t대한임상병 리사회지 : 제 17권 제 1 호 19E5
•=Abstract=
신조직의 면역형광항체 검사
한양대학병원 조직병리파
오 근 영
Immunofluorecence study of Kidney
Keun Y oung Oh,
Han)’ang Uχiνersity Hospital, Histopathology
Immunofluorescence is the mainstay among immunohistochemical techniques used in identifying the immunopathogenesis of renal disease. Enzyme-conjugated antibodies helpful in electron mic- roscopy have note yet found wide use in light microscopy. Immunological renal iniury may follw, first, if antibodies react with the renal basement membranes, either glomerular or tubular (GBM, TBl\1), and second, if antibodies combine with nonglomerular antigens in the circulation to form nephritogenic immune complexes that lodge in the glomerular filter or renal interstitium.
With immunofluorescence, one can then identify these antibody deposite which initiate renal injury. Since anti-GBM or anti-TBM, antibodies react all along the GBM or TBM, they appear as smooth linear deposits of immunoglobulin(Ig). Immune complexes depositing at random in the renal vasculature, predominant1y the glomeruli, produce a granular, irregular accumulation of Ig. Either type of antibody reaction in the kidney can lead to activation of mediators of immu- nological injury, such as complement, which can also be characterized by immunof1uorescence.
Satisfactory immunofluorescence study requires adequate tissue sections, optimal fluorescent- antibody reagents, adequate fluorescence microscopic equipment, and a good deal of experience in interpreting the findings. Portions of this part are directed toward each of these pointes, and a detailed description of tissue processing, fixation, and staining is inc1uded.
서 론
본 검사땅법은 형광항체블 이용하여 띤역복합물의 증명에 이용되는 방법이다.
현광항체란 어느 파장(자외선)을 바추면 그것보다 더 긴 파장을 빌광하는 형광색소를 항체단벡분자에 활 성을 손상시키지 않은 방볍에 의하여 화학적으로 굳게 결합시키는 원리이다.
닙}
C그 남4
t:::t
미 리 준비된 slide glass 위에 고착시 켜 놓은 검색재 료안 조직절펀에 형광색소 표지항체블 투입하여 반응 (염색)시킬 때， 만일 이 항체에 대응하는 항원물질이 존재하면， 그 부위에 매우 높은 특이성에 기인하는 항 원 항체 결합물이 형성된다.
다시 반응에 판여하지 않았던 상대가 없는 여분의
- 117-
항체릎 씻아버란 후 현광현미경오로 그관찰하면 특히 결 합물의 부위에서만 빛나는 형광을 포착할 수 있다. 이 와 같。l 형광색소릎 지표로 하여 항원항체결합물을 추 적 그관찰하는 방볍 01 형광항체법이다.
형광항체법의 염색방법은 직첩방볍， 간접방법 빛 이 중염색법 등이 있다.
O 직첩방법(그럼 1,3)
slide glass위에 항원이 들어 있는 조직 절펀을 올려 놓고， 그 항원에 대응하는 항체에 마리 형광색소를 결 합시 킨 형 광항체 (형 광색 소 포지 항체 , label항체 )를 투 입하면 항원항체 반응이 일어난다. 미반응의 label항체 플 행 주어 벼 라 면 항원 부위 만에 label항체 가 남는다.
이것을 형광현마경으로 판찰하면 항원 항체 결합부위 가 형광을 발사하묘로 항원부위의 존재를 확인하는 방 법이다.
label~} 처| 시 X} 캡 장원파‘
특이석얀 1( 1.응으로 형광 볼 딴하게 된다.
헝띤 label 행 체
L간섞밴 \lj] , ^ 1 차향쳐1 와 항원을
[τ1 ←옥 반응시 킨마.PBS 로
| ; 밸1 런 닙수세한 후 2 차항처l
넓ν넓권(label장쳐l)플 반응
「_J L_기 I I 시카면， 항원 -1 치-- • -' .... 下...땅처l 복힘-물에 label
샘 원 1 차행 체 label항체 행 체 가- 반응한냐
동결절펀용 모래제
(OTC Compund)
신조직 동결절펀용그-채처i
(그럼 1 )
〈그림 1)
〈그림 2)
alumifoiI capsul
acetone, 혹은
d ry- ice) nitrogh t Iiquid
O 간접방법 (그럼 1,4)
처음 항원에 대응하는 득이항체(1차항체)를 작용시 켜 항원 항체반응을 일으키게 한 다읍 label항체 (2차항 체)를 먼저의 항원 항체복합물에 반응-시키면 1차항체 와 2차항체가 결합한다. 그것에 의하여 항원 또는 1차 항체의 존재블 형광현미경으로 판찰 확인하는 방볍이 다.
신장 생검조직에 대한 형광항체법
a) 조직펀의 처 리 (그림 2)
채취펀 조직펀에 광학현미경용 및 천자현미경용 기 타의 펄요한 처리를 한 다음， 그 조직펀을 다음파 같 이 표매 하여 동결시 킨마. 우선 alumifoil(micro-tube
wJcap)로 시 험 판(1 x 1. 5cm) 만큼 굵은 capsule을 만든 다. 이곳에 동결절펀시 쓰이는 포배제 (O.C. T. Compo- und)블 5mm 청도의 높이로 주업하고， 출구가 넓은보 온병 에 dry ice와 aceton 냐 혹은 liquid nitrogen을 넣 어 동결시킨다. 그 위에 신장조직을 올려놓고 다시 포 매제블 넣어 조직펀을 sandwich 만들듯이 이중 충계로 하여 완전허 동결시킨다. 동결된 black은 진공 pack으 로 하여 -800C의 냉동기에 보존하면 약 1 년간은 충분 히 검사하는데 지장이 없다.
b) 조직의 박절
(동결철펀 71 )cryo-cut를 사용하여 앓은 조직 철판을 만든다. 이 작업 을 하기 위 해 서 는 alumifoil capsule을 제거한 원기둥 모양인 black을 고착대 위에 고착 설치 하고 앓게 자른(삭정)다. 삭정시 조직의 표면이 찰려 지거나 떨어져 손상이 없도록 조심하여야 한다. 철환 은 앓을수록 좋으며 4μ가 바함직하다. 만일 두꺼울 경 우 벼득이 형광 및 자기형광이 나타나고， 세포가 서로 경쳐저서 감벨하기 매우 어려우묘로 철환의 두께는 앓 은 것 이 좋다. 앓게 자른 철펀은 우형 광 slide glass에 2매씩 부착하고， air-dryer와 같은 기쿠로 찬바랍을 이 용하여 말란다. slide glass는 청결된 것을 사용한다.
c) 형 광색 소 표지 항체 (label항체 )
현재 신장생검조직의 형광염색에는 면역 globulin.
(lgG, IgM, IgA, IgE) 에 대 한 label항체 가 쓰이 고 있 는데， 이들은 우수한 질로 상품화되어 매우 펀리하게 쿠입하여 사용할 수 있다. 표지에 사용하는 주펀 형광 색 소는 green계 의 FITC(fluorescein isothiocyanate)와 orange계 의 RITC(tetramethy lrhodamine isothiocya- nate)가 사용되 고 있다. 시 판의 label항체 를 사용할 셰 는 설명서를 참고하고， 대개는 pH 7.2의 PBS용액으로- 10배 희 석 하여 사용액 을 만든다.
- 118-
위 물질융 찰 흔합하여 냉등싣에 보존한다.
g) 염색방뱀
염색땅법은 직접방법(그럼 3) 과 간첩방엽(그럼 4) 이 있으며 마음 그럼을 참고하기 바란다.
h) 판찰과 사진촬영
헝광항체법의 표관은 득이형광의 시간이 지넘어l 따 라 간소되어 표본을 영쿠히 보존할 수 없마. 만드시 사 진촬영하여 film으후 기록부관한마. 헝광현며경검사관 찰은 암살에서 하고， 다음 몇가지를 주의하여 야 한다.
@ 형광현미경이 옳바르게 장치되어 있나를 점검한 다.
@ 천원 스위치블 넣고 적어도 10분 장도 기다려 광 원 lamp의 빛 이 안정 된 후 판찰한다.
d) 대조 slide를 놓은 방법
현광항체방엽은 항원 항체만응을 응용한 것이묘로 반응이 득이한 것안가의 여부플 검토하기 위해 대조릎 놓는 것이 필수적이다.
e) 인산완충액 (PBS)
NaH2P04.2H20 ... 9.0g Na2HP04.121-120 ... 64.54g NaCl ... 160.00g
위 플칠을 채 증류수 20l에 녹-여 pH 7.2로 닷→추어 사 용한다. 보존은 40C에 서 한다.
pH 7.2 찬 PBS 로 섣쉰윤 씻어벤다.
f) 봉입제
glycerin ε ... 9용적
pH 7.2PBS( 안산완충액) ... 1 용적
~I (1)
멘 \'-1 (2) (3) (4) (5)
싫~d →심→념→패→
무형광 slide [주 J: 성 자에 넣고 10분까 10분간 10분간
glass 에 부착한 반 g 시쉰다. 40C 조직 전펴위에 에 서 상사뚜갱플
label 굉체릎一 년어 주어진시간 I덮어뜨런다. 염색힘.
주의 : label항체의 건조를 막기 위하여 반응시 상자 밑에 여파지나 솜으로 앓게 칼고 물로 적신다.
상자에 넣어 반응시에는 뚜껑을 덮어둔마.
〈그림 3) 직첩 방볍 형굉학lllì 정으로 캠갱추 사진환영
웹까1L7
(2)폐 커 껴
줬Ä~撥/→끼→꾀→꾀→
짧s;얘펴한 반-F→:1 켜I_냐 X띤 τ :t 10--;'1'-;::1- 1O~;;:l-
f피찮겹렇펴어 캡쇠 좋:1판장꾀
R 서3」7 뜨국lt
(7n엮팩
l컨 띈
화낄 /갖쩔/→ 1 1 I→州→1" 1
I•반응시키ljR누캉
? [
P성 7. 2 펀PBS로 철펀윤단셔 추어낀 시간
1
u /
(
형광현미경에서 캠경후
λ l- Al 초1- o~ -s1- 1 ι T:' 0 11.
으 ηL 펀 커E 로 R
ι
-l,‘
차 마
9
]
-
、니U11
L [j Il
。，야‘ 씻
\ j
( U
label 항체 2 차
항체) 윤 철 i년유1 에 떤어뜨깐다.
주의 : 직캡망볍 주의에 준하여 시행한다.
〈그림 4) 간첩방볍
- 119-
@ 일단 스위치릎 끈 다음 다시 관찰이 펄요할 빼는 30분쯤 lamp을 식한 후 다시 스위치를 넣는다.
@ 형광은 자외선의 조사시간(照射時間)에 ll] 례하여 퇴색되묘로 관찰에는 필요 이상의 시간을 보내지 않도 록 조심하고， 형광현미경 검사로 중단할 때는 반드시 광원을차광한마.
@ 염색결과의 기록은 사진촬영에 의하여 한마. 촬 영은 염색후 가능한 빠르게 촬영한다.
@ 촬영한 film의 현상결과가 나올 해까지 표본은 40C에서 차팡하여 일단 보존해둔다. 염색이 잘된 표본 응 1f'J2주간의 보존이 가능하다.
i) 촬영된 좋은 사진의 조건은 다음 몇가지릎 말할 수 있다.
@ 원하는 항원의 존재부위만이 선명하게 형광을 ll]
치며， ll] 득이형광이 없는 것.
@ 특이형광부위와 기타 부분의 경계가 선명하여 대 조(contrast)가 좋은 것 •
@ 자기 형광이 적은 것.
@ 광원 흐립이 적은 것 등이다.
요약된 면역 형광항체 검사 방법
..
(준벼)
1) 보온병에 liquid nitrogen-를 넣고， 뚜껑이 있는 병 에 2-methyl butan(i sopentane(CsH12))를 넣 어 실온 에서 준비한다.
2) 검 체 채 취 후 즉시 양분하여 한쪽은 alcoholic
Bouin용액 (LM 검사용)에 고정하고， 다른 한쪽은 2- methyl butan명 에 넣 어 뚜껑 을 양은 후 잘을 매 달아
liquid nitrogen을 넣 은 보온병 에 넣 어 검 사살로 옮긴 다.
3) 검 사살에 도착된 보온병 에 서 살을 장아당겨 2- methyl butan뱅 을 f꺼 내 어 동결절펀할 해 까지 -700C
에 보관한다.
(시약)
4) 염 색 시 약(상품화된 항체 ) IgM, IgG, IgA, C3,
,C4, C1q, Albumin, fibrinogen 각각의 ample에 증류수 1ml씩 분주기로 가하여 서서히 흔합함. 이때 총량은 각각 1 ， 000À가 펀다.
5) 각 종류마다 microtube 107B 씩 준비 하여 labeling
하고 100À썩 micro-pipet로 분주한 후 뚜껑 을 닫고，
-700C에 서 냉 동 보관한다.
(칠펀)
6) 철펀 조직은 :4μ로(가능한한 앓게) 동결절펀기로 절펀하여 염색할 slide를 종류별로 각각 3매썩 (3X8=
24매 ) 만들어 slide진열판 위 에 정 돈하여 놓고 약 30분 간 실온건조시킨다.
(염색)
7) PBS용액을 4개외 dish에 분주하여 각각 2분씩 8
분간 작용시킨다.
8) Acetone릎 2개 의 stain dish에 담고， 처 음에 10 분， 마지막에 20분간 작용한 후 다시 천단계의 PBS용 액에 동일방법으로 한 후 염색한다. 만일 염색의 시작 이 지 연될 경 우 slide rack에 slide를 꺼 운체 로 물을 적 신 gaze 위에 올려 놓아 40C의 냉장고에 잠시 염색。l 준비될 째까지 보판한다.
9) 염 색 시 약(순서 5)에 서 분주동결시 컨)을 냉 동실에 서 각각 종류별로 1개 씩 꺼 내 어 녹힌 후 PBS용액 700À
(1 : 7) 썩 각각 넣고， 흔합하여 침전시킨다.
10) 염색대 위에 slide를 구분하여 올려놓고 희석한 시약을 적당량블 slide 위에 분주하여 30분간 염색한 다. 이해에 염색대 밑에 gaze 나 탈지면을 깔고 증류수 로 적시어 염색도중 건조끌 방지한다.
11) 신선한 PBS용액 을 4개 의 dish에 분주하고 2분 씩 8분간 통과시킨다.
12) 봉입제로 봉입하여 검경은 즉시하나 늦어질 경
우 slide 진열판에 넣어 종이로 덮고 40C의 냉장고에
보관(약 7 일간)할 수 있다.
참 고 문 헌
1) Andres, G.A., and R. T. McCluskey. 1975. Tubu- lar and interstitial renal disease due to immuno- logic mechanisms. Kidney lnt. 7: 271f ' J289.
2) Clark, H.F., and C.C. Shepard. 1963. A dialysis technique for preparing fluorescent antibody.
Virology 20 : 642f ' J644.
3) Dujovne, 1., V.E. Pollak, C.L. Pirani, and M.G.
Dil1ard. 1972. The distribution and character of glomerular deposits in systemic lupus erythema- tosus. Kidney lnt. 2: 33f ' J50.
4) McCluskey, R. T. 1971. The value of immunoflu- orescence in the study of human renal disease. J.
Exp. Med. 134: 242sf ' J255s.
5) Wilson, C.B. 1975. lmmunofluorescence in diffe- rentiating the immunopathogenesis of renal dise- ase. Ariz. Med. 32: 283f ' J289.
6) Wood, B. T., S.H. Thompson, and G. Goldstein.
1965. Fluorescent antibody staining. IIl. Prepara- tion of fluorescein-isothiocyanate-labeled antibo- dies. J. Immuno1. 95: 225f ' J229.
- 120-
