Differentiation of Citrooacter freundii Complex by Using Biochemical Reactions of the Vitek GNI

임상병리검사과학회지 : 제 28권 제 1 호 1996.

Vitek

Citrooacter freundii

Complex의 균종감별

서울대학교병원 임상병리과 · 김천전문대학 임상병퍼파*

검성권 • 최혜심 · 검영권* . 검의종 · 석종성

Differentiation of Citrooacter freundii Complex by Using Biochemical Reactions of the Vitek GNI

Kim, Sung Gwon., Choi, Hye Sim., Kim, Young Gwon*., Kim, Eui Chong., Suk, Jong Sung

Dept. of Clinical Path여08)'， Seoul National University Hospital, Seoul Dept. of Clinical Path여ogy， K imchun Junior Collegé까， Kimchun

Members of the genus Citrobacter are Gram negative, oxidase negative bacilli that usually utilize citrate as a sole carbon source and are motility positive. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology lists three Citrobacter spp. namely, Citrobacter freundii, C- itrobacter amalonaticus and Citrobacter diversus. C. freundii was initially described by Werkin and Gillien in 1932. Brenner and Colleagues proposed C. freuηdii complex actually composed at least eight distinct DNA hybridization groups. Within the C.

freundii complex, four new species were named but three species left unnamed. Recent- ly Janda et al. reported the isolation incidence of all 8 of the new designated species by using classical biochemical methods in the clinical laboratory. We isolated 55 strains of C. freundii from clinical specimens by using Vitek GNI card and differentiated the new named four species by using on the basis of ornithin, raffinose, malonate, urease, su crose, esculin results among the biochemical reactions of the Vitek GNI.

1 . 서 론

Genus Citrobacter는 그람음성으로 산화효소 음성이고 citrate를 탄소원으로 이용하며 운동 성 을 가진 간균이 다 . Citrobacter species는 m-

dole생성， H2^{S의 형성，} malonate 이용능， D- arabitol과 adonitol로부터 산의 생 성 등을 기 초 로 하여 Citrobacter koseri나 Citrobacter freundii

complex 또는 Citrobacter amaloniticus group

등으로 구분하여 동정 하여 왔다1.2) Citrobacter

는 요로 감염， 창상 감염부터 패혈증이나 신생 아 수막염등에 이르기까지 많은 감염증과 연관 이 있다 3， 4， 5) 아직 확실하지는 않지만 신생아나 어린이의 위장염과도 관련이 있을 것이라는 견 해 도 있다 6， 7) • C. freundii는 1932년 Werkman

과 Gillen이 처음 발표하였고 8) Bergey’s Manu-

al of Systema tic Bacteriology 에 C. freundii, Cit- robacter diversus^, C. amaloniticus 등 3종을 수록 하고 있다 9) 그러 나 1974년 Crosa¹⁰⁾ 등은

c.

freundii로 동정된 균주 중에는 DNA-DNA hybridiza tion으로 다른 종의 Citrobacter가 있을 수 있음을 보여 주었고， 1993년에는 Brenner¹¹⁾ 등이 DNA - DNA hybridization의 DNA relat edness study에 서 C. amaloniticus( biogroup 1)

를 C. farmeri로， C. freundii complex를 8종의

DNA hybridization group 으로 구별하였다 (Ta­

ble 2). 새 로 명 명 된 4종의 specles는 Citrobacter youngae, Citrobacter braakii, Citrobacter ψerk­

manii와 C. sedlakii이 고 아직 명 명 되 지 않은 것 은 DNA hybridization group 9, 10, 11 등 3종이 다. 최 근 Janda 등은 C. freundii complex members를 기존의 생화학적 검사로 균종을 감 별하여 발표하였다 12) 아직 국내에서는 이 새 로운 균종에 대한 감별검사를 실시하고 있지 않고 있어 연자는 서울대학교병원 미생물검사 실 에 서 Vitek GNl( Gram negative identifica- tion) card(bioMerieux Vitek Inc., Hazelwood MO., USA) 를 이용하여 C. freundii로 동정된 55예의 생화학적 검사 성적을 Vitek IMS re port menu로 출력 한 후 ornithin 탈탄산효소 검 사， malonate 이 용능， raffinose와 sucrose 발 효 검 사， urease 검 사， esculin 가수분해 검 사 등의 결 과를 기 초로 하여 c. freundii complex members의 균종을 감별하였다.

T able 1. Biochemical identification of species within the C. freundii complex members in this study

Identification No.( % )of identified Janda et al.( %)*

C. freundii 70.9 37

C. youngae ^{14.6 24}

C. braakii ^{9.1 13}

C. sedlakii ^{3.6 1}

C. werkmanii ^{1.8 6}

*

II. 재료 및 방법

서울대학교병원 미생물검사실에 의뢰되었던 배양 검사에서 분리된 그람음성 장내세균 중 Vitek GNI card를 이 용하여 90% 이 상의 신 뢰 도로 동정 된 55예 의 C. freundii의 생 화학적 검 사 성 적 을 Vitek IMS report menu로 출력 하였

다. Vitek GNI의 31 가지 생화학적 검사 항목

중 C. freundii complex members를 감별하기 위하여 ornithin 탈탄산효소 검사， malonate 이 용능， raffinose와 sucrose 발효 검 사， urease 검 사， esculin 가수분해 검 사 등 6 종의 검 사종 목을 선택하였다. 이 6 가지 검사 성적을 기초 로 하여 C. freundii complex members의 균종 중 새로 명명된 5 종을 감별하였다. 감별 순서 는 우선 ornithin 탈탄산효소 검사성적을 양성 반응과 음성반응으로 구분하여 ornithin검사 음 성 군을 group 1 으로 ornithin검 사 양성 군을 group 2 로 구분하였다 (Table 3). 그 다음에 raffinose, malonate, urease, sucrose, esculin 검사의 순서로 양성반옹과 음성반용을 비교하 여 구별할 수 있는 flow chart를 만들어 감별 하였다.

ill. 결 과

동정된 총 55 예 중에서 C. freundii로 동정된

T able 2. Taxonomic change of Citrobacter freundii by DNA hybridization

Present New

C. freundii complex C. freundii C. youngae C. braakii C. werkmanii C. sedlakii Unnamed* 9 Unnamed* 10 Unnamed* 11

*

Table 3. Differentiation of C. freundii complex members group according to ornithin dihydration posi tive and negative results

Test Group 1 Group 2

C. freuπdii C. youηgae C. werkmanii C. braakii C. sedlakii

Ornithin + +

Raffinose +

Malonate + +

Urease V V V V +

Sucrose + ^V

Esculin V

Ornithin

+

Raffinose

+ - +

C. freundii

S. sedlakii C. braakii V ^{S E U} 廳짜 빼 ⁺ _V

Raffinose

+

샤마 e m

----떠

--- M

C. werkmanii C. youη:gae

V Urease V

V Sucrose Esculin

ldentification schema of C. freundlï complex members used in this study

것이 39 예 (70.9% )로 가장 많았고 C. youngae가 8예(14.6%) ， C. barrakii가 5예 (9.1 %), C. se-

dlakii가 2예 (3.6 % ), C. werkmanii가 1 예(1.8% ) 로 통정되었으며 동정되지 않는 것이 2예 (3.6

%)였다 (Table 1).

N. 고 안

Genus Citrobacter는 그람음성 간균으로 장내 세균과에 속하며 다른 장내세균속과는 acetylme- thylcarbinol(Vogos - Proskauer) 생 성 검 사 음성 , lysine탈탄산효소 검사 음성으로 구별된다. C.

freundii는 1932년 Werkman과 Gillen에 의 하

여 처음으로 지명되었으며 8) C. koseri와 C.

amalonaticus는 이 미 알려 져 있었 다 . Citrobacter

는 여러 가지 임상검체에서 종종 분리되는 균 종으로 요로감염， 창상감염에서부터 패혈증， 신 생아수막염 둥에 이르기까지 많은 감염증과 관 련이 있다 3， 4， 5) 아직 확실하지는 않지만 신생아 나 어린이의 위장염과도 관련이 있을 것이라는 견해도 있다 6， 7). Citr야acter속은 indole생성 시 험， 황화수소 생성능， malonate이용능 시험， po- tassium cyanide 존재하에서의 생존능 시험， D­

arabitol과 adonitol로부터 산의 생 성 등을 기 초 로 하여 C. freundii, C. koseri, C. amaloniticus 등 으로 구분하여 동정하였었다l，2)(Table 1). 그러

나 1974년 Crosa¹⁰) 등은 C. freundii로 동정된 균주 중에는 DNA - DNA hybridization으로 다 른 종의 Citrobacter가 있을 수 있음을 보여 주 었고， 1993년에는 Brenner¹¹) 등이 DNA-DNA

hybridization의 DNA relatedness study에 서 이 를 근거 로 Citrobacter균속의 균명 을 변 경 하여 야 한다고 제안하였다. 변경을 제안한 균종은

C. amaloniticus( biogroup 1) 를 C. farmeri로 할 것이였으나 변경을 제안한 가장 주요한 균종은

C. freundii complex이 며 , C. freundii complex

를 8종의 DNA hybridization group으로 구별 하였다 (Table 2). 새로 명명된 4 종의 specles는

C. youngaκ C. braakii, C. werkmanii과

c

sedlakii이 고 아직 명 명 되 지 않은 것 은 DNA hybridization group 9, 10, 11 등 3 종이다. 최근

Janda 등은 C. freundii complex members를 기존의 생화학적 검사로 균종을 감별하여 발표 하였다 12) Janda가 실험하여 보고한 생화학적 검 사종목은 indole, citrate, argmme dihydrase, ornithin decarboxylase, sucrose, dulcitol, raffi- nose, a-methyl- d - glucose, esculin, salicin, urea, motility, acetate, malonate 둥이 였 다.

Citrobacter의 동정은 다른 장내세균속과 마찬 가지로 증식이나 동정이 까다롭지 않으며

MacConkey 배지상에서 18 ，....， 20시간 후에 분홍 색의 균 집락을 관찰할 수 있으며 집락의 형태 만으로는 Escherichia coli와 감별 이 어 렵 다. 검 사실 내에서의 동정은 전통적인 생화학적 검사 법으로 할 수 있으나 근래에는 A TB rapid 32E (bioMerieux SA, Marcy - 1 ’Etoile, France ), Vitek GNI와 AutoSCAN - W / A(Baxter Diag- nostics, INC., Microscan Division, West Sacra- mento, Calif.) 등의 자동화 기기를 사용하여 훨씬 간편하게 동정할 수 있게 되었다. 본원 미생물 검사실에서는 1986년부터 장내세균 동 정 에 Vitek system을 이 용하고 있다. Vitek GNI card로 그람음성 간균을 동정하기 위하여 최소한 4 시간 배양 후에야 동정이 가능하였으 나 최근 개선된 컴퓨터 프로그램인 vers^lOn

DSAMSO-R08.1 에 의해서는 2시간 배양 후

에 도 동 정 이 가능하게 되 었 으며 , Citrobacter속 이 C. freundii, C. amaloniticus, C. diversus둥 3

종만 수록되어 있기 때문에 새로 명명된 균종 을 감별하기 위하여 다른 생화학적검사를 추가 로 실시하여야 한다. 그리고 세균 동정에 사용 하는 kit나 자동화기기에 수록되어 있는 균종 은 컴퓨터로 확률을 계산하여 만든 것이기 때 문에 data base에 수록되 어 있지 않은 균종이 나 새로 명명된 균은 동정할 수 없는 단점이 있다. Vitek GNI는 31 종의 생화학적 검사성적 으로 그람음성 간균을 동정하게 되어있는데，

이 31 종의 생화학적 검사 항목중 새로 명명된 C. freundii complex 균종 감별에 필요한

ornithin 탈탄산효소 검 사， malonate 이 용능，

raffinose와 sucrose 발효 검 사， urease 검 사，

esculin 가수분해 검 사 등 6 종의 결과를 기 초 로 하였다 (Table 3).

이 감별 에 사용한 55예 는 Vitek GNI card를 이용하여 90% 이상의 신뢰도로 C. freundii로 동정된 것이며 감별의 순서는 C. braakii, C.

sedlakii가 ornithin 탈탄산효소 검 사 양성 이 고

C. freundii, C. youngaκ C. werkmanii 둥은 음 성 인 점 에 착안하여 우선 ornithin 탈탄산효소 검사 성적에서 양성군과 음성군으로 구분한 후 시작하였다. 그 다음은 raffinose, malonate, urease, sucrose, esculin 검사의 순서로 양성 음성으로 구분하여 감별하였다. 총 55예 중 C

freundii가 39 예 (70.9% )로 가장 많았다. Bren- ner⁷⁾ 등은 검체별 분리율이 대변에서는 C.

youngae가 46.2% 로 가장 빈번히 분리되었고

C. freundii는 23.5% 가 분리되었다고 보고하였 으나， 호흡기 검체에서 66.7%, 비뇨기 검체에 서 80.0%, 창상검체에서 85.7% 가 분리되는 등 C. freundii가 가장 빈번하게 분리된 것으로 보고하여 대변 검체에서 분리된 것은 포함시키 지 않은 본 실험의 결과와 유사하였다. 그 다 음이 C. youngae가 8예 (14.6%), C. braakii가 5

예 (9.1 %), C. sedlakii 가 2 예 (3.6 %), C. ψer­

kmanii가 1 예 (1.8% )의 순서로 동정되었으며 분리빈도에서는 다소 차이가 있었으나 동정되

지 않는 것이 2예였다 (Table 1). 동정되지 않 은 2예는 본 실험에 사용한 검사 항목수가 6 종 밖에 되지않았고 새로 제안된 8종의 균종 중 아직 명명되지 않은 3종은 본 감별 대상에 서 제외되었기 때문이라 사료된다. 또한 본 실 험에서 사용한 검사성적은 자동화기기에서 얻 은 것이고 자동화 방법의 정확성은 평가에 사용 된 시험세균에 따라 현저히 달라지게 된다 13) 따 라서 본 연구에서 얻은 결과는 전통적인 방법 으로 실시한 생화학적 검사성적과 일치하지 않 을 수도 있으므로 본 실험에서 감별된 균종은 정확히 동정된 것이라고 할 수 없다. 따라서 보다 정확히 동정하기 위하여 Janda^l2) 등이 제 시한 전통적인 방법에 의한 생화학적 감별검사 가 필요하다고 사료된다.

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