국내산 산양유 casein의 이화학적 특성에 관한 연구

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동물자원연구 10 : 110~ 115. 1999

Annals of Animal Resources Science 10 110~ 115. 1999

김거유·이승법

강원대학교 축산가공학과

Studies on physicochemical characteristics of the domestic goat milk casein.

G. Y. Kim and S. B. Lee

Department of Animal Food Science and Technology, Kangwon National University

ABSTRACT

This experiment was carried out to investigate the physicochemical characteristics of the domestic goat milk casein. The results obtained were summarized as follows ^’

1. By SDS-PAGE, goat casein had less amount of α sl-casein and much amount of α잊

-casein compared with cow casein. By urea-PAGE. goat casein had much amount of ß -casein and less amount of K -casein.

2. The goat milk caseins fractionated by FPLC were separated into five main peaks. When each peakobtained by FPLC was examined by SDS-PAGE. K -casein was separated clearly. But α's-caseins and ß -casein was not separated clearly, which were mingled each other.

Key words Goat milk

,

casein

,

SDS-PAGE

,

urea-PAGE

,

FPLC

1 .

서 론

산양유 casein은 aSl-casein, α얄casein， 더

-casein 빚 K -casein으로 구성 되 어 있으며 총 단백질 함량의 77% 정도를 함유하고 있는 주 요 단백질이다. 산양유 casein의 조성은 α히

casein 5.6%^, α열-casein 19.2%^, ß -casein

54.8% 빛 κ -casein 20.4 %로써 우유( α히

-casein 38 %, α~casein 12%, ß -casein 36%

및 κ -casein 14 % )와 상당한 차이점을 가지 고 있다 (Remeuf와 Lenoir, 1986^), 산양유의

casem 단백질은 모유의 단백질과 분자구조가

흡사하여 소화흡수력 이 좋을 뿐만 아니 라 셜 사 혹은 복통 등의 부작용을 야기 하지

- 110 -

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않으며 , casein micelle의 크기 가 80nm정 도로 써 우유에 비 하여 작다 (Urbiene등， 1997), 또 산양유는 rennet에 의한 응고 시간이 길고 생성된 curd의 강도가 부드러운 특정을 나타 내며， 산성화( acidification) 에 의해서 만들어 진 gel도 부드러운 조직을 나타낸다 (Remeuf，

1992) . 산양유의 이러한 특정들은 위내 소화

효소에 의한 분해가 용이하여 소화 흡수가 잘 된다는 것을 나타내주고 있다( Jenness^, 1980) .

이와 같이 산양유는 우유와 비교하여 상이 한 이화학적 특성을 가지고 있다. 따라서 산 양유를 이용하여 고품질의 유제품을 제조하 기 위해서는 산양유의 이화학적 특성에 대한 충분한 이해가 필요하다고 하겠다. 그러나 지 금까지 극내 산 산양유 casem의 특성 에 대 한 연구는 미약하여 casein의 조성비율이나 그 외 casein의 특성 이 아직까지 잘 알려지 지 않은 상태이다，

따라서 본 연구는 극내산 산양유의 이용성 증진을 위한 기초연구로써 산양유 casein의 이화학적 특성을 조사하고자 실시하였다.

ll.

재료 및 방법

1. 재 료

실험에 사용한 산양유는 강원도 홍천 소재 의 조롱골 목장에서 착유한 혼합유를 착유 후 3시간 이전에 사용하였으며， 우유는 강원 대학교 부속목장에서 사욕중인 holstein 유우 로부터 착유한 혼합유를 착유 후 3시간 이전 에 사용하였다.

2 산케이신의 조제

산케 이신의 조제는 Barrefors등 (1985) 의 방 법에 따라 실시하였다. 원유를 fc 에서 4 ，000rpm으로 20분간 원 심 분리 (Beckman,

J2-21. Germany) 하여 지방을 제거한 탈지유 를 1M HCl을 이용하여 pH를 4.6으로 조정 하여 산케이신을 조제하였다. 산케이신을 fc 에서 2， 000rpm으로 10분간 원섬분리한 후 증류수로 2 회 세척하고 1M NaOH 로 pH 를 6.8로 조정 하여 하루 밤 동안 용해 하였다. 용 해된 산케이신을 다시 1M HCl로 침전시켰 으며， 위의 조작을 반복한 후 증류수에서 72

시간 투석 후 동결건조하여 사용하였다. 단 백질의 정량은 Lowry⁽¹95U 방법에 따라 실 시하였다.

3.

Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE

,

urea-PAGE)

Casein의 조성과 분리특성을 조사하기 위 하여 산케이신을 SDS-PAGE 와 urea-PAGE

를 실시하였다. 전기영동 장치로는 Mighty Small SE-245( Hoefer, USA) 를 사용하였다.

SDS-PAGE는 Protein electrophoresis application guide( Hoefer, 1994) 에 따라 실시하였다.4%

와 12% 의 stacking gel과 separa ting gel을 사 용하였으며 , 0.19M glycine^, 0.025M tris 빛

0.1 % SDS를 함유하는 buffer를 사용하여

15mA (Hoefer, EPS2A200, USA) 에서 분석하 였다. Urea-PAGE는 Kwai와 Kroeker (1 984) 의 방법에 따라 실시하였다. 4M urea를 함유하 는 4% 의 staking gel과 6M urea를 함유하는

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6% 의 separating gel을 사용하였으며 , O.l9M

glycine과 0.024M tris를 함유하는 buffer를 사용하여 5mA에서 실시하였다 0.01%

coomasie brilliant blue R -250용액 (methanol acetic acid wa ter 50 10 40) 에 서 2시간 동안 염색 후 탈색액 (methanol

acetic acid water 25 10 4이으로 12

시간 동안 탈색하였다.

4. Fast protein liquid chromatography (FPLC)

산양유와 우유의 casein조성 을 알아보기 위하여 FPLC를 실시하였다. FPLC 에서 얻 어진 각 fraction의 정성분석은 전기영동에 의하여 실시하였다. FPLC 에서 얻은 각 분 획의 casein을 증류수에서 48 시간 동안 투석 한 후 동결건조하여 전기영동에 의하여 분석

(SDS-PAGE) 하였다. FPLC 는 Davies와

Law( 1977) 의 방법에 따라 실시하였으며，

FPLC장치 로는 Acta purifie^r(Pharmacia, Sweden) 를 사용하였다. Column은 Mono Q HR 5/5( Pharmacia^, Sweden) 를 사용하였다.

Starting buffer는 O.OlM 2-mercaptoethanol과

3.3M urea를 함유하는 O.01M imidazole- HC^l(pH 7.0) buffer를 사용하였으며， 0.5M

NaCl을 이 용하여 농도 경 사 (gradient) 를 주 였다. 정제된 단백질은 starting buffer에 용 해한 후 0.45μm filter (Millipore^,USA) 로 여과 하여 0.1 ml 를 column에 주입하였다. 유속은 1

ml/min로 하여 280nm에서 흡광도를 측정하 였으며， 2ml 씩 분획을 채취하였다.

ill.

결과 및 고찰

1. 전기영동 (urea-PAG E， SDS-PAGE)

에 의한 우유와 산양유 casein의 분리

우유와 산양유 casein의 분리 특성을 조사 하기 위하여 동일한 조건에서 SDS-PAGE 와 urea-PAGE 를 실시하였으며， 그 결과는 Fig.

1 과 Fig. 2와 같다. SDS-PAGE 의 결과 산양 유의 αsl-casein 함량은 우유와 비 교하여 적 었으며， αsrcasein 함량은 많음을 알 수 있 었다 (Fig. 1). SDS-PAGE 에서 ß -casein과

κ-casein은 이동도가 유사하여 분리가 명확 하게 이루어지지 않아 ß -casein과 K -casem

을 명확히 구분하기 위하여 urea-PAGE 를 실시하였다 (Fig. 2), Urea-PAGE 에서 산양유 의 더 -casem 함량은 우유와 비교하여 많았으 며 ， ^K-casein 함량은 적 게 나타났다 (Fig. 2),

2. FPLC를 이용한 우유와 산양유 casein

의 분리 특성

동일한 조건에서 우유와 산양유 casem의 FPLC 에 의한 분리를 실시하였으며， FPLC

로 분리 된 각 fraction들을 SDS-PAGE를 이 용하여 정성 분석을 실시하였다. 우유 casein

은 크게 4개의 fraction으로 분리되었으며

(Fig. 3)^,산양유 casein은 크게 5개의 fraction

으로 분리되었다 (Fig. 4^),

Fig. 5는 우유 casein의 FPLC fraction들을 SDS-PAGE 로 확인한 결과이다. 그 결과

lane. 3은 K -casein^, lane. 4와 lane. 5는 3 -casein 그리 고 lane. 6은 as-casein으로 확 인

이

‘ /

-- --

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극내산 산양유 casein의 이화학적 특성에 관한 연구

되었다. 이와 같은 결과로서 Fig. 3의 우유 casem은 peak 1은 K -casein. peak 2와 peak

3은 ß -casein peak 4는 αs-casein으로 확 인 되였다.

Fig. 6은 산양유 casem의 FPLC fraction들 을 SDS-PAGE 로 확인한 결과이다. 그 결과

lane. 3은 K -casein 이 었 으며 . lane. 4와 lane.

5는 더 casein 이 가장 많은 양을 차지했지만 αs-casein 이 섞 여 있 었 다. Lane. 6은 αs

casein. lane. 7은 ß -casein 이 였 으며 . lane. 8

은 뚜렷한 분리능을 보여주지 못하였고 모든

casein fraction들 이 섞 여 서 용출되 었 다. 이 와 같은 결과로서 Fig. 4의 산양유 casem은

peak 1 이 K -casein. peak 2가 ß -casein과 αs

-casein. peak 3 이 β -casein. peak 4가 β -casem과 αs-casein. peak 5가 αs-casem으로 확인되었다.

우유 casem은 anion ion exchange 컬 럼 에 의하여 각 casem들이 뚜렷한 분리 양상을 나타내였다 (Fig. 3), 그러나 산양유는 κ -casein은 단독으로 분리되었으나， 그 외 casein틀은 혼합된 상태로 분리되어 명확한 분리가 이루어지지 않았다 (Fig. 4), 특히 더 -casem은 우유와는 상 이 하게 αs-casein과 혼 합된 상태로 분리되었다. 산양유 ß -casein은

lysine. arginine. histidine등의 염 기 성 아미 노 산 조성은 우유와 차이가 없으나 산성 아미 노산 인 glutamic acid 가 43개 로서 우유의 18

개에 비하여 약 2.3배가 많다. 음 전하를 띄 는 R group을 가지고 있는 glutamic acid가 많은 산양유의 ß -casein은 음 이온 교환 수 지에 강하게 흡착하였기 때문에 분리능이 낮 은 것으로 생 각된다 (Jenness. 1980),

산양유의 αSl-casem 은 우유에 비 하여 매 우 적은 양이 함유되어 있으며， 이러한 점은 casein의 응고특성에 매우 콘 영향을 미친다

( Roberto등. 1988), 본 실험에서 산양유 각 casein의 분리가 우유보다 명확하게 이루어 지지 않은 것은 본 실험에서 사용한 완충액 에 의하여 casein 켈의 3차 구조가 완전히 풀 어 지 지 않은 것 이 ( Chianese둥. 1992) 원 인의 하나로 생각된다.

94,000 - - 67,000 찌...，

a.,-casein 43,000 쓸.. ^a^Ol^-C8seln ^“ⁱ

-흩.흩‘ 、」휴슐나에￥융빼빼툴.톨톨， -a ’，，-τcase민m n ¹ 30α’%뼈0 빼찌혔!IIIP'繼繼繼輪&훌神똘쫓 ‘얘β-cas椰 _e_히빠in n

、""'''''' /C -casein

20,100 ' 14,400 .행.

2 3 4 5 6

Fig^, 1^, 12% SDS-PAGE profile of cow and goat milk casem.

Low molecular weight marker(phosphorylase b 94.000. bovine serum albumin 67.000.

ovalbumin 43.000. carbonic anhydrase 30.000. soybean trypsin inhibitor 20.100. α

-Iactalbumin : 14.400).

2 Gs-casein standard. 3 ß -casein standard.

4 K -casein standard. 5 Goat milk casein.

6 Cow milk casein.

IC -casein

췄

β-casein 초 廠

n 옮

2 3 4 5

Fig^, 2. Urea-polyacrylamide gel electrophoretic patterns at pH 8.6 of cow and goat milk casein.

α'çcasein standard. 2 ß -casein standard.

3 K -casein standard. 4 Goat milk casein.

5 Cow milk casein

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1000 짧넓、‘

800

600

400

200

0.0 10.0 20.0 ml

Fig. 3. Fast protein liquid chromatogram of cow milk casein on Mono Q HR 5/5.

mAU 1000

800

600

400

200

t뼈밟향 gμ빼”

繼췄JIIB짧， /

10.0 20.0

Eε

ml

Fig. 4. Fast protein liquid chromatogram of goat milk casein on Mono Q HR 5/5.

94,000 빼.

67,000 훌聊·

43,000 했흙

ι 훌-률 를톨← <<.-caseln 30，00삐 훌뿔뺏뚫훌 &‘“‘0 ，，，，，，，"ι 댔뤘F

홈뿜쨌繼 l톰톰름“ <…’ iβ-때sein

컸T“ “ +

IC-casein 20.100 홉빼i

14,400 홉톨

2 3 4 5 6

Fig. 5. 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoretic patterns of fractions shown in Fig. 3.

Low molecular weight marker( phosphorylase b 94.000. bovine serum albumin 67.000.

ovalbumin 43.000. carbonic anhydrase 30.000. soybean trYPsin inhibitor 20.100. a

-Iactalbumin : 14.400).

2 Cow milk casein. 3 Peak 1. 4 Peak 2. 5 peak3. 6 : peak 4.

94,000 . . .

67，0때 훌삐‘

43,000 뺏.，

30,000

14,400 했%

1 2 3 4 5 6 7 8

_ a" 1 -caseln - a" 2 -caseln - ß-caseln

IC -casejn

Fig. 6. 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoretic patterns of fractions shown in Fig. 4.

1. : Low molecular weight marker( phosphorylase b 94.000. bovine serum albumin 67.000.

ovalbumin 43.000. carbonic anhydrase 30.000. soybean trypsin inhibitor 20.100. a

-Iactalbumin 14.400).

2 : Goat milk casein. 3 Peak 1. 4. peak 2. 5 peak 3 + peak 4. 6 peak 5. 7 peak 3. 8 peak 4.

N. 요 ^{。 t}ï

산양유 casein의 이 화학적 특성 을 우유와 비교 조사하였으며， 그 결과를 요약하면 다 음과같다.

1. SDS-PAGE 에 서 산양유의 αsz-casein 함 량은 우유와 비교하여 적였으며 . a sz- casein 함량이 많았다. Urea-PAGE 에서산양유의

ß ^-casein함량은 우유와 비교하여 많았으

며 . K -casem 함량이 적 었다.

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2. FPLC 에 의 하여 분리 된 산양유 casem은 크게 5개의 fraction으로 분리되었다. 각분 획을 SDS-PAGE 에서 분석한 결과 κ -casein은 단독으로 분리 되 었 으나， αs- casein과 더 -casein은 각 casein 이 혼합된 상태로 용출되어 명확한 분리가 이루어지 지 않았다.

V.

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