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Enterococcus faecalis EF-2001 유산균 사균체 첨가 발효유의 항산화 효과
강효진1 · 김태운1 · 주진우2· 김거유2*
강원대학교 동물생명과학대학 동물응용과학과 대학원생1, 교수2
Antioxidant Effects of Fermented Milk Added with Enterococcus faecalis EF-2001 Heat-Killed Probiotics
Hyo-Jin Kang1, Tae-Woon Kim1, Jin-Woo Jhoo2 and Gur-Yoo Kim2*
1Graduate Students, 2Professors, Department of Applied Animal Science, College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
ABSTRACT
1)
The creation of probiotic-containing fermented milk products for use by human is an important research topic and has high potential for development. Also, studies have shown that heat-killed probiotics are more stable and easier to use than live probiotics. However, as of this time, research has not been reported in Korea that has evaluated the product or functionality of fermented milk after the addition of heat-killed probiotics. This study was conducted to verify the physiological activity of heat-killed Enterococcus faecalis EF-2001 after its addition to Lactobacillus-fermented milk. Briefly, NFM normal fermented milk (NFM) was used as the control sample, whereas fermented milk with 100 µg/mL EF-2001 (EFM1) and fermented milk with 500 µg/mL EF-2001 (EFM2) were used as the treated samples. Among the samples, EFM2 had the highest acidity of 1.15, but no other factors significantly differed (p<0.05). Furthermore, EFM2 had the highest Lactobacillus count of 9.22 (p<0.05). ABTS, DPPH and FRAP were measured to determine the antioxidant activity of the samples. With respect to those parameters, EFM2 had the highest antioxidant measurements.
Therefore, the study confirmed that the addition of E. faecalis EF-2001 to NFM is suitable with the standard and does not affect the quality of characteristics. In conclusion, the treatment sample had higher antioxidant activity than did NFM; this result may be used as a basic for further research and as a guideline for the manufacturing of heat-killed probiotic-containing NFM.
(Key words: Fermented milk, Lactic acid bacteria, Heat-killed probiotics, Antioxidant, Quality)
*
Corresponding author: Gur-Yoo Kim, Department of Applied Animal Science, College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea. Tel : +82-33-250-8647, E-mail: [email protected]
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.ko), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. The moral rights of the named author(s) have been asserted.
Ⅰ. 서론
가공유, 특히 국내 발효유 시장은 꾸준한 성장을 기록 하는 유일한 품목으로 위, 간, 장 건강 등을 위한 기능성 발 효유가 크게 성장하고 있다. 인체에 유용한 프로바이오틱 유산균을 이용한 발효유 제품의 연구개발은 중요한 연구
주제이며 발전가공유, 특히 국내 발효유 시장은 꾸준한 성 장을 기록하는 유일한 품목으로 위, 간, 장 건강 등을 위한 기능성 발효유가 크게 성장하고 있다. 인체에 유용한 프로 바이오틱 유산균을 이용한 발효유 제품의 연구개발은 중요 한 연구 주제이며 발전 가능성이 높다(Yoon, 2011). 대표적 장수식품인 발효유는 원유 또는 유가공품을 유산균, 효모
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로 발효시킨 것으로 정의된다(Choi et al., 2013). 현재 발효 유의 추세는 천연소재를 첨가하여 기능성을 높이는 것인 데 특히 항산화 활성에 관한 연구가 많이 보고되어 있다. 메밀, 마늘, 오가피, 유자 산수유, 통 보릿가루 등의 기능성 소재를 첨가해 기존 발효유보다 항산화 활성을 높이는 방 향의 연구가 진행되고 있다(Yeo et al., 2017). 발효유는 우 유 성분 외에 유산균의 작용으로 lactic acid, peptone, peptides, oligosaccharides 등이 생성되고, 유산균이 있어 영양학적으로 우유보다 다양한 건강증진 효과가 있다(Lee, 2005). 우리 몸에서 발생하는 질환은 90%가 활성산소와 관 련이 있다고 하는데(Kim et al., 2012), 이러한 활성산소에 대해 유산균은 스스로 보호하여 활성산소의 제거해 환원 작용을 통해 항산화 작용을 하고 활성산소로 인해 일어나 는 질병을 예방하는 효과가 있다(Choi et al., 2018). 또한 장내 유해 세균의 억제와 유용균의 증진, 면역계의 자극에 의한 항암작용 및 혈중 콜레스테롤 저하 등 성인병 예방과 건강증진에 탁월한 기능을 나타낸다(Song et al., 2013). 유 산균의 영양적인 부분과 더불어 유산균을 이용한 식품은 유산에 의해 저장성이 향상되고, 식품의 향미와 조직개선 기능 등 유산균의 발효로 인해 식품의 영양 및 기능성이 증가하였다(Jin et al., 2016).
최근에는 유산균의 생균체 뿐만 아닌 사균체와 대사산 물의 in vivo, in vitro 면역 조절기능에 관한 연구가 이루어 지고 있으며, 사균체가 생균체보다 안정성이 높고 이용에 용이하다는 연구가 있다(Choi et al., 2018). 현재 국내의 유 산균 사균체는 외국에 비해 연구가 부진한 상황이며, 생균 과 비교해 천연물 원료로 인식하고 접근하거나, 일반 식품, 건강기능식품, 제약, 사료 등 적용 범위가 넓혀지고 있다고 한다(Kim, 2018). 열처리 유산균 사균체 중 1g당 7조 5천억 개의 유산균을 가지는 Enterococcus faecalis EF-2001은 사전 연구에서 알려진 주요 활성으로 항염작용, 감염억제작용, 항암작용, 면역조절(Immuno-modulation)작용, 정장작용, 기타작용으로 항암치료와 관련된 방사선 치료 시 보호 효 과 등 다양한 생리활성을 지닌다는 연구가 보고된 바 있다 (Kim, 2018). Gu 등(2017)의 연구에서는 EF-2001 유산균 자 체의 항산화 효과를 확인한 바 있다.
현재 국내에서는 사균을 첨가한 식품이나 의약품 등의 제품은 판매되고 있지만, 사균체를 발효유에 첨가해 발효 유 제품이나 기능성을 평가한 연구는 아직 보고된 바 없 다. 이 논문은 발효유에 Enterococcus faecalis EF-2001 유산 균 사균체를 첨가하였을 때, 기존 발효유와 비교하여 품질 및 항산화 활성의 차이에 관한 연구를 실시하고자 수행하 였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
본 연구에서는 발효유를 제조하기 위하여 시유(서울우유 협동조합, Seoul, Korea)와 탈지분유(서울우유협동조합, Seoul, Korea)를 마트에서 구매하여 사용하였다. 발효유에 첨가되 는 Starter는 상업용 동결건조 유산균으로 Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium animalis ssp.
lactic.의 유산균이 포함된 Lyofast YAB 450 AB(Sacco srl., Italy) 제품을 구매하여 사용하였다. 발효유에 첨가된 열처 리 사균체 Enterococcus faecalis EF-2001은 1g당 7조 5천억 의 유산균을 첨가한 제품으로 동결 건조된 제품을 사용했 으며 Nihon Berumu Co., Ltd.(Tokyo, Japan)에서 제조된 것을 사용하였다. 유산균들의 저장온도는 –20℃ deep freezer에서 보관하였다.
1. 발효유의 제조
발효유의 조성은 Table 1과 같으며, 발효유의 제조 공정 은 Fig. 1과 같다. 발효유의 무지 고형분을 12%로 맞춘 배 합비에 stater를 제외한 원료를 혼합 후, 95℃에서 10분간 살균하였다. 그 후 37℃로 냉각하여 각각 동결건조 유산균 (Lyofast YAB 450 AB, Sacco srl., Italy)을 0.002%(w/v) 접 종을 하였다. 실험군에는 추가로 Enterococcus faecalis EF-2001(Tokyo, Japan)를 첨가해 최종적으로 농도가 100μ g/mL, 500μg/mL이 되도록 접종하였다. 접종한 후 incubator에서 37℃로 12시간 배양하였고, 발효가 완료된 sample은 4℃ 냉장온도에서 일주일 동안 보관하였으며, 이 후 –20℃ deep freezer에서 보관하여 추후 실험에 사용하 였다.
2. 발효유의 발효특성
우유 95.95mL와 탈지분유 4.05g을 섞은 뒤 95℃에서 10 분간 살균한 sample에 starter 0.002%(w/v)씩 접종하였다.
그 후 EF-2001을 100µg/mL 또는 500µg/mL을 첨가하거나 아예 첨가하지 않은 sample들을 37℃ incubator에서 발효 하면서, 매 2시간마다 sample을 채취하여 pH와 적정산도 를, 매 4시간마다 유산균 수를 측정하였다.
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Table 1. Experimental design of fermented milk
Ingredient Group¹⁾
NFM EFM1 EFM2
Fermentation temperature 37℃ 37℃ 37℃
Milk (mL) 95.95 95.95 95.95
Skim milk powder (g) 4.05 4.05 4.05
Starter (mg) 3 3 3
EF-2001 (mg) - 10 50
¹⁾NFM, normal fermented milk; EFM1, fermented milk added with 100 µg/mL concentration of Enterococcus faecalis EF-2001; EFM2, fermented milk added with 500 µg/mL concentration of Enterococcus faecalis EF-2001; Starter, Lyofast YAB 450 AB ( Streptococcus thermophilus ; Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium animalis ssp ); EF-2001, Enterococcus faecails- 2001 .
Fig. 1. Manufacturing procedure of fermented milk.
(1) pH 및 산도
pH는 pH meter(FiveEasy™ Plus, Mettler- Toledo, Greifensee, Switzerland)를 이용하였다. sample의 pH를 측정하기 위해 표준 완충용액으로 보정 한 뒤 pH meter기 를 이용하여 상온에서 측정하였다. 실험값은 3회 반복하여 평균값을 나타내었다.
적정산도는 시료를 10g씩 비커에 취하여 동량의 증류수 로 희석하여 0.1N NaOH 표준용액을 이용하여 중화적정 하였다. 시료와 증류수를 가한 sample의 pH가 8.3이 될 때 를 종말점으로 하여 NaOH 용액이 소모된 양을 다음의 식 을 이용하여 TA를 계산하였다. 실험값은 3회 반복하여 평 균값을 나타내었다.
Lactic acid (%)= 0.1N NaOH 소비량(mL)×F×0.009 시료의 중량 (g) × 100
F: factor of 0.1N NaOH(2) 유산균 수
시료 1g씩을 0.1% peptone(BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 용액 9mL을 혼합하여 십진 희석법으로 희석하였다.
멸균된 MRS agar(Difco, Ditroit, MI, USA)를 petri dish에 부어 굳히고, 적절한 희석배수의 희석액 1mL를 petri dish 에 접종하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 1mL의 시료 중 형성된 colony수를 계수하여 식품공전에 따라 colony forming unit(CFU)를 log CFU/mL로 표시하였다.
3. 항산화 활성 분석
본 연구에서 항산화 활성측정을 위해 사용된 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis(3-ethyl benzothiazoline- 6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), Potassium persulfate, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman- 2-carboxylic
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acid(Trolox), 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ), ferric chlorid 은Sigma- Aldrich(St. Louis, MO, USA) 사에서 구매하여 측정에 이용하였다.
(1) DPPH 라디칼 소거능 측정
사균 첨가 발효유와 일반발효유의 DPPH 라디칼 소거능 을 측정하기 위한 항산화 실험은 Blois(1958)의 방법을 사 용하였다. 100mM의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 용액을 만들어서 사용하였다. Sample은 NFM, EFM1, EFM2를 에탄올로 5배 희석한 후 3000rpm, 20분의 조건으 로 원심분리를 한 후 0.45µm filter로 여과한 상등액을 sample로 사용하였다. 100µM의 DPPH 용액 100µL과 sample 100µL를 96 well-plate에 넣어 상온의 암실에서 30 분간 반응시킨 후 microplate reader(Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 517nm의 파장에서 흡광 도를 측정하였다. DPPH radical scavenging activity(%)는 다음의 식에 대입해 결과를 나타냈다. Standard 물질은 Trolox를 사용하였다.
Scavenging activity (%) = (1-
/
)×100여기에서
은 DPPH solution과 sample을 혼합한 후 측정한 흡광도 값이며,
는 DPPH 용액에 시료 대 신 에탄올을 100µL 첨가한 후 측정된 흡광도 값이다.(2) ABTS 라디칼 소거능 측정
본 연구에서 사용된 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazo line-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS)를 7mM 농 도로 증류수를 가하여 제조하였다. Potassium persulfate을 140mM 농도에 맞게 증류수를 가하여 제조한 후 ABTS 용 액 5mL와 potassium persulfate 88µL를 혼합 후 실온에서 12-16시간 암실에 보관 후 반응시켜 ABTS⁺stock solution 을 제조하였다. ABTS⁺stock solution은 증류수로 희석하면 서 734nm에서 측정한 흡광도가 0.70±0.02의 값이 나오도 록 제조하여 이것을 working solution으로 사용하였다. 발 효유의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정 전 EF-2001 유산균 자체의 항산화 값을 측정하기 위해, 발효유의 sample과 같 은 전처리를 하여 측정하였다. 사용된 sample은 증류수로 5배 희석하여 3000rpm, 20분의 조건으로 원심분리를 실시 해 얻은 후 0.45µm filter로 여과한 상등액을 sample로 사 용하였다. sample 100µL 와 ABTS⁺ solution 100µL을 96 well-plate에 첨가 후 암실에서 30분간 반응시킨 plate를
microplate reader(Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA)을 이용하여 734nm에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS 라디 칼 소거율 (%)는 다음의 식에 대입하여 계산하였다. 대조 군은 Trolox를 사용하여 비교하였다.
Scavenging activity (%) = (1-
/
)×100여기에서
은 시료를 ABTS+ solution과 혼합한 후 측정된 흡광도 값이며,
는 ABTS+ solution에 시 료 대신 증류수를 100µL 첨가한 후 측정한 흡광도 값이다.(3) FRAP (Feffic-reducing antioxidant power) assay 사균 첨가 발효유와 생균의 ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정은 Benzie 와 Strain(1996)의 방법을 참 고하여 측정하였다. FRAP의 측정은 sodium acetate를 0.3 M으로 증류수로 제조한 후 1M의 NaOH와 1M의 HCl을 이용해 pH를 3.6으로 조정하여 (1) acetate buffer로 사용하 였다. 0.01M의 농도로 2,4,6-tripyridyltriazine (TPTZ, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA)을 40mM HCl 에 녹여 (2) TPTZ solution을 제조하고, ferric chloride도 40mM HCl에 녹여 (3) ferric chloride solution으로 제조하 였다. 시약 (1), (2), (3)을 10:1:1(v:v:v)의 비율로 섞어 37℃
에서 1시간동안 반응 시켜 FRAP reagent를 제조하였다.
발효유 sample은 NFM, EFM1, EFM2 모두 증류수로 5배 희석하여 3000rpm, 20분 원심분리조건에서 원심 분리된 상등액을 sample로 사용했다. Sample을 96 well-plate에 50µL씩 분주하고, FRAP reagent를 150µL를 추가로 분주하 여 5반복을 실시하였다. 이후 37℃ 암실에서 30분간 반응 시켰고, 593nm에서 microplate reader(Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA)을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
Standard는 5mM Trolox를 사용하였고 이를 이용해 단계 별 희석하여 얻은 검량선을 통해 Trolox Equivalent value(µmol/mL)의 값으로 나타내었다.
4. 통계분석
실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 23(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA 분석을 하였으며, 집단 간 비교를 위한 사후분석은 Tukey의 b로 검증하였고 p<0.05 이상일 때만 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하 였다. 모든 분석항목은 3회 이상 반복 시험하여 얻은 결과 를 평균±표준편차로 나타내었다.
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Ⅲ. 결과 및 고찰
1. 발효유의 품질특성
(1) 발효시간에 따른 pH 및 TA의 변화
생균과 사균을 넣은 발효유의 품질특성을 평가하기 위 해 37℃에서 12시간 발효한 발효유의 pH 및 적정산도 결 과를 Fig. 2와 Fig. 3에 나타냈다. pH는 발효시간이 4시간 까지 EFM1이 다른 sample보다 빠른 pH의 변화를 가졌지
만, 6시간 이후부터는 모두 비슷한 pH의 결과를 나타냈고, 모두 4.29-4.35로 발효를 완료하였다. 사균 첨가 발효유인 EFM1과 EFM2는 발효시간에 따라 유의적인 차이를 보이 지 않았지만, 발효종료시간인 12시간에서 NFM은 4.35±
0.0001, EFM1은 4.32±0.0035, EFM2는 4.29±0.0071로 유의 적인 차이를 보였다(p<0.05). 이를 통해 사균을 첨가한 발 효유가 일반 발효유보다는 빠른 pH의 변화를 보였으며 사 균 첨가가 발효에 영향을 주는 결과를 확인하였다.
TA의 결과는 사균을 첨가한 발효유인 EFM1, EFM2의
Fig. 2. pH change of fermented milk during fermentation time.
NFM, normal fermented milk; EFM1, EF-2001 100 µg/mL concentration of fermented milk; EFM2, EF-2001 500 µg/mL concentration of fermented milk; EF-2001, Enterococcus faecalis EF - 2001. Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
Fig. 3. Titratable acidity (TA) change of fermented milk during fermentation time.
NFM, normal fermented milk; EFM1, EF-2001 100 µg/mL concentration of fermented milk; EFM2, EF-2001 500 µg/mL concentration of fermented milk; EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001. Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
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경우 일반발효유인 NFM과 유의적 차이가 없는 결과를 보 였다(p<0.05). 최종 발효종료시간인 12시간에서의 TA는 NFM은 1.12±0.005, EFM1은 1.13±0.007, EFM2는 1.15±
0.007의 결과를 나타내었다. TA의 결과는 낮은 pH의 결과 를 가진 EFM2가 NFM, EFM1 보다 TA의 생성이 높은 결 과를 확인했으며, 사균 농도에 따라 유의적 차이를 보였다 (p<0.05). 본 연구를 통해 사균 첨가 발효유는 사균으로 인 한 새로운 유산이 생기지 않기 때문에 발효유의 품질에 대 해 영향을 끼치지 않는 결과를 확인했다. EF-2001 유산균 자체에는 신맛이 없다고 보고된 바가 있으므로 이를 통해 발효유 제조에 관한 관능평가에도 영향이 없을 것이라고 사료된다. 농후 발효유의 적정 pH는 3.87-4.53, 산도는 lactic acid의 양 0.97-1.4%의 범위라고 알려져 있다(Lee and Hwang, 2006). 따라서 EF-2001 유산균을 발효유에 첨 가하여도 품질의 안정성에는 영향을 주지 않는 결과를 확 인하였다.
(2) 발효시간에 따른 유산균 수 변화
생균과 사균을 넣은 발효유의 유산균 수를 측정하기 위 해 37℃에서 발효시간 4시간 마다(0, 4, 8, 12hr) 1g씩 측정 하여 sample을 십진 희석법을 이용해 희석 후 MRS agar 에 접종 후 48시간 동안 배양시켜 표준 평판 법을 이용해 log CFU/mL의 값으로 나타내었다. 시간에 따른 유산균의 수는 다음 Fig. 4에 나타내었다.
발효종료시간인 12시간의 생균 수는 NFM 9.13±0.0log CFU/mL, EFM1은 9.15±0.0log CFU/mL, EFM2는 9.22±
0.01log CFU/mL의 결과를 나타냈다. 발효시간 4시간까지 는 일반발효유 NFM이 다른 sample보다 높은 생균 수를 나타냈지만 6시간 이후부터 EFM2가 더 많은 생균 수를 나 타냈다. 결과적으로 일반발효유와 비교하면 사균이 첨가될 수록 생균 수는 증가하는 경향을 보였으며, 유의적인 차이 를 나타냈다(p<0.05). 모든 시료의 생균 수는 축산물 가공 기준 및 성분규격에 제시된 농후 발효유의 규격 기준인 1.0×10⁸CFU/mL 이상의 생균 수를 나타내었다. 발효 및 저장 중 유산균의 증식과 생존은 산생성과 상관관계가 있 으며, 균수가 증가할수록 pH는 낮아지고 우유의 유당에 의해 산이 생성되는 것으로 알려진 바 있다(Kim et al., 2020).발효유의 생균 수의 측정을 통해 사균 첨가가 발효유 의 유산 생성 및 품질 적 특성에 영향을 주지 않으며, 일반 발효유보다 빠른 생균 수의 증가로 발효유의 기능성 증가 에 도움을 줄 것이라 예상된다.
2. 항산화 활성 변화
(1) 사균 첨가에 따른 발효유의 DPPH 라디칼 소거 활성 변화
DPPH는 분자 내 radical을 함유하고 있어서, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 및 방향족 아민류인 항산화제 의해 환원시 radical이 소거되어 짙은 자색이 탈색되는 정 도를 항산화 물질의 전자 공여 능으로 측정하는 방법이며, DPPH 분자의 움직임은 hydroxyl radical과 유사하여 free radical 소거실험에 활용된다고 한다(Oh et al., 2018).
Fig. 4. Viable cell counts of lactobacillus of fermented milk during fermentation time.
NFM, normal fermented milk; EFM1, EF-2001 100 µg/mL concentration of fermented milk; EFM2, EF-2001 500 µg/mL concentration of fermented milk; EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001. Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation.
Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
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Fig. 5. DPPH radical scavenging activity (%) of fermented milk.
Trolox, control; NFM, normal fermented milk; EFM1, EF-2001 100 µg/mL concentration of fermented milk; EFM2, EF-2001 500 µg/mL concentration of fermented milk; EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001. Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
사균과 발효유의 DPPH radical 소거 활성 측정결과는 다음 Fig. 5에 나타내었다. 일반발효유 NFM과 사균을 첨 가한 발효유 EFM1의 항산화력은 유의차가 없는 결과를 나타냈지만(p<0.05), EFM2에서는 85%로 모든 처리구보다 높은 항산화 활성을 확인했다. Gu 등(2017)의 연구에서는 EF-2001 사균체의 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH 라 디칼 소거능 실험결과 농도 의존적으로 활성이 높아짐을 확인하였으며, 양성대조군인 Trolox에 대비해 높은 활성을 보여 EF-2001 유산균은 항산화 활성을 가진다고 보고되었 다. 본 연구도 EFM2 발효유의 항산화 활성이 일반 발효유 보다 높아지는 결과로 보아 사균을 발효유에 첨가 시 항산 화 활성이 높아진다는 결과를 얻을 수 있었다.
(2) 사균 첨가에 따른 발효유의 ABTS 라디칼 소거 활성 변화
ABTS radical 소거 활성측정은 potassium persulfate와 반응하여 생성된 ABTS radical이 항산화 물질에 의해 제거 되어 radical 특유의 청록색이 탈색되는 원리를 이용해 항 산화 능을 측정하는 방법이다(Jung et al., 2017). 사균과 발 효유의 ABTS radical 소거 활성측정 결과는 다음 Fig. 6과 Fig. 7에 나타내었다. EF-2001 유산균의 ABTS 라디칼 소거 능 결과는 발효유와 같은 원심분리 조건과 희석을 진행하 여 측정을 진행하였다. 1000, 750, 500, 250, 100, 50 및 10µg/mL의 농도에서 83%, 73%, 70%, 58%, 52% 및 49%의
결과를 확인했다. 이를 통해 사균의 농도 의존적으로 ABTS radical 소거능이 증가하여 항산화 능을 갖는 것을 확인하였으며, 유의적 차이를 보였다(p<0.05).
발효유의 ABTS 라디칼 소거능의 경우에는 NFM은 62%, EFM1은 78% EFM2는 80%의 결과로, 일반발효유보다 사 균을 첨가할 시 더 높은 소거 활성을 보였다. EFM2와 같 은 농도인 50µM의 Trolox와 비교하였을 때 발효유 모두 Trolox보다 높은 활성을 나타내었고, 사균에 농도 의존적 으로 소거 활성이 높아지는 결과를 확인할 수 있었다. 발 효유의 값을 사균의 ABTS 라디칼 소거능의 결과와 비교해 보면 EFM1 처리군은 사균이 100µg/mL 첨가된 농도에서 69%, 사균은 같은 농도에서 58%의 결과를 나타냈으며 EFM2 처리군은 500µg/mL 농도에서 80%, 같은 농도의 사 균 소거 활성은 70%의 효능을 나타냈다. 본 연구를 통해 사균을 발효유에 첨가했을 시 일반 발효유보다 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내는 결과를 확인하였다.
(3) 사균 첨가에 따른 발효유의 FRAP activity 변화 FRAP 측정법은 전자 공여 능력을 통해 산화 활성을 검 증하는 방법으로 산화제로 작용하는 feric tripyridyltriazine (Fe³⁺-TPRZ)와 항산화제가 반응할 시 파란색의 fer-rous tripyridyltriazine(Fe²⁺-TPTZ)로 환원되는 것을 흡광도측정을 통해 정량하는 방법이다( Benzie et al., 1996). 사균의 FRAP 환원력의 결과는 Fig. 8에 나타냈다. Trolox equivalent의
100
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Fig. 6. ABTS⁺ radical scavenging activity (%) of Enterococcus faecalis EF-2001.
Concentration of Enterococcus faecalis EF-2001 is 10-1000 µg/mL. EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001 . Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
Fig. 7. ABTS⁺ radical scavenging activity (%) of fermented milk.
Trolox, control; NFM, normal fermented milk; EFM1, EF-2001 100 µg/mL concentration of fermented milk; EFM2, EF-2001 500 µg/mL concentration of fermented milk; EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001 . Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
값을 얻기 위한 Trolox 농도에 따른 회귀식의 R square 값은 0.995이며, 회귀식에 대입하여 Trolox equivalent의 값으로 제시하였다. 농도 의존적으로 결과값이 증가함을 확인하였 으며, 이를 통해 사균의 항산화 활성을 확인할 수 있었다. 발 효유의 FRAP 측정 결과는 Fig. 9에 나타내었다. 회귀식에 대 입하여 얻은 결과로는, NFM은 85µM, EFM1은 106µM,
EFM2는 108µM의 결과를 확인하였다. EFM2의 발효유와 같 은 농도의 Trolox 에서의 결과값 62µM과 비교해 본 결과 제 조된 발효유 모두 높은 항산화 능을 가짐을 확인했다. 특히 사균 첨가 발효유 EFM1, EFM2의 경우에는 유의적 차이는 없었지만(p<0.05) 생균보다 높은 FRAP 환원력을 보여 사균 첨가가 발효유의 항산화 활성을 높일 수 있음을 확인하였다.
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Fig. 8. FRAP activity (TE of Enterococcus faecalis EF-2001 µM) of Enterococcus faecalis EF-2001.
Concentration of Enterococcus faecalis EF-2001 is 10-1000 μg/mL. EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001. Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
Fig. 9. FRAP activity (TE of Enterococcus faecalis EF-2001 µM) of fermented milk.
Trolox, control; NFM, normal fermented milk; EFM1, EF-2001 100 µg/mL concentration of the fermented milk; EFM2, EF-2001 500 µg/mL concentration of the fermented milk; EF-2001, Enterococcus faecalis EF-2001 . Values are mean of three replicate determination (n=3)±standard deviation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05).
Ⅳ. 요약
인간에게 이로운 프로바이오틱 유산균을 이용한 발효유 제품의 연구개발은 발전가능성이 높은 중요한 연구 주제이 며, 사균체는 생균체보다 안정성이 높고 이용에 용이하다는 연구가 있다. 하지만 현재 국내에서는 사균체를 발효유에 첨가해 발효유 제품이나 기능성을 평가한 연구는 아직 보고 된 바 없다. 본 연구는 Enteococcus faecalis EF-2001 유산균 사균체를 발효유에 첨가하였을 시에 나타나는 생리활성을
검증하고자 실시하였다. 대조군으로 일반 발효유 NFM을 제조하여 사용하였으며, 실험군으로 EF-2001 유산균 사균체 를 100µg/mL의 농도로 넣은 EFM1과 EF-2001 유산균 사균 체를 500µg/mL의 농도로 첨가한 발효유 EFM2를 제조하여 사용하였다. 이들의 품질특성의 평가를 위해 pH, 적정산도, 유산균 수를 측정하였다. 표본 중 EFM2의 산도가 1.15로 가 장 높았으나 다른 표본과 유의적 차이가 없었다(p<0.05). 유 산균 수 또한 EFM2가 9.22로 가장 높았으나 다른 표본과 유 의적 차이가 없었다(p<0.05). 발효유의 항산화 활성측정을
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위해 ABTS 라디칼 소거능, DPPH 라디칼 소거능, FRAP을 측정하였다. 세 실험 모두 EFM2에서 높은 항산화 활성을 보였다. 따라서, 본 연구를 통해 일반발효유에 E. faecalis EF-2001 유산균 사균체가 첨가되어도 품질 기준 규격에 적 합하여 품질특성에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 또 한 실험군이 대조군보다 더 높은 항산화 활성을 갖는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구는 추후 사균이 첨가된 발효유 의 제조 및 연구에 대해 기초 연구 결과로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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(Received 19 May 2020, Revised 23 June 2020, Accepted 26 June 2020)
