화질소의 생성이 가능하다.

TRPV1 에 의한 멜라닌 합성 촉진작용에 실제로 산화질소가 관여하는지를 확실히 증명하기 위하여 다음 실험을 진행하였다.

비선택적인 NOS 억제제인 L-NAME (100 μM)와 생성된 산화질 소를 제거하는 약물인 cPTIO (100 μM)를 전처리한 군에서 캡사 이신(50 μM)에 의한 산화질소의 생성(Fig. 4A)과 멜라닌 합성 (Fig. 4B)이 통계적으로 유의성 있게 감소되었다. 이 결과는 TRPV1 에 의한 멜라닌 합성 촉진작용에 산화질소가 중요한 역 할을 담당하고 있음을 시사한다.

멜라닌 합성은 세포 내 복잡한 신호 전달 경로를 통하여 일

Fig. 4. Role of NO pathway in the TRPV1-mediated melanogenesis in B16 melanoma cells. In the data (A) and (B) represent the effects of CAP (50 µM) on NO and melanin production, respectively. In these experiments L-NAME (100 µM) and cPTIO (100 µM) were used as a NOS inhibitor and a NO scavenger, respectively. These drugs were added 30 min before CAP application. The data are expressed as percent changes compared to the control condition in which the cells were incubated with CAP-free medium. *p<0.05 compared to negative control (in Fig. A, as FI value 25.45±1.42; in Fig. B, 2.51±0.02 pg/cell).

p<0.05 compared to CAP alone. Abbreviations: CAP, capsaicin; L-NAME, N

-nitro-L- arginine methyl ester; cPTIO, 2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylinidazoline-1-oxyl-3-oxide; FI, fluorescence intensity.

Fig. 3. Role of TRPV1 in the CAP-induced stimulation of NO

production in B16 melanoma cells. NO production was measured

as an increase in DAF-2 fluorescence in the cells exposed to CAP at

designated concentrations for 10 min. CPZ (10 µM) was added 10

min before treatment with CAP. The data are expressed as percent

changes of fluorescence compared to the control condition in which

the cells were incubated with CAP-free medium. *p<0.05 compared

to negative control (in FI value 24.54±1.31).

p<0.05 compared to

CAP alone. Abbreviations: CAP, capsaicin; CPZ, capsazepine; FI,

fluorescence intensity.

어나는데 멜라닌 합성 과정에 관여하는 산화질소의 역할을 밝 힌 연구가 많이 보고되고 있다. 멜라닌 합성관련 실험에서 흔히 사용되는 양성 대조군 화합물인 멜라닌세포자극호르몬(α-MSH) 이 산화질소의 생성을 촉진하며,

인삼 뿌리 추출물인 vanillic acid 에 의한 멜라닌 생성 억제작용에 산화질소가 관여한다고 밝 혀졌고

비타민 C가 자외선에 의한 멜라닌 합성을 억제하는 작 용에도 산화질소가 연루되어 있다고 밝혀졌다.

TRPV1에 의한 산화질소 및 멜라닌 생성 촉진 효과에 미치는 칼슘 신호의 역할

TRPV1 은 칼슘을 세포 내로 유입시키는 칼슘 통로의 역할을 하고 있으므로 TRPV1에 의한 세포 내 칼슘이온의 증가가 실제 로 산화질소 및 멜라닌 합성 촉진작용을 매개하는지를 조사하 였다. Fura-2 형광법을 통한 세포 내 칼슘 측정에서 캡사이신(50 μM)은 빠르게 세포 내 칼슘 농도를 증가시켰으며(Fig. 5A), 이 작용은 농도 의존적으로 나타났다(Fig. 5B). TRPV1 길항제인 캡 사제핀(10 μM)을 전처리하면 캡사이신에 의한 세포내 칼슘이온 의 증가가 유의성 있게 차단되었다(Fig. 5A 및 5B). 이 결과는 캡사이신은 TRPV1 통로를 통하여 세포 내 칼슘을 증가시킨다 는 사실을 입증한다. 또한, 세포 내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/

AM (1 μM)을 전처리한 결과 캡사이신에 의한 산화질소 및 멜 라닌 생성 촉진작용이 유의성 있게 억제됨을 보였다(Fig. 5C).

이 결과를 종합하면 TRPV1에 의해 일어나는 멜라닌 합성 촉진 작용은 증가된 세포 내 칼슘을 통한 산화질소에 의해 매개되는 것으로 사료된다.

멜라닌 합성과정에 세포 내 칼슘 신호도 중요한 매개체로 역 할을 하고 있다는 사실이 알려지고 있다.

자외선의 조사에 의 해 세포 내 칼슘 농도 및 멜라닌 합성이 증가되었다.

세포 내

칼슘 신호가 멜라닌 합성을 촉진시키는 작용기전에 대해서는 아 직 분명하게 알려지고 있지 않지만, 증가된 칼슘이온이 protein kinase C-β를 활성화시키면,

이 효소는 티로시나제를 인산화하 여 그 활성을 증가시키므로

멜라닌이 합성될 수 있다. 또는, 멜라닌 합성이 일어나는 멜라노좀의 막에 존재하는 칼슘 펌프 를 통해 칼슘이온이 멜라노좀 내로 들어가면, 멜라노좀 막전압 과 내강 pH의 변화를 유발하게 되며,

이 변화로 인해 멜라닌 합성을 유도하는 효소들이 활성화됨으로써

멜라닌 합성을 촉 Fig. 5. Role of intracellular Ca

signal in the TRPV1-mediated NO production and melanogenesis in B16 melanoma cells. The data (A) represent intracellular Ca

changes with time. The arrow shows the time point for addition of CAP (50 µM). CPZ (10 µM) was added 10 min before treatment with CAP. In the data (B) increases in intracellular Ca

concentration ([Ca

]

) are expressed as a percentage of control condition in which the cells were incubated with CAP-free medium. CPZ (10 µM) was added 10 min before treatment with CAP. The data (C) represent the effect of BAPTA/AM, an intracellular Ca

chelator, on the NO and melanin production induced by CAP. BAPTA/AM (1 µM) was added 30 min before treatment with CAP (50 µM). *p<0.05 compared to negative control. Control values were in Fig. B, 1.51±0.09 (ratio 340/

380 nm); in Fig. C, 2.36±0.02 pg/cell (melanin content) and 23.62±1.23 (FI).

p<0.05 compared to CAP alone. Abbreviations: CAP, capsaicin;

CPZ, capsazepine; BAPTA/AM, bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid/acetoxymethyl ester; FI, fluorescence intensity.

Fig. 6. Proposed mechanism of the TRPV1-mediated melanogenesis

in B16 melanoma cells. Abbreviations: CAP, capsaicin; NO, nitric

oxide; cNOS, constitutive nitric oxide synthase; TRPV1, transient

receptor potential vanilloid 1.

진할 수 있다. 따라서 본 연구의 결과에서 TRPV1에 의한 멜라 닌 생성 촉진작용은 증가된 칼슘에 의한 산화질소의 생성에 의 해서도 일어날 수 있지만, 칼슘 신호가 산화질소와 무관한 다른 작용으로 멜라닌 합성을 유도할 수 있다는 점을 완전히 배제할 수 없다. 하지만, 좀 더 확실한 결론을 도출하기 위해서는 이를 입증하는 후속 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.

결 론(Conclusion)

세포 내 칼슘과 산화질소가 멜라닌 합성 과정에 중요한 역할 을 한다는 사실을 기초로 하여 본 연구에서는 이와 관련 있는 TRPV1 이 멜라닌 합성에 관여할 것이라고 가정하고 이를 규명 하고자 하였다. B16 세포에서 TRPV1의 효능제인 캡사이신은 농도-의존적으로 멜라닌 합성과 산화질소의 생성을 증가시켰으 며, 이 효과는 TRPV1의 길항제인 캡사제핀에 의해 유의성 있 게 감소하였다(Fig. 2 및 Fig. 3). 또한, 산화질소 생성 효소 억 제제인 L-NAME와 산화질소 제거제인 cPTIO는 캡사이신에 의 해 유도된 산화질소 및 멜라닌 생성을 유의성 있게 차단하였다 (Fig. 4). 캡사이신은 세포 내 칼슘 이온 농도를 증가시켰으며 이 효과는 캡사제핀에 의해 억제되었고(Fig 5A 및 5B), 세포 내 칼 슘 킬레이트인 BAPTA/AM은 캡사이신에 의한 산화질소 및 멜 라닌 생성을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 5C). 본 연구의 결과 를 종합하여 유추해 보면, Fig. 6에 나타내었듯이, 캡사이신에 의해 TRPV1 통로가 열리면 세포 내 칼슘 농도가 증가 되고 이 로 인한 기본구성 산화질소 생성 효소(cNOS)의 활성화를 통해 생성된 산화질소가 티로시나제의 활성을 증가시킴으로써 멜라 닌 합성을 촉진할 것으로 생각된다. 본 연구의 결과를 활용하면 TRPV1 의 활성을 억제하는 물질의 발굴을 통하여 멜라닌 합성 이상으로 인한 피부 색소 질환의 치료제 및 미백화장품의 개발 이 촉진될 수 있을 것으로 기대가 된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 덕성여자대학교 2019년도 교내연구비 지원에 의해 수행되었음.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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