담색국화잎지의류 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성 탐색
문 승 재
지의류(lichens)는 곰팡이(fungi, mycobionts)와 조류(algae, photobionts)가 지의체(thallus)를 형 성하여 공생하며 살아가는 복합미생물로 전 세계적으 로 약 14,000여종으로 알려져 있으며, 우리나라에 분 포하는 지의류는 약 510종으로 보고 되고 있으나, 국 내 자생 지의류의 종수가 더욱 증가할 것으로 예측하 고 있다[1]. 지의류는 곰팡이와 조류가 공생관계를 맺 고 살아가는 복합생명체다. 저마다 독특한 형태를 지 니고 있어 하나의 생물종처럼 보이지만 그 안에서 두 생물이 서로 도움을 주고받으며 평생을 살아간다[2].
Corresponding Author 성 명 : 문 승 재
소 속 : 전남도립대학교 뷰티아트과
주 소 : 전라남도 담양군 담양읍 죽녹원로 152 전 화 : 061-380-8567
E-mail : [email protected]
지의류는 크기가 작고 납작하게 붙어 자라기 때문에 얼핏 곰팡이나 이끼로 아는 사람도 많다. 주로 나무나 바위에 많이 붙어서 사는데 사람이 사는 집 지붕이나 돌담, 석상에서도 자란다. 지의류는 생장 속도가 느려 1년에 수 밀리미터밖에 자라지 않는다. 반면 수명은 길어서 수백 년 된 개체가 발견되기도 한다. 기물에 딱 달라붙어 잘 떨어지지 않기 때문에 고목이나 문화 유적에선 어김없이 지의류가 발견되곤 한다[3]. 적도 부터 극지까지, 바닷가에서 고산에 이르기까지 지의류 가 사는 곳은 제한이 없다. 그러나 환경이 급격하게 변한 곳, 오염이 심각한 곳에서는 생장하지 않으므로 도시에서는 지의류를 찾아보기가 어렵다. 따라서 지의 류는 대기오염 지표, 항암·항균물질, 사막화 방지를 위 한 미래의 생물자원이라 할 수 있다[4]. 지의류는 염 색이나 화장품 재료로 활용하기도 하며, 각 종마다 특 이한 2차 대사산물을 생성하는데 최근 이 물질이 항 암·항균작용 등 특별한 기능을 하는 것으로 알려져 생 물자원으로서 기대를 모으고 있다[5]. 벌레이끼와 같 은 지의류를 구성하는 균류는 대부분이 자낭균류로,
현재까지 알려진 지의류 총 종수의 거의 99%를 차지 한다. 여기에서 나머지 1%는 담자균류와 불완전균류 이다 [6]. 지의류는 균류와 조류로 구성되어 있지만, 분류할 때는 균류에 더 중점을 두므로, 먼저 자낭지의 류와 담자지의류로 나누고, 분류상 그 아래의 단계에 서는 생식 기관의 구조 등으로 구별한다[7].
최근 지의류에 관한 연구는 항균, 항산화 연구가 진 행되고 있으며, 화장품 소재로써의 연구는 염료제의 개발에 대한 연구가 주류를 이루고 있다[8]. 기존의 지의류에 관한 연구에서 피녹시존 유도체의 색소로 암 모니아수의 존재 하에서 과산화수소로 오르시놀 산화 시켜 오르세인 염료를 얻는 연구가 진행되었으며, 담 색국화잎지의류(
Xanthoparmelia mexicana
) 추출 염액에 의한 견직물 염색에 대한 연구가 시행되었다 [9]. 또한 한국에서 자생하는 지의류에서 추출한 염 액으로 염색한 견포의 다양한 색과 견뢰도에 관해 연 구하였고[10], 지의류로부터 제조한 염액의 직물에 대 한 염색성과 염색조건을 연구하였다[11]. 이와 같이 지의류에 대한 연구는 대부분 환경 오염지표나 일부 염색제 활용한 관한 연구가 대부분이며, 담색국화잎지 의류에 대한 국내외 연구는 전무한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 담색국화지의류의 폴리페놀 함량 및 플 라보노이드 함량, 항산화 활성 탐색을 통해 염료제 이 외의 다른 분야의 천연 화장품 소재로써의 가능성에 대해서 조사하였다.2. 실험방법
2.1. 실험재료
본 실험에 사용한 담색국화잎지의류(Figure 1)는 전남 진도군 의신면 접도에서 2018년 6월경에 채취하 여 수세 후 세절하고 지의류 30 g을 암모니아수 300 mL에 침지하여 추출하였으며, 암모니아와 1차 증류수 의 비율은 1:3이었다. 지의류 건조분말을 각각, 열수 추출(X. M Water), 100% EtOH 추출(X. M EtOH), 암모니아 추출(X. M Alkali)을 진행하였다.
침지시간은 7일, 25℃ 실온 추출로 진행하였다.
Figure 1. Morphology of
Xanthoparmelia meximcana
using in this experiment2.2. 항산화 활성 분석
2.2.1 DPPH radical scavenging
DPPH radical scavenging은 0.1 mM DPPH를 95% EtOH에 용해하여 DPPH stock solution을 제조하였다. DPPH stock solution 200 µL에 시료 80 µL를 가하여 15 분간 암실에서 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다[12]. Positive control 로 gallic acid를 사용하였고, 실험농도의 범위는 25-500 µg/mL 로 사용하였다. 항산화 활성은 아래 와 같은 식으로 계산하였다.
×
2.2.2 ABTS radical scavenging
ABTS radical scavenging은 증류수에 용해한 7 mM의 ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 혼합하여 12-16시간 동안 암소에 방치하여 radical stock 용액을 제조하여, 이 용액을 PBS (pH 7.4)로 흡광도 값이 0.80±0.02이 되도록 희석 하였다. Radical 용액 200 µL에 시료 40 µL를 가 하여 15분 동안 방치 후 730 nm에서 흡광도를 측정 하였다[13]. Positive control로 gallic acid를 사용 하였고, 지의류 추출물은 50-250 µg/mL 농도를 사 용하였으며, 계산식은 아래와 같다.
×
2.2.3 Hydroxy radical scavenging
지의류 추출물 0.5 mL를 1 mL의 9 mM FeSO4, 1 mL의 9 mM 살리실산 및 0.5 mL의 0.3% H2O2 와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 흡광도를 SCINCO UV-Vis spectrophotometer s-3100 (Seoul, Korea)을 이용하여 510 nm에서 측 정하였다[14].
×
2.3. 총 폴리페놀 함량 분석
Folin-Ciocalteu 시약을 증류수로 10 배 희석한 용액과 2 % Na2CO3 (w/v)와 1:1:1의 비율로 혼 합하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 혼합 물의 흡광도를 SCINCO UV-Vis 분광 광도계 s-3100 (Seoul, Korea)을 사용하여 750 nm에서 측정 하였다[15].
2.4. 총 플라보이드 함량 분석
Total flavonoid content (TFC)는 Chang (2002)의 방법을 변형하여 측정하였다[16]. 농축한 추출물을 MeOH를 사용하여 1,000 ppm 농도로 제 조하여 사용하였다. 0.5 mL 추출물 1,000 ppm과 1.5 mL methanol, 0.1 mL 10% aluminum
chloride, 0.1mL 1 M potassium acetate, 2.8 mL 증류수를 혼합 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰 다. UV-VIS spectrophotometer을 사용하여 415 nm 파장에서 반응시킨 용액의 흡광값을 측정하였다.
TFC는 표준물질인 gallic acid기준 농도 µg/mL로 나타내었다[17].
2.5. 세포독성평가
대식세포인 Raw 264.7 cell line 을 10% fetal bov ine serum (FBS, Gibco BRL, USA), 0.2% sodium bicarbontate 를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle' s medium (DMEM; Sigma, USA)를 배지를 사용하 여, 37℃ 온도에서 4% CO2 상태로 배양하였다. 세포가 바닥 면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대배양하여 실험을 진행하였다. 이때, 독성실험 농도 범위는 25-250 µg/mL이었다. Vistica의 방법[18]에 따라 2.5 mg/m L MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny ltetrazolium bromide) 용액을 well당 100 µL씩 넣어 1시간 동안 배양기에 방치한다. 이후 상등액을 제거하고 DMSO를 well당 200 µL씩 가하고 1분간 shaking하여 formazan을 완전히 용해시킨 후 ELISA Bio-Tek inst rument Inc. (Winooski, VT, USA)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다[19].
2.6. 통계처리
모든 결과 값은 세 번 반복실험 후 통계처리 하였으 며, 실험에 의해 얻어진 값들의 평균으로 나타내었다.
대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 SPSS 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용 하여 t-Test 를 실시하였으며, p<0.05 이하 경우 유 의 하다고 판정 하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 항산화 활성 분석
담색국화잎지의류를 3가지 방법(water, 100%
ethanol, 100% Alkali)으로 추출하였다. DPPH radical scavenging 실험결과 항산화 활성이 가장 높은 추출방법은 alkali 추출이었으며, 활성이 가장 낮게 측정 된 추출방법은 열수 추출이었다. 각 시료의 DPPH IC50 범위는 106.89-439.06 µg/mL으로 확인되었다 (Table 1, Figure 2). ABTS radical scavenging 실 험결과 DPPH radical scavenging 실험결과와 마찬가 지로 alkali 추출 방법의 항산화 활성이 가장 높게 측정 되었다(Table 1, Figure 3). IC50 범위는 42.98-167.27 µg/mL으로 확인되었는데 이는 DPPH radical scavenging 활성에 비해서 약 2배 정도 높게 측정된 결과이며, 양성대조군인 gallic acid와 유사한 정 도의 항산화 활성을 나타낸다. Hydroxy radical scavenging 활성에서도 alkali 추출방법이 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다(Table 1, Figure 4). 기존 의 연구에서 북극 이끼종인
Cladonia sp, Sterocaulon
sp
,Umbilicaria sp. Cetraria sp
를 다양한 용매로 추 출하여 진행하였는데 메탄올 추출물의 항산화 활성이 가 장 높다고 보고하였다[20]. 본 실험에서는 3가지 항산화 활성 실험방법 (DPPH, ABTS, Hydroxyl radical scavenging) 전체에서 alkali 추출물의 항산화 활성이 가장 높게 측정되었는데, 이와 같은 이유는 alkali 추출 시 리그닌과 같은 폴리페놀 단량체가 다량으로 추출되어 항산화 활성이 높게 측정되는 것으로 생각된다. 또한 지 의류의 종류와 추출방법 및 채취 시기 따라 폴리페놀 성 분 및 생리활성을 나타내는 성분들의 함량도 달라질 수 있을 것으로 생각된다.DPPH radical scavengingConcentration (mg/ml)
0 100 200 300 400 500 600
Activity (%)
0 20 40 60 80 100 120
X. M. EtOH X. M. Water X. M. Alkali Gallic acid
Figure 2. Results of DPPH radical scavenging activity from
Xanthoparmelia meximcana
extracts.ABTS radical scavenging
Concentration (mg/ml)
0 100 200 300 400 500 600
Activity (%)
0 20 40 60 80 100 120
X .M. EtOH X. M water X. M Alkali Gallic acid
Figure 3. Results of ABTS radical scavenging activity from
Xanthoparmelia meximcana
extracts.Hydroxyl radical scavenging
Concentration (mg/ml)
0 100 200 300 400 500 600
Activity (%)
0 20 40 60 80 100
X. M EtOH X. M Water X. M Alcali Gallic acid
Figure 4. Results of Hydroxyl radical scavenging activity from
Xanthoparmelia meximcana
extracts.Table 1. Antioxidant activity results and total polyphol contents results of X. M EtOH, X. M Water and X. M Alkali.
Sample
IC50 (µg/mL)
TPC (µg/mL) TFC (µg/mL)
DPPH ABTS Hydroxyl
radical
X. M EtOH 439.06 161.27 330.93 63.75 56.23
X. M Water 359.31 107.51 233.18 50.14 16.30
X. M Alkali. 106.89 42.98 164.31 71.61 87.86
3.2. 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량 분석 본 실험에서는 담색국화잎지의류를 3가지 방법 (water, 100% ethanol, 100% alkali)으로 추출하 여 총 플라보이드 및 폴리페놀 함량을 측정하였다.
Alkali 추출시 pH당 중량대비 pH 7.0 1:1:1 (w/w/w) 3개의 시료로 나누어 상온에서 1에서 3 N 범위의 HCl 용액을 이용하여 실험을 진행하였으며, 3 가지 추출 방법 중에서 alkali 추출 시료군의 가장 높 은 플라보이드 함량 및 폴리페놀 함량을 나타내었다 (Table 1). 본 실험에서는 추출 방법에 따라 총 플라 보노이드 함량 및 총 폴리페놀 함량은 각각 다르게 측 정되었다. 기존의 연구에서 methanol 추출 및 ethanol 추출 방법으로 실험을 진행하였는데 본 실 험에서 사용한 용매인 alkali 추출 실험결과보다 낮은 플라보노이드 및 폴리페놀 함량을 나타내었다. 이와 같은 결과는 alkali 추출이 유기용매 추출 및 주정 추 출보다 높은 플라보이드 및 폴리페놀 함량을 보이는 성분을 추출할 수 있음을 나타낸다.
3.3. 세포 독성 실험 결과
지의류는 장수 식물이지만 외부 환경 변화에 민감하 여 주로 오존층의 손상 정도 및 금속의 오염도를 산정 하기 위한 지표로 연구가 되어 왔다. 본 연구에서는 기존의 연구에서 다루어지지 않았던 담색국화잎지의 독성에 대하여 탐색하고 화장품 소재로써의 가능성에 대해 조사하였다. 담색국화잎지의류 alkali 추출물의 세포 독성을 측정하기 위하여 각각 25, 50, 100, 250 µg/mL 농도 범위에서 세포 독성을 측정하였다.
24시간이 지난 후 세포 독성을 확인한 결과 세포독성 은 나타나지 않았다 (Figure 5). 기존의 연구에서는 acetone에 추출한 담색국화잎지의류의 세포독성을 확 인하였는데 100 µg/mL 이하의 농도에서 확인되었으 며, 이와 같은 실험결과는 본 실험결과와 비슷한 수준 의 독성 실험결과이다[21]. 다른 연구에서는 남극 지 의류인 Ramalina terebrata에서 분리 정제된 라말 린(γ-glutamyl-N'-(2-hydroxyphenyl)hydrazide) 의 독성을 확인하였는데 세포 독성이 나타나지 않았던 농도는 10µg/mL 이하로 확인되었다[22]. 이와 같은 결과로 보았을 때 담색국화잎 지의류는 다른 종류의 지의류보다 독성이 낮은 것으로 판단되며, 추후 alkali 추출 이외에 여러 가지 다양한 추출 방법에서 추출한 시료의 독성 범위를 확인할 필요가 있다고 사 료된다.
Figure 5. Results of MTT assay from Xanthoparmelia
meximcana alkali extracts.
4. 결론
본 실험에서는 담색국화잎지의류를 3가지 방법 (water, 100% ethanol, 100% Alkali)으로 추출하 여 항산화 활성, 총 플라보이드 및 폴리페놀 함량을 측정하고 독성평가를 통해 화장품 조성물써의 가능성 에 대해 조사하였다. 실험결과 추출방법 중 alkali 추 출 방법이 가장 높은 플라보노이드 함량 및 폴리페놀 함량이 측정되었다. 항산화 활성 실험에서도 alkali 추출 방법으로 추출한 지의류의 항산화 활성이 가장 높게 측정되었다. ABTS radical scavenging 활성에 서는 양성대조군인 gallic acid 의 활성과 비슷한 수 준의 항산화 활성을 보였으며, IC50 값은 42.98 µ g/mL으로 확인되었다. 담색국화잎지의류 alkali 추출 물의 세포독성을 Raw 264.7 대식세포에서 확인하였 는데 100 µg/mL 이하의 농도에서 독성이 나타나지 않았으며, 화장품에 적용 시 매우 안전할 것으로 판단 된다.
참고문헌
1. Moon, S. J. and Na, M. S., J. Kor. Soc. Cosm.
24(6), 1148-1157 (2018).
2. Korea National Arboretum, A Field Guide to Lichens, 14-18 (2015).
3. Bates, S. T., Cropsey, G. W., Caporaso, J. G., Knigh t, R., and Fierer, N., Appl. Environ. Microbiol., 77 (4), 1309-1314 (2011).
4. Zambare, V. P. and Christopher, L. P., Pharm. Biol., 50(6), 778-798 (2012).
5. Brodo, I. M., Sharnoff, S. D., & Sharnoff, S. (2001).
Lichens of North America Yale University Press. Co nn, New Haven.
6. Alpsoy, L., Orhan, F., Nardemir, G., Agar, G., Gullu ce, M., & Aslan, A. (2015). Antigenotoxic potencies of a lichen species, Evernia prunastri. Toxicology an d industrial health, 31(2), 153-161.
7. Ravaglia, L. M., Goncalves, K., Oyama, N. M., Coel ho, R. G., Spielmann, A. A., & Honda, N. K. (201 4). In vitro radical-scavenging activity, toxicity agains t A. salina, and nmr profiles of extracts of lichens c ollected from Brazil and Antarctica. Quimica Nova, 3 7(6), 1015-1021.
8. Rhie, J. S. and Lee, D. Y., Text. Color. and Finish., 11(6), 43-50 (1999).
9. Lee, H. J., Yoo H. J., Rhie, J. S. and Lee, D. Y., Text. Color. and Finish., 12(1), 12-16 (2000).
10. Kim, H. M., Kim, S. B. and Jang, A. R., Korea Jour nal of Human Ecology., 21(4), 791-803(2012).
11. Oksanen, I. J. Microbial. Biotechnol. 73, 723-734 (20 06).
12. Park, E. J. and Jhon, D. Y., LWT-Food Sci. Techno l. 43(4), 655-659 (2010).
13. Lee, S. O., Lee, H. J., Yu, M. H., Im, H. G. and Le e, I. S., Korean J. Food Sci. Technol. 37(2), 233-24 (2005).
14. Sanchez-Moreno, C., Food Sci. Technol. Int. 8(3), 12 1-137 (2002)..
15. Choi, S. Y., Kim, Y. C. and Chang, B. S., Korean J.
Microscopy 41(3), 169-177 (2011).
16. Chang, C. C., Yang, M. H. Wen, H. M. and Chern, J. C., J. Food Drug Anal. 10(3), 178-182 (2002).
17. Jo, H. G. Kim, D. S. and Shin, H. J., KSBB. J., 32 (1), 63-70 (2017).
18. Silvio Vaz Jr. Analytical Techniques and Methods for Biomass. Springer International Publishing Switzerlan d, 15-44. (2016).
19. Choi, M. H., Jeon, Y. J. and Shin, H. J., KSBB. J.
30(4) 191-196 (2015).
20. Kim, M. K., Park, H. and Oh, T. J., Korean J. Micr obiol. Biotechnol. 40(4), 333.338 (2012).
21. Yeash, E. A., Letwin, L., Malek, L., Suntres, Z., Knu dsen, K., and Christopher, L. P., J. Sci. Food Agric., 97(14), 4721-4726 (2017).
22. Chang, Y. H., Ryu, J. S., Lee, S. H., Park, S. G., B hattarai, H. D., Yim, J. H., and Jin M. H. J. Soc. C osmet. Scientists Korea 38(3), 247-254 (2012)
