Antioxidant Effect of the Halophyte Atriplex gmelinii

가는갯능쟁이 (Atriplex gmelinii)의 항산화 효과

정희정¹ · 김호준² · 주은신² · 공창숙³ · 서영완^1,2*

Antioxidant Effect of the Halophyte Atriplex gmelinii

Huijeong Jeong¹, Hojun Kim², Eunshin Ju², Chang-Suk Kong³, and Youngwan Seo^1,2*

Received: 29 August 2016 / Revised: 21 October 2016 / Accepted: 24 October 2016

© 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: In the present study, antioxidant activity of crude extract and its solvent-partitioned subfractions (n-hexane, 85% aqueous methanol, n-butanol, and water) obtained from Atriplex gmelinii was investigated using several different anti- oxidant assays. The tested samples possessed different antiox- idant and radical-scavenging activities in different assays. n- butanol fraction showed the most potent radical-scavenging activity on reducing power while 85% aqueous methanol frac- tion exhibited the highest radical-scavenging activity on DPPH radicals and intracellular reactive oxygen species (ROS). On the otherhand, n-BuOH and 85% aqueous methanol revealed the similar inhibitory effect on peroxynitrite-scavenging and genomic DNA oxidation. These results suggest that the Atri- plex gmelinii can be used as the valuable source for develop- ing a natural antioxidant.

Keywords: Atriplex gmelinii, Halophyte, Antioxidant, Reac- tive Oxygen Species (ROS)

1. INTRODUCTION

지구상에 존재하는 호기성 생물은 세포 대사과정에서 불가 피하게 활성산소종 (ROS)을 부산물로 생성한다. 여러 종류 의 환경적 스트레스가 반복되는 조건하에서는 활성산소종 의 축적이 증가된다 [1]. 식물은 효소적, 비효소적 항산화 기 작에 의해서 ROS의 농도를 통제한다. 염분은 생물체내에 활 성산소종의 축적을 야기시키는 중요한 환경적 요인이다 [2,3]. 이러한 염분 스트레스는 삼투압과 이온불균형과 밀접 하게 관련되어 있다. 과량의 염분이 산화 스트레스를 야기한 다는 것은 현재 널리 받아 들여지고 있다 [4,5]. 염분은 식물 의 기공의 열림을 방해하여 이산화탄소의 고정을 억제시키 고 superoxide radical, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, 그 리고 singlet oxygen과 같은 활성산소종을 발생시킨다 [1-3].

ROS의 과도한 축적은 막지질 과산화, 단백질 산화, 효소억 제, 그리고 DNA와 RNA를 손상시켜 결국 세포를 죽게 만든 다 [6-8]. 이러한 염분에 의해 과도하게 축적되는 ROS의 해 로운 역할을 제거하기 위하여 염분의 농도가 높은 지역에 서 식하는 염생식물은 효과적인 항산화 방어기작을 발전시켜 왔다. 많은 연구에 의하면 염분에 의해서 야기된 산화적 손 상을 완화시키는 효과적인 항산화 방어기작은 식물의 염분 내성을 증가시키는데 필수적이며 또한 염분 내성이 있는 식 물들은 활성산소종을 효과적으로 제거하는 것으로 알려져 있다 [3,4].

본 연구팀은 해양생물자원으로부터 항산화제를 탐색하는 과정중에 우리나라에 서식하는 염생식물들중에 하나인 가는 갯능쟁이의 유기추출물이 항산화 활성을 가짐을 확인하였다.

가는갯능쟁이 (Atriplex gmelini)는 명아주과에 속하며 가는명 아주라고도 부른다. 해안가 염분이 높은 지역인 조간대, 간척 지, 해안사구 등에서 자라는 한해살이풀로서 한국, 일본, 중

1한국해양대학교 해양과학기술전문대학원

1Ocean Science & Technology School, Korea Maritime & Ocean Uni- versity, Busan 49112, Korea

Tel: +82-51-410-4328, Fax: +82-51-404-4750 e-mail: [email protected]

2한국해양대학교 해양생명과학부

2Division of Marine Bioscience, Korea Maritime & Ocean University, Busan 49112, Korea

3신라대학교 식품영양학과

3Department of Food and Nutrition, College of Medical & Life Sci- ences, Silla University, Busan 46958, Korea

연구논문

국, 러시아, 그리고 북아메리카에도 분포한다. 이 식물의 어 린 잎과 줄기는 가축의 먹이로 이용되어 왔으나 아직까지 이 식물이 가지는 생리활성에 대해서는 전혀 보고되지 않았을 뿐만 아니라 이 식물의 내염성에 대한 연구를 제외하고는 이 식물자체에 대한 연구가 전무한 실정이다 [9]. 따라서 본 연 구에서는 우리나라에 서식하는 가는갯능쟁이의 유기 추출물 및 용매 분획물을 제조하여 DPPH 및 peroxynitrite 소거능, 세 포내 ROS의 소거효과, DNA 산화 억제 등을 측정함으로써 가는갯능쟁이의 항산화 활성을 확인하여 항산화제 개발의 새로운 원천으로의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다.

2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 재료 및 시약

실험에 사용된 가는갯능쟁이는 2007년 전라남도 무안군 현 경면 현화리에서 채집하였다. 서늘한 곳에서 건조한 후 추출 하기 전까지 -25

C 에서 냉동보관하였다. 사용된 모든 유기 용 매는 1급 시약을 구입하여 증류한 후 사용하였다. 1,1-Diphe- nyl-2-picrylhydrazyl radical(DPPH), 3-morpholinsydnonimine (SIN-1), dihydrorhodamine 123(DHR 123), DL-2-amino-3-mer- capto-3-methyl-butanoic acid(DL-penicillamine)은 Sigma사 (St Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. Peroxynitrite (ONOO

) 는 Cayman(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, Fetal Bov- ine Serum(FBS), Penicillin-Streptomycin, phosphate buffered saline(PBS), EDTA는 Gibco사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 세포배양에 필요한 RPMI-1640는 Hyclone(Lo- gan, Utah, USA) 에서 구입하였으며, DCFH-DA는 Molecular Probes inc.(Eugan, OR, USA)로부터 구입하였다.

2.2. 시료의 추출 및 분획

가는갯능쟁이를 응달에서 건조한 후 잘게 자른 후, methylene chloride (CH

Cl

) 로 24시간 방치 후 여과하여 추출액을 얻었 으며 이 과정을 2회 반복하였다. 여과하고 남은 잔사에 동량 의 methanol을 첨가하고 동일한 과정을 반복하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액을 40

C 온도로 맞춘 수욕 상에서 진공 증발기 (EYELA JAPAN, N-N series)로 농축하여 methylene chloride (CH

Cl

) (1.65 g) 와 methanol 추출물 (5.61 g)을 얻었 다. 이 두 추출물을 합쳐서 활성측정시료 (crude extract)로 사 용하였다. 혼합한 추출물은 용매극성에 따라 단계적으로 분 획하였다. 먼저 동량의 CH

Cl

와 water의 혼합액을 만들어 층 을 분리한 후, 분리된 CH

Cl

층을 2차 분획하여 n-hexane 층 (1.37 g)과 85% aqueous methanol 층 (85% aq.MeOH, 1.14 g)을 얻었고, water (H

O) 층도 2차 분획하여 n-butanol 층 (n-BuOH, 1.10 g)과 water 층 (2.20 g)을 얻었다.

2.3. 총 폴리페놀 함량 측정

가는갯능쟁이로부터 얻은 추출물과 용매 분획물에 포함된 폴 리페놀의 함량은 Folin-Denis법으로 측정하였다. 추출물 및

용매분획물을 1 mg/mL의 농도로 희석시킨 후, 희석액 20 μL 에 Folin-Ciocalteu's reagent solution을 500 μL를 가하고 3분 간 정치하였으며 여기에 또 10% Na

CO

용액 500 μL를 가하 고 20분간 정치하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid 를 증류수에 녹여 농도를 1,250 µg/mL로 만들고, 이를 2 배씩 연속적으로 희석하여 얻어진 용액들을 이용하여 위와 동일한 방법으로 분석한 후 얻어진 표준 검량선으로부터 각 추출물과 용매분획물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였다 [10].

2.4. 항산화 활성

2.4.1. DPPH radical 소거 활성 측정

15 mL ethanol에 2 mg DPPH를 녹인 용액 DPPH 원액과 etha- nol, DMSO 를 3:0.5의 비율로 만든 희석액을 1.2:3.5의 비율로 DPPH radical 용액을 만들어, 준비된 DPPH radical 용액을 cuvette에 넣고 518 nm의 파장에서 측정한 흡광도의 값이 0.94

~0.97이 되도록 농도를 조절하였다. 각각 농도별로 준비한 시 료 100 μL와 DPPH radical 900 μL를 혼합하여 상온에서 10분 간 반응을 시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정하였다 [11].

2.4.2. Peroxynitrite 소거활성 측정

ONOO

소거 활성은 DHR123 (dihydrorhodamine 123)의 산화 되는 정도를 측정하였다. DHR123을 dimethylformamide로 녹여 5 mM stock을 만들어 질소로 purge시켜 -80

C 에 보관하 고, buffer는 50 mM sodium phosphate, 90 mM sodium chlo- ride, 5 mM potassium chloride를 pH 7이 되게 혼합한 후, 100 μM DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid)를 혼합하여 냉장보관하였다. 암실의 얼음위에서 96-well plate 1 판당 DHR123, buffer, DTPA 를 20 μL, 17.58 mL, 400 μL의 비율로 혼합한 용액에 시료와 authentic peroxynitrite를 첨가하고 실 온에서 5분간 방치한 후, multi-direction microplate fluore- scene spectrophotometer Sunergy HT 를 사용하여, excitation 485 nm, emission 530 nm에서 측정하였다. Authentic peroxy- nitrite 대신 SIN-1을 첨가하는 경우 실온에서 1시간 방치한 후, 같은 방법으로 측정한다. Authentic peroxynitrite는 급속 한 DHR123의 산화를 일어나게 하고, SIN-1은 NO·과 O

·

를 동시에 발생시켜 ONOO

의 형태로 변하여 반응한다. Blank 에는 0.3 N NaOH를 사용하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다 [12].

2.4.3. 세포배양

본 실험에 사용한 섬유육종세포인 HT-1080 (human fibrosar- coma cell)세포는 한국 세포주 은행 (KCLB, Korean cell line Bank)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 배양액으로는 100 unit/mL penicillin-streptomycin과 10% FBS (Fetal Bovine Se- rum)이 함유된 RPMI 1640을 사용하였다. 배양된 세포는 cell culture dish 에서 37

C, 5% CO

incubator (Forma scientific, Japan)에서 배양하였다. 배양된 세포는 일주일에 5~6회 PBS buffer로 세척을 한 후, 배지를 갈고, 0.05% Trypsin-0.02%

EDTA로 부착된 세포를 분리하여 계대배양하였다.

2.4.4. 세포 생존율 측정

HT-1080세포를 MTT-assay를 이용하여 생존율을 측정하였다.

배양된 세포가 well당 1×10

cells/mL 가 되도록 96-well plate 에 분주하여 37

C, 5% CO

incubator에서 24시간 동안 배양 한 후, 실험에 사용하였다. 각각 농도별로 준비한 시료를 세 포주에 처리하고, 대조군으로 시료대신에 PBS를 처리하였 다. 처리 후 37

C, 5% CO

incubator에서 1시간 동안 배양한 후, 100 μL의 MTT용액(1 mg/mL)을 첨가하여 37

C, 5% CO

incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 formazan이 생성 되는데, 이를 100 μL의 DMSO에 녹여 ELISA reader (Bio-Tek instruments, Winooski, VT)로 540 nm에서 흡광도를 측정하 였다 [13].

2.4.5. 세포내 ROS (reactive oxygen species) 소거능 측정 세포내 활성산소와 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)가 반응하면 형광을 띠는 DCF로 산화되는 원리 를 이용한 것으로, 세포내 활성 산소종을 측정하였다. 대조 군으로는 시료를 처리하지 않고, 500 μM의 H

O

를 처리한 control과 시료와 500 μM의 H

O

둘다 처리하지 않은 blank를 사용하였다. 배양된 HT-1080 세포가 well당 1×10

cells/mL가 되도록 96-well plate에 분주하여, 37

C, 5% CO

incubator에 서 24시간 동안 배양한 후 실험에 사용하였다. 20 μM DCFH- DA 을 Hank's balanced salt solution(HBSS)로 희석하여 각 well에 주입하여, 37

C, 5% CO

incubator에서 20분 동안 pre- incubation하였다. 각각 농도별로 준비한 시료를 세포주에 처 리하여, 37

C, 5% CO

incubator에서 1시간 배양하였다. 이후, 배지를 제거하여 PBS buffer로 3회 washing하고, 500 μM H

O

처리한 후, 30분 간격으로 120분까지 DCF fluorescence 를 excitation 485 nm, emission 528 nm에서 형광분석기로 측 정하였다 [14].

2.4.6. Genomic DNA 추출 및 산화 생성물 측정

HT-1080 세포로부터 AccuPrepGenomic DNA Extraction kit (USA Bioneer, Inc.)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.

추출되어진 genomic DNA에 각각 농도별로 준비한 시료를 처리한 후, FeSO

, H

O

로 실온에서 산화시키고, 30분 후 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이를 1% agarose gel을 이용하여 100 V에서 30분간 전기영동시켰다. 전기영동 한 gel은 1 mg/mL ethidium bromide로 염색하고, AlphaEase gel image analysis software (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) 를 이용하여 UV로 관찰하였다 [15].

2.4.7. 환원력 (Ferric reducing antioxidant power, FRAP) 측정 각각 농도별로 준비한 시료 0.2 mL, 200 mM sodium phosph-

ate 0.2 mL와 1% potassium ferricyanide 혼합액을 혼합하여, 50

C에서 20분간 반응시켰다. 10% trichloroacetic acid 0.2 mL 를 첨가한 후, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상 등액 0.5 mL와 0.1% ferric chloride 0.5 mL를 혼합한 후, 700 nm 에서 흡광도를 측정하였다 [16].

2.4.8. 통계처리

대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정 하기 위하여 분산분석 (ANOVA)을 행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test 를 실시하였으며, 그 결과는 평균 (mean) ± 표준오차 (standard error of mean, SEM)로 표시하였 다. 모든 통계 분석은 statistic analysis system v9.1 (SAS Insti- tute Inc., Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 처리하 였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 총 폴리페놀 함량

가는갯능쟁이의 추출물과 이를 용매 극성도에 따라 분획한 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 분획물의 총 폴리페 놀 함량을 측정하였으며 그 결과를 Table 1에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 85% aq.MeOH > n-BuOH > water > n- hexane 분획의 순서로 나타나 85% aq.MeOH 분획에서 가장 많은 양이 존재함을 알 수 있었다.

3.2. DPPH radical 소거활성

가는갯능쟁이의 추출물 (CE), 그리고 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 용매분획층을 얻어, 추출물 (crude extract)과 각 용매분획들을 100, 50, 10, 1 μg/mL의 농도에 따라 DPPH radical 소거활성을 측정하였다. 절대적인 값에 있어서는 추 출물과 용매분획물들이 뛰어난 활성을 나타내지는 않았지 만 85% aq.MeOH 분획층이 100 μg/mL의 농도에서 합성항산 화제로 많이 사용되는 BHA와 비교할 만한 27%의 소거율을 나타내었다 (Fig. 1).

3.3. Peroxynitrite 소거활성

Nitric oxide(NO·)와 ·O

가 반응하여 생성되는 peroxynitrite (ONOO

)는 생존기간이 매우 짧고 NO·나 ·O

보다 휠씬 반응 성이 강하여 H

O

보다 수 천배의 반응속도로 단시간 내에 급 속하게 세포와 조직을 손상시키는 것으로 알려져 있다. 하지 만 인체 내에는 peroxynitrite 소거에 관여하는 효소계가 존재 하지 않으므로 이러한 항산화제를 개발하는 것은 매우 의미 가 있다. Atriplex gmelinii의 조추출물과 각 용매 분획물들의

Table 1. Total polyphenol contents of solvent fractions from crude extract of Atriplex gmelinii

CE n-hexane 85% aq.MeOH n-BuOH Water

Total polyphenols

¹⁾

1)

unit is µg/mg.

authentic ONOO

의 소거 효과는 Fig. 2에 나타나 있다. 양성 대조군으로는 vitamin C와 penicillamine을 사용하였다. 모든

시료에서 authentic peroxynitrite가 유의적으로 소거되는 것이 보여졌다. 모든 시료가 100 μg/mL 농도에서 약 60% 이상의

Fig. 2. Scavenging effects of crude extract and its solvent fractions from Atriplex gmelini on authentic peroxynitrite. 85% aq.MeOH: 85%

aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol.

Fig. 3. Scavenging effects of crude extract and its solvent fractions from Atriplex gmelini on peroxynitrite induced from the decom- position of SIN-1. 85% aq.MeOH: 85% aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol.

Fig. 4. Effects of crude extract and its solvent fractions from Atriplex gmelini on viability in HT-1080 cells. 85% aq.MeOH: 85% aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol.

Fig. 5. Scavenging effects of crude and its solvent fractions from Atriplex gmelini on intracellular ROS levels induced by hydrogen peroxide in HT-1080 cells. The cells were incubated with different concentration (100, 50, 10, 1 μg/mL) of the sample. DCF fluorescence was measured following addition of 500 μM H

₂

₂

_excitation

_emission

소거율을 보였으며, 특히, 85% aq.MeOH과 n-BuOH 분획층 이 소거율 98.2%와 96.8%로 매우 좋은 소거활성을 나타내었 다. 85% aq.MeOH과 n-BuOH 분획층은 10 μg/mL의 농도에 서도 70.4%와 69.9%의 높은 소거활성을 보였다 (Fig. 2).

SIN-1 의 분해로부터 유도되는 ONOO

의 소거활성 측정결 과에서도 모든 시료들이 유의적인 소거활성을 나타내었으며 100 μg/mL 농도에서 추출물 (crude extract), n-hexane, 85% aq.

MeOH, n-BuOH, water 분획층에 대해 각각 91.8%, 67.3%, 99.2%, 97.7%, 76.4% 소거율을 보였다. 특히 85% aq.MeOH 과 n-BuOH 분획층은 1 μg/mL 농도에서도 63%의 소거율을 나타내어 Penicillamine과 유사한 소거활성을 보였다 (Fig. 3).

3.4. 세포생존율 측정

가는갯능쟁이의 추출물과 그리고 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 용매분획층의 항산화 활성을 측정하기 위해 섬유육종세포인 HT-1080세포의 생존율에 미치는 영향을 MTT assay를 이용하여 확인하였다. 이때 시료는 200, 100, 50 μg/mL 의 농도로 희석하여 사용하였다. MTT assay를 이용한 세포생존율 측정 결과 100 μg/mL농도에서 모두 80% 이상의 생존율을 보였으며, 이를 바탕으로 100, 50, 10, 1 μg/mL의 농 도로 활성실험에 사용하였다 (Fig. 4).

3.5. 세포내 ROS (산소활성종) 소거활성

비극성분자인 2',7'-Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH- DA)가 세포내로 용이하게 들어 간 후에 세포내 esterase 효소 에 의해 acetate기가 떨어져 나가고 비형광성 물질인 DCFH (2',7'-Dichlorodihydrofluorescin)이 되며 이 물질이 활성산소

에 의해 산화되어 형광물질인 DCF (2′,7′-Dichlorofluorescein) 로 바뀌는 원리를 이용하여 세포내에 존재하는 활성 산소종 을 측정하였다. 대조군으로는 시료를 제외하고 500 μM H

O

만 처리한 control과 시료와 H

O

둘다 처리하지 않은 blank를 사용하여 비교하였으며 0, 30, 60, 90. 120분 간격으로 DCF flourescence값을 측정하였다. Control은 시간에 따라 DCF flourescence 값이 계속 증가하나 blank의 경우 시간에 따른 DCF flourescence 값의 변화가 거의 없었으며 모든 시료들이 농도의존적으로 ROS의 생성을 억제하였다. 100 μg/mL의 농 도에서 2시간 후에 ROS 소거효과를 측정하였을 때 추출물 (CE), 그리고 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 분획층 은 각각 63.2%, 48.6%, 96.3%, 70.3%, 58.8%의 소거능을 보였 다. 특히 85% aq.MeOH의 경우 다른 시료들보다 매우 높은 소거활성을 보였으며 100 μg/mL농도에서는 blank와 거의 동 일한 소거율을 보였고 10 μg/mL농도에서도 48.7%의 소거율 을 보였다 (Fig. 5).

3.6. Genomic DNA 의 산화억제활성 측정

섬유육종세포인 HT-1080세포로부터 genomic DNA를 추출 하여 시료로 처리한 후, 0.1 mM H

O

와 0.1M FeSO

로 산화 시켜, DNA의 산화정도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 H

O

와 FeSO

로 산화시킨 control과, 시료를 처리하지 않고 산화도 시키지 않은 blank를 사용하여 비교하 였다. 모든 시료에서 농도의존적인 산화 억제가 나타났으며 control과 비교하였을 때 10 μg/mL의 농도에서도 추출물, n- hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 분획층은 각각 62.9%, 42.7%, 71.0%, 71.8%, 62.9%의 산화 억제율을 보였다 (Fig. 6).

Fig. 6. Antioxidant effects of crude extract and its solvent fractions from Atriplex gmelini on genomic DNA in HT-1080 cells. 85% aq.MeOH:

85% aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol.

3.7. 환원력 (Ferric reducing antioxidant power, FRAP)의 측정

환원력의 측정은 항산화물질이 노란색의 ferricyanide 복합체 (potassium ferricyanide) 에 존재하는 Fe

이온을 Fe

이온의 형태로 환원시켜 나타난 파란색의 Perl's prussian blue가 생성 되는 정도를 700 nm에서 측정한 것이다. 대조군으로는 시료 를 처리하지 않은 control을 100%로 두고 각각의 시료들의 환 원력을 상대적인 % 값으로 표시하였으며 비교하기 위하여 vitamin C 의 환원력도 같이 측정하였다. 모든 시료들이 농도 의존적으로 환원력을 보여주었으며 그 중에서 85% aq.MeOH 과 n-BuOH 분획층에서 높은 환원력이 관찰되었다. 85% aq.

MeOH 과 n-BuOH 분획층은 100과 50 μg/mL의 농도에서 각각 83.0%와 74.9%, 88.4%와 82.7%의 환원력을 보였다 (Fig. 7).

4. CONCLUSION

본 연구는 염생식물 가는갯능쟁이의 추출물 및 용매분획물 의 항산화 효과를 조사하였다. 추출물과 각 용매분획물의 총 폴리페놀성 화합물의 함량은 추출물 (crude extract) 47.8 g/

mg, n-hexane 60.1 g/mg, 85% aq.MeOH 159.6 g/mg, n-BuOH 215.2 g/mg, water 47.8 g/mg 으로 나타났다. 추출물의 용매분 획들 중에 85% aq.MeOH 분획층과 n-BuOH 분획층이 가장 우수한 항산화 활성을 나타내어 이 분획들중에 항산화 활성 이 높은 물질이 존재할 것으로 추측되어진다. 가는갯능쟁이 추출물은 우수한 peroxynitrite 소거능과 genomic DNA 산화 방지능, 그리고 비교적 좋은 세포내 ROS 소거능을 가지고 있 었으며 DPPH radical 소거효과의 경우에는 절대적인 수치 자 체는 그렇게 높지 않았으나 합성 항산화제로 많이 사용되는 BHA 와 비슷한 정도의 소거능을 보였다. 용매분획층의 경우 에는 전반적으로 총 폴리페놀 함량이 높은 85% aq.MeOH 분 획층과 n-BuOH 분획층이 가장 좋은 항산화 활성을 보였으나 두 분획층 사이의 항산화 활성을 비교했을 때 반드시 총 폴

리페놀 함량에 비례하지는 않았다. DPPH 라디칼과 세포내 ROS의 경우에는 85% aq.MeOH 분획층이 n-BuOH 분획층보 다 더 좋은 소거능을 보인 반면에 환원력 측정에서는 n-BuOH 이 더 좋은 효과를 나타내었다. Peroxynitrite소거능과 geno- mic DNA 산화억제능에 있어서는 두 분획층이 거의 비슷한 효과를 나타내었다. 이전에 보고된 연구결과에 의하면 항산 화활성 검색방법에 따라 시료의 항산화활성이 항상 총 폴리 페놀 함유량과 비례하지는 않았다 [17-21]. 이것은 아마도 항 산화 활성이 폴리페놀성 화합물에서만 기인된 것은 아니기 때문인 것으로 추측된다. 실제로 폴리페놀이 아닌 사포닌, 황 함유 화합물, 퓨란유도체, 색소등의 높은 항산화 활성이 보고 된 바 있으며 [22-26], 우리가 잘 알고 있는 강력한 항산화제 인 vitamin C와 글루타티온 (glutathione)도 폴리페놀계 화합 물들이 아니다. 이러한 연구결과로부터 가는갯능쟁이는 천 연 항산화 소재로서의 활용 가능성이 높다고 사료되며 현재 가는갯능쟁이로부터 항산화물질을 분리하기 위한 연구가 진 행중에 있다.

Acknowledgements

본 연구는 2012년 교육과학기술부의 재원으로 한국연구재단 의 지원을 받아 수행된 기초연구사업 (No. 2012R1A1A2002 851)의 연구결과입니다.

REFERENCES

1. Hernández, J. A., A. Campillo, A. Jiménez, J. J. Alarcón, and F.

Sevilla (1999) Response of antioxidant systems and leaf water relations to NaCl in pea plants. New Phytol. 141: 241-251.

2. Foyer, C. and G. Noctor (2005) Redox homeostasis and antioxi- dant signalling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell. 17: 1866-1875.

Fig. 7. Ferric reducing antioxidant power assay of crude extract and its solvent fractions from Atriplex gmelini. 85% aq.MeOH: 85% aque- ous methanol, n-BuOH: n-butanol.

3. Ozgur, R., B. Uzilday, A. H. Sekmen, and I. Turkan (2013) Reac- tive oxygen species regulation and antioxidant defence in halo- phytes. Funct. Plant Biol. 40: 832-847.

4. Jithesh, M. N., S. R. Prashanth, K. R. Sivaprakash, and A. K.

Parida (2006) Antioxidative response mechanisms in halophytes:

their role in stress defence. J. Genet. 85: 237-324.

5. Sharma, S. S. and K. J. Dietz (2009) The relationship between metal toxicity and cellular redox imbalance. Trends Plant Sci. 14:

43-50.

6. Yildiztugay, E., A. H. Sekmen, I. Turkan, and M. Kucukoduk (2011) Elucidation of physiological and biochemical mechanisms of an endemic halophyte Centaurea tuzgoluensis under salt stress.

Plant Physiol. Biochem. 49: 816-824.

7. Gratão, P. L., A. Polle, P. J. Lea, and R. A. Azevedo (2005) Mak- ing the life of heavy metalstressed plants a little easier. Funct.

Plant Biol. 32: 481-494.

8. Møller, I. M., P. E. Jensen, and A. Hansson (2007) Oxidative mod- ifications to cellular components in plants. Annu Rev. Plant Biol.

58: 459-481.

9. Bae, J.-J., H.-S. Yoon, Y.-S. Choo, and S.-D. Song (2003) The res- ponses of antioxidative enzymes and salt tolerance of Atriplex gmelinii. Korean J. Ecol. 26: 273-280.

10. Folin, O. and W. Denis (1912) On phosphotungastic phosphomo- lybdic compounds as color reagents. J. Biol. Chem. 12: 239-249.

11. Blois, M. S. (1998) Antioxidant determinations by the use of a sta- ble free radical. Nature 26: 1199-1200.

12. Kooy, N. W., J. A. Royall, H. Ischiropoulos, and J. S. Beckman (1994) Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine 123.

Free Radic. Biol. Med. 16:149-156.

13. Hansen, M. B., S. E. Nielsen, and K. Berg (1989) Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Meth. 119: 203-210.

14. Okimoto, Y., A. Watanabe, E. Niki, T. Yamashita, and N. Noguchi (2000) A novel fluorescent probe diphenyl-1-pyrenylphosphine to follow lipid peroxidation in cell membranes. FEBS Lett. 474: 137- 140.

15. Milne, L., P. Nicotera, S. Orrenius, and M. Burkitt (1993) Effects of glutathione and chelating agents on copper-mediated DNA oxi-

dation: Pro-oxidant and antioxidant properties of glutathione. Arch.

Biochem. Biophys. 304: 102-109.

16. Oyaizu, M. (1986) Studies on products of browning reaction. Anti- oxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn. J. Nutr. 44: 307-315.

17. Hong, J.-H., J.-L. Jeon, J.-H. Lee, and I.-S. Lee (2007) Antioxidant properties of Artemisia princeps Pamp. J. Korean Soc. Food Sci.

Nutr. 36: 657-662.

18. Kim, Y. J., J.-A Jeong, S.-H. Kwon, and C. H. Lee (2008) Com- parison of biological activities of extracts from different parts and solvent fractions in Cornus kousa Buerg. Korean J. Plant Res. 21:

28-35.

19. Lee, M. A, H. J. Choi, J. S. Kang, Y. W. Choi, and W. H. Joo (2008) Antioxidant activities of the solvent extracts from Tetragonia tetra- gonioides. J. Life Sci. 18: 220-227.

20. Choi, S. J., E. Cho, E. Cho, Y. Jeong, C. S. Ku, B. Ha, and H. J.

Chae (2011) Screening of functional materials from solvent frac- tions of apple flower leaf extract. KSBB Journal 26: 165-171.

21. Jeon, S.-M., J.-Y. Lee, H.-W. Kim, Y.-M. Lee, H.-H. Jang, K.-A Hwang, H.-R. Kim, and D.-S. Park (2012) Antioxidant activity of extracts and fractions from Aster scaber, J. Korean Soc. Food Sci.

Nutr. 41: 1197-1204.

22. Gülçin, I., V. Mshvildadze, A. Gepdiremen, and R. Elias (2004) Antioxidant activity of saponins isolated from ivy: α-hederin, hed- erasaponin-C, hederacolchiside-E and hederacolchiside-F. Planta Med. 70: 561-563.

23. Zhu, Y. Z., S. H. Huang, B. K. H. Tan, J. Sun, M. Whiteman, and Y.-C. Zhu (2004) Antioxidants in Chinese herbal medicines: a bio- chemical perspective. Nat. Prod. Rep. 21: 478-489.

24. Xi, M., C. Hai, H. Tang, M. Chen, K. Fang, and X. Liang (2008) Antioxidant and antiglycation properties of total saponins extrac- ted from traditional Chinese medicine used to treat diabetes melli- tus. Phytother. Res. 22: 228-237.

25. Brewer, M. S. (2011) Natural antioxidants: sources, compounds, mechanisms of action, and potential applications. Compr. Rev.

Food Sci. Food Saf. 10: 221-247.

26. Oroian, M. and Escriche, I. (2015) Antioxidants: Characterization, natural sources, extraction and analysis. Food Res. Int. 74: 10-36.