緖1) 論
한의학에서는 질병의 발생과 발변과정 및 전 귀는 「素問」〈評熱病論〉에 말한 “邪氣交爭”
과 같이 본질적으로 邪正相爭의 과정으로 파악 한다. 邪氣는 六淫 外에 七情, 飮食, 勞倦, 瘀血, 痰飮 등의 인체 내외의 발병요인을 포괄하여 지칭하고, 正氣는 인체가 邪氣의 침범에 저항
•교신저자 : 전병훈,원광대학교 한의과대학 병리학교실, Tel. 063-850-6843, Fax. 063-850-6840, E-mail : [email protected]
｢본 연구는 1997년 교육부 기초의학 연구지원과 원광대학교 의약자 원연구소(MRRC)의 지원에 의하여 수행되었음.｣
하고 생활환경에 적응하여 정상적인 생리활동 을 유지하는 능력의 총칭이다. 邪氣와 正氣의 상대적 강약 및 진퇴상황이 곧 邪氣消長의 과 정으로 파악하는 것이다1,2).
인간과 포유동물의 피부 및 모발의 색조는 여러 요인에 의해 결정되지만 그 중에서도 멜 라닌 세포에서 합성되는 멜라닌 색소가 가장 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 멜라닌 세 포에서 합성되는 멜라닌 색소는 기본적으로 갈 색 및 검은색인 eumelanin과 황색 또는 홍갈 색인 pheomelanin의 2가지 종류가 있으며, 이 들 색소는 멜라노좀 내에서 tyrosine을 DOPA 와 dopaquinone으로 전환시키는 tyrosinase의
멜라닌 합성 및 기전에 미치는 甘草의 효과
박지선1․박래길1․김정중2․이황희3․임종국4․정승일5․나경상6․한종현6․전병훈6
원광대학교 의과대학 미생물학교실1, 원광대학교 의과대학 해부학교실2, 전남대학교 자연과학대학 생물학과3, 동국대학교 한의과대학4, 원광대학교 자연대학 화학과5, 원광대학교 한의과대학6
Effect of Radix Glycyrrhizae on the Melanogenesis of Melanoma Cell Line
Ji-Sun Park1․Rae-Kil Park1․Jeong-Jung Kim2․Whang-Hee Lee3․Jong-Kook Lim4․ Seung-IL Jeong5․Kyung-Sang Na6․Jong-Hyun Han6․Byung-Hun Jeon6
Dept. of Microbiology, College of Medicine, Won-Kwang University1, Dept. of Anatomy, College of Medicine, Won-Kwang University2, Dept. of Biology, College of Natural Science, Chon-Nam University3,
College of Oriental Medicine, Dong-Guk University4,
Dept. of Chemistry, College of Natural Science, Won-Kwang University5, College of Oriental Medicine, Won-Kwang University6
Abstract
To investigate whether glycyrrhizae inhibits melanogenesis, we utilized B16 melanoma cells.
Glycyrrhizae alone decreased the tyrosinase promoter activity of B16 melanoma cells in dose-dependent manner. Glycyrrhizae attenuated tyrosinase promoter activity and tyrosinase activity. Glycyrrhizae also prevents phosphotransferase activity of c-Jun N-termianl kinase(JNK1) and transcriptional activation of AP-1 in α-MSH-treated B16 melanoma cells. In conclusion, the current studies for the first time demonstrated that an inhibitory effect of melanogenesis by glycyrrhizae on B16 mouse melanoma cell might be a new mechanism which down-regulates JNK activity via inhibition of AP-1 activity.
Key Words : Glycyrrhizae, Melanogenesis, α-MSH, JNK1, AP-1 J . K or. A M – M erid ia n & P oin tolog y S oc.
작용에 의해 형성된다. Eumelanine은 dopaq- uinone의 산화 환원에 의해 생긴 5,6-dihydro- xyl indole의 단일중합체 (homopolymer)이며 pheomelanin은 dopaquinone이 cysteinyldopa 에서 파생되는데, 멜라닌 세포내의 멜라노좀의 발달 정도와 이러한 멜라닌 색소의 합성능의 차이로 인종에 따른 피부색의 차이가 결정되는 것으로 알려져 있다3-7).
인체 표피 멜라닌 세포의 기능적, 형태학적, 수적 변화로 말미암아 저색소성 혹은 과색소성 병변이 야기되므로 멜라닌 색소 합성의 조절 기전을 규명하고 인위적으로 이를 조절하고자 하는 많은 노력이 있어 왔으며 이에 관한 연구 가 관심의 대상이 되고 있다. 멜라닌 색소의 합 성을 조절하는 정확한 기전은 많은 연구에도 불구하고 아직 확실치 않은데, 유전적 요인 이 외에 호르몬과 같은 여러 물리적, 화학적, 생리 적 요인이 멜라닌 합성을 조절한다고 알려져 있다8). 멜라닌 합성에 대한 기전은 α-MSH에 의한 멜라닌화의 신호전달기전이 밝혀지기 시 작하면서 멜라닌 세포의 멜라닌화에 대한 mitogen activated protein(MAP) kinase의 重 要性이 점차 부각되고 있는 실정이며, 또한 멜 라닌 합성에 관한 많은 분자생물학적인 지식이 축적되어지면서, 멜라닌 합성의 기전이 activa- tor protein-1(AP-1)과 같은 조기 반응 유전자 (early immediate gene)와 많은 聯關이 있음이 알려졌다. 그러므로 이러한 인자들의 활성화 여부는 멜라닌 합성의 연구에 중요한 단서가 될 수 있을 것이다9-14).
고래로 甘草는 동서양에서 광범위하게 사용 되어 오던 생약으로서 「本草綱目」에는 百藥 의 毒을 解하고 諸藥을 능히 協和한다고 하며 급박증상에 대한 緩解鎭痙작용이 기재되어 있 으며 해독, 진정, 진경, 거담제로서 사용되어 왔고 특히 질경과 병용시에는 거담작용이 강화 된다고 한다. 또한, 甘草의 해독작용은 glucu- ronic acid의 결합해독작용, glycyrrhetic acid 의 부신피질호르몬양의 작용, glycyrrhizin의 흡수작용을 포괄한다. 더욱이 甘草를 마시거나 피부에 직접 바르는 것으로 피부노화를 효과적
으로 지연시킬 수 있다고 하였다. 뿐만 아니라 甘草 성분 중에는 살균작용, 수렴작용을 하는 성분도 들어 있어 피부 염증을 효과적으로 가 라앉히고, 트러블을 방지한다고 하였다15-19. 따 라서 본 연구에서는 甘草 추출물의 처리농도를 결정하기 위하여 세포의 형태학적 변화를 관찰 하고 MTT assay를 실시하였으며, 멜라닌 합성 에 대한 경향을 판단할 수 있는 최종산물인 melanin의 정량측정과 멜라닌 합성과정에서 중요한 효소인 tyrosinase 활성도를 측정하였 다. 아울러 멜라닌 합성의 기전 중 MAP kinase의 서브패밀리인 c-Jun-N-terminal kin- ase(JNK-1)의 활성 및 전사활성인자인 AP-1 활성의 측정을 통해 甘草의 추출물이 색소 형 성 억제 효과가 있음을 확인하였고 그 기전의 일부를 파악하였기에 보고하는 바이다.
實驗材料 및 方法
1. 재료
본 실험에서 사용한 약재는 시중에서 구입, 정선하여 사용하였다. 한약재인 甘草 100 g에 3차 증류수 1ℓ를 가하여 3시간 동안 전탕 한 후 여과지를 사용하여 여과하였다. 그 후 3200 rpm으로 30분간 원심분리 후 micropore 여과 지를 사용하여 여과하고, -70℃에서 동결시킨 후 Freeze Dryer로 동결건조 시킨 것을 28.8 g 을 얻어 시료로 사용하였다.
2. 방법
B16 melanoma 세포주(ATCC)의 배양은 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 10% fetal bovine serum(Hyclones)이 포함된 RPMI- 1640(Gibco BRL Co, Ga.ithersburg, MD) 배 지를 이용하였으며, 약 24시간 주기로 RPMI- 1640 배양액을 교체하여 주며 실험을 수행하 였다. 실험군에 있어서 甘草의 처리 농도를 결 정하기 위한 MTT<3- (4,5-dimetylthia-zol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide> assay
를 이용하였다. 간기하면 세포 배양관(96 well plate)에 B16 melanoma 세포를 100㎕(5×
104cell/well)씩 분주한 후 여러 가지 농도의 甘草를 농도별로 희석하여 처리하였다. 분주된 96 well plate를 37oC, 5% CO2배양기에서 24 시간 반응시킨 후 각 well에 5㎎/ml MTT (Sigma Co, St. Louis, MO)를 10㎕씩 넣고 4 시간 동안 반응시켰다. 살아있는 세포는 MTT 에 의해 세포에 보라색 불용성 formazan 침착 물이 형성되며 이를 용해시키기 위하여 10%
sodium dodecyl sulfate(SDS) in 0.01N HCl 100㎕를 넣고 37℃, 5% CO2배양기에서 24시 간 반응시킨 후 540㎚ 파장에서 ELISA rea- der를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
Tyrosinase promoter activity 측정방법은 다음과 같다. B16 melanoma 세포를 24 well plate에서 24시간 배양하였으며 tyrosinase promotor repoter plasmid와 control vector인 pRL-CMV와 lipofectamine을 섞어서 실온에서 약 40분 정도 반응시킨 후 serum free media 를 첨가하여 B16 melanoma 세포에 넣어주었 다. 5시간 경과후 serum이 포함된 media로 바 꾸어 주고 18-24시간 후에 mediafmf 다시 바 꾸어 준 후 각 well에 甘草를 처리한 후 12시 간 배양하고 PBS로 2회 씻어 주었다. repoter lysis buffer로 처리한 후 luciferase assay 시 약을 상층액과 섞어준 후 luminometer를 이용 하여 측정하였다. Tyrosinase 활성도 측정의 생화학적 방법은 다음과 같이 실시하였다. Ty- rosinase activity는 Martinez-Esparza M.20) 등의 방법에 의하여 측정하였다. 멜라닌 세포 를 원심분리로 수확하여 세포침전물을 만들고, 100㎕ 세포용해액(lysis buffer: 1% Triton X-100, 10mM sodium phophate, pH 7.0, 0.1mM PMSF)를 넣고 4℃ 얼음에서 30분간 방치하여 세포를 파괴시킨 후 원심분리하여 상 층액만을 tyrosinase의 활성측정용액으로 사용 하였다. 이 활성측정용액은 100mM sodium phosphate(pH 7.0) 100㎕에 시료 50㎕를 넣어 30℃ 물중탕기에서 5분간 보온한 후 100mM catechol 50㎕를 넣어서 온도조절장치가 되어
있는 분광광도계로 37℃, 405㎚에서 흡광도의 변화를 1 시간 관찰하였다. Melanin 정량은 Hosoi 등의 방법21)을 변형하여 사용하였다. 배 양세포는 phosphate buffered saline(PBS)으 로 2회 세척, 원심분리하여 수확하였다. 세포 침전물을 1㎖의 증류수에 현탁 후 초음파로 분 쇄한 후, 원심 분리하여 침전물을 수확하였다.
Acid-insoluble material을 얻기 위해 2배의 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)가 첨가된 1N NaOH를 300㎕ 첨가하여 80℃에서 1시간 동 안 처리하여 용해시켰다. 405㎚에서의 흡광도 를 측정하였다.
In vitro immunocomplex kinase assay는 배양된 B16 melanoma 세포(5×106cells/well) 에 다양한 시간동안 100㎍/ml 농도의 甘草를 처리한 후에 포집하여 cold PBS로 2회 세척한 후 실시하였다. 이를 600㎕의 extraction buff- er를 가하여 30분간 얼음상에서 용해시킨 후, 12,000rpm, 4oC 에서 30분 원심분리하여 상층 액만을 다른 튜브에 모았다. 여기에 anti-JNK 항체(Anti-JNK1(C17), Santa Cruz Biotech- nology Inc, CA)를 1㎍ 넣고 3시간 반응시켰 다. 여기에 미리 extraction buffer로 세척한 10%(v/v)의 Pansorbin (Calbiochem, CA) 용액 100㎕씩을 넣고 1시간 얼음에서 반응시킨 후 4,000rpm에서 5분 원심분리하여 상층액은 버 리고 침전물을 다시 동일 EB buffer로 1회, PAN buffer(10mM Pipes, pH 7.4, 0.1M NaCl, 0.1% aprotinin)로 2회 더 세척하여, 상 층액은 버리고 면역침전체만을 얻었다. kinase assay는 여기에 1㎍ GST-cJUN 단백질과 2μ Ci의 γ-32P ATP를 최종 20㎕의 kinase reaction buffer (Tris-HCl pH 7.5, 20mM, MgCl2, 20mM, DTT 2mM, cold ATP 20mM) 에 혼합, 진탕에 의하여 재현탁 시킨 후 30oC 에서 20분 반응을 진행시켰다. 여기에 20㎕의 SDS-PAGE sample buffer를 넣고 98oC에서 5 분 끓인 후 12.5%의 SDS-PAGE 법으로 단백 질을 분리하였다. 전기영동 후 건조된 gel을 autoradiography에 의해 kinase활성을 측정하 였다. JNK의 기질인 GST-c-Jun 단백질은 full
sequence c-Jun cDNA의 아미노산 서열 1-79 까지 만을 pGEX 2T vector에 삽입 후에 E.
coli BL-21(DE3)에서 발현시켰다. E. coli에서 발현된 GST-cJUN 단백질은 glutathione-con- jugated Sepharose beads(Pharmacia Co, Sweden)을 이용하여 순수 분리, 정량 후 사용 하였다.
유전인자의 활성측정을 위하여 Electropho- retic mobility shift assay(EMSA)를 실시하였 다. 유전자 전사인자들의 활성은 B16 mela- noma 세포주에서 핵추출물을 Jeong 등의 방 법22)으로 모았 실시하였다. 세포침사물에 80㎕
buffer A(200μM PMSF, 10㎍/㎕ aprotinin, 20μM pepstatin A, 100μM leupeptin, 및 100μM antipain)를 넣은 후 4oC, 10분간 세 포를 팽창시킨 후 Nonidet P-40를 0.1%되게 4oC, 5분간 반응시켜 세포질을 파괴시킨 다음 3,000rpm, 4oC, 5분간 원심분리하여 상층액인 세포질액을 제거하고 buffer A와 high salt를 동량 혼합한 용액 20㎕를 넣고 4oC, 10분간 얼 음에서 반응시킨 다음 13,000rpm, 4oC, 5분간 원심분리하여 핵 추출 단백질만 모았다. AP-1 의 활성 측정은 consensus binding site를 가 진 oligonucleotide probe인 AP-1/S:5'-AAGG CGCTTGATGACTCAGCC GGAA-3'; AP-1/
AS:AAGGTTCCGGCTGAG TCATCAAGCG -3'를 합성하여 10mM Tris-HCl 용액(pH 8.0, 50mM NaCl, 10mM MgCl2 및 1mM DTT)에 희석한 후 85℃에서 5분 denaturation한 후 상 온까지 온도를 낮추면서 annealing한 후 100ng을 rediprime kit(Amersham, England) 을 이용하여 32P을 부착시켰다. 준비된 5㎍ 핵 추출 단백질에 32P 부착된 AP-1 probe를 실온 에서 30분간 반응시킨 후 4oC에서 4% SDS- PAGE에 각각 전기영동 하였다. 이 gel은 건조 후 autoradiography 방법으로 X-ray 필름에 현상하여 AP-1 활성을 측정하였다.
표시된 실험결과는 3번 이상의 독립적인 실 험결과이며 이들의 평균과 표준편자(standard deviation, S.D.)를 산출하여 표시하였으며, 또 한 각 실험군을 대조군에 대한 백분율(%)로 나
타내었다. 통계학적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하였다.
實驗成績
1. 甘草 抽出物이 멜라닌세포의 細胞生存 率에 미치는 影響
甘草 抽出物이 멜라닌 세포의 생존율에 미치 는 영향을 알아보기 위하여 甘草 抽出物의 細 胞毒性과 형태학적 변화에 대하여 조사하였다.
멜라닌 세포에 10 μg/ml에서 1000 μg/ml까 지의 다양한 농도의 甘草 抽出物를 첨가한 후 24시간 동안 관찰한 후 세포생존율을 조사해본 결과 細胞毒性을 나타내지 않았다 (Fig. 1). 가 장 고농도인 甘草 抽出物 1 mg/ml에서도 細 胞毒性이 나타나지 않았으며 형태학적인 변화 도 관찰할 수 없었다. 따라서 甘草 抽出物의 처 리농도를 50 μg/ml로 채택하여 본 논문의 실 험을 진행하였다.
Fig. 1 Effect of the extract of glycyrrhizae on the viability of B16 melanoma cells. Cells were treated for various concentration of the extract of glycyrrhizae (5-1000 μ g/ml). The viability of cells was measured by MTT assay.
0 20 40 60 80 100 120
Viability (%)
Dose (µg/ml)
0 10 50 100 500 1000
0 20 40 60 80 100 120
Viability (%)
Dose (µg/ml)
0 10 50 100 500 1000
0 20 40 60 80 100 120
Viability (%)
Dose (µg/ml)
0 10 50 100 500 1000
2. 甘草 抽出物이 tyrosinase promoter activity에 미치는 影響
甘草 抽出物이 tyrosinase 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 tyrosinase의 발현 조절 부위와 luciferase 유 전자를 포함하는 재조합 vector를 제조하여 멜 라닌 세포에 transient하게 transfection시켜서 luciferase assay를 시행하여 tyrosinase 유전 자의 발현 양상을 관찰한 결과 甘草 抽出物은 Tyrosinase promoter activity를 농도 의존적 으로 감소시켰다 (Fig. 2).
3. 甘草 抽出物이 tyrosinase activity에 미치 는 影響
甘草 抽出物이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 멜라닌 합성시 가장 중요한 효소로 작용하는 tyrosinase의 활성도를 측정
하였다. 멜라닌 합성을 촉진시키는 α-MSH를 단독으로 처리한 군에서는 대조군에 비하여 약 2.5배의 tyrosinase 활성이 증가하였으며, 甘草 抽出物만을 단독으로 처리한 경우에는 대조군 에 비하여 약 0.5배의 tyrosinase 활성이 관찰 되었다. 또한, 甘草 抽出物을 30분 前 처리한 후에 동량의 α-MSH를 처리한 그룹에서는 tyrosinase 활성은 α-MSH만을 단독으로 첨가 한 군에 비하여 유의한 감소를 보였다 (Fig. 3).
4. 甘草 抽出物이 멜라닌 量에 미치는 影響
甘草 抽出物의 멜라닌 합성 억제 효과를 tyrosinase promoter activity와 tyrosinase 활 성도의 감소를 통해 확인한 우리는 멜라닌 합 성 억제 효과를 직접적으로 확인하기 위하여 멜라닌 합성의 최종 산물인 멜라닌 양을 직접 적으로 측정하였다. 甘草 抽出物을 30분 前 처 리한 후 α-MSH를 72시간 동안 배양한 다음 멜라닌 세포의 전체 멜라닌 양을 측정한 결과 Fig. 2 Dose-dependent effects of the glycyrrhiziae
for tyrosinase promoter activity in B16 mouse melanoma cells. Cells were transfected with 2μg of pGL2. Then, transfected cells were cultured for 12 hr with various concentration of glycyrrhiziae and tyrosinase promoter activity was measured described in the Materials and Methods. * P<0.05, ** P<0.01 by student's t-test, compared to the corresponding control.
Tyrosinase Promoter activity (RLU)
Dose (µg/ml)
0 1 10 50 100
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
*
* **
**
Tyrosinase Promoter activity (RLU)
Dose (µg/ml)
0 1 10 50 100
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Tyrosinase Promoter activity (RLU)
Dose (µg/ml)
0 1 10 50 100
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
*
* **
**
Fig. 3 Extract of glycyrrhizae suppresses α -MSH-induced tyrosinase activity in B16 melanoma cells. Cells were treated without or with the extract of glycyrrhizae (50 μg/ml) for 30 min. and then α-MSH (10 nM) for 24 hr. Results represented as mean ±S.D. of three different experiments.
Tyrosinase Activity (%)
0 50 100 150 200 250 300
G.C.
MSH -
- - + +
+ - +
Tyrosinase Activity (%)
0 50 100 150 200 250 300
G.C.
MSH -
- - + +
+ - +
α-MSH 단독처리시 멜라닌 세포에서 멜라닌 합성량은 대조군에 비하여 약 2.4배 증가를 나 타내었다. 그러나, 甘草 抽出物을 전 처리한 그 룹에서는 대조군에 비하여 멜라닌 합성량이 약 1.6배로, α-MSH에 의하여 증가된 멜라닌 양 보다 약 65%정도 억제됨을 관찰하였다(Fig.
4).
5. 甘草 抽出物이 JNK1 활성화에 미치는 影響
Mitogen-activated protein kinase (MAP kinase)는 細胞의 成長과 分化에 관련함이 많 이 硏究되어 있으며, MAP kinase의 서브패밀 리인 c-Jun N-terminal kinase 1(JNK1)은 멜 라닌 합성시 활성화되어짐을 관찰한 우리는 멜 라닌 합성의 억제효과를 확인한 甘草 抽出物이 α-MSH에 의한 JNK1의 활성화에 어떠한 影 響을 미치는지를 調査하기 위하여 甘草 抽出物 (50 μg/ml)을 30분 前 處理한 후 α-MSH(10 nM)를 6 時間 處理 한 후 細布를 JNK1 抗體
를 利用하여 침전시킨 후 그 기질인 c-JUN N-terminal (c-JUN N-terminal, 1-79 아미노 산) 蛋白質과 反應시켜서 기질의 phosphotra- nsferasa 活性을 測定하였다. α-MSH를 單獨 處理한 群에서는 對照群에 比해서 2.5倍 活性 이 增加하였지만 甘草 抽出物을 前 處理 한 후 α-MSH를 處理한 群에서는 단지 1.15倍 活性 이 增加하였다(Fig. 5). 이는 甘草 抽出物이 α -MSH에 의한 멜라닌 합성시 중요한 JNK1의 활성을 억제함을 시사한다.
6. 甘草 抽出物이 전사활성인자(transcriptio- nal activator) AP-1 활성화에 미치는 影響
위의 결과에서 甘草 抽出物에 의한 JNK1의 活性 抑制한다는 사실은 JNK1의 기질인 c- Jun의 homodimer나 c-Jun과 c-Fos의 hetero- dimer로 이루어진 전사활성인자인 AP-1의 活 性與否를 調査하였다. 멜라닌 細胞에서 α- MSH(10 nM)만을 處理 했을 때와 甘草 抽出物 을 30분 前 處理한 후 α-MSH(10 nM)를 1時 間 處理후 각각의 核抽出物에서 AP-1의 活性 與否를 electroporetic mobility shift assay Fig. 4 Extract of glycyrrhizae decreased α
-MSH-induced melanin contents in B16 melanoma cells. Cells pre-incubated with or without extract of glycyrrhizae (50 μ g/ml) and followed by addition of α-MSH (10 nM) for 72 hr. Values are mean ± S.D. of three separate experiments.
Melanin Contents (%)
0 50 100 150 200 250 300
G.C.
MSH -
- - + +
+ - +
Melanin Contents (%)
0 50 100 150 200 250 300
G.C.
MSH -
- - + +
+ - +
G.C.
MSH -
- - + +
+ - +
Fig. 5 Extract of glycyrrhizae suppressed α -MSH-induced phosphotransferase activity of JNK1 in B16 melanoma cells. Cells pre-incubated with or without extract of glycyrrhizae (50 μg/ml) and followed by addition of α-MSH (10 nM). Lysates were immunoprecipitated with anti-JNK antibodies and treated with GST-c-Jun-NT as substrate and [γ-32P]ATP at 20℃ for 30 min. The phosphotrasferase activity was visualized by autoradiography.
GST-c-Jun
(EMSA) 方法을 통하여 調査하였다. α-MSH 를 處理한 群에서는 AP-1의 活性이 현저하게 增加하였다. 그러나 甘草 抽出物을 前 處理한 후 α-MSH를 處理한 群에서는 AP-1의 活性 이 α-MSH만 단독 處理한 群보다 현저한 減少 現狀을 나타내었다 (Fig. 6).
考 察
甘草(Radix Glycyrrhizae)는 豆科(Lrgumi- nasar)에 屬하는 多年生 草本 및 同屬近錄植物 의 根과 根狀경으로23,24), 異名17,23,24)은 美草, 靈 草, 國老 等으로 불리워지고 있다15,17). 性味와 校能은 甘, 平, 無毒해서 補裨益氣, 淸熱解毒, 調和祭樂하는 작용이 있다. 甘草의 主成分은 glycyrrhizic acid의 calcium鹽과 kalium鹽으 로된 glycyrrhizin인데 glycyrrhizic acid를 가 수분해하면 glucuronic acid와 glycyrrhetic acid를 생성한다25-27). 더욱이, 최근에는 甘草가 미백에 효과가 있다는 민간요법이 있지만 이에
대한 정확한 연구는 이루어지지 않고 있다. 피 부는 자외선 및 물리, 화학적 열에 대한 보호작 용이 있으며 피부의 불투과성으로 인한 특징은 과도한 탈수의 방지, 미생물 등의 병원균 침입 을 방지하는 역할을 한다. 또한, 피부 상피층에 분포되어 있는 멜라닌색소는 태양광선중의 자 외선을 흡수하는 기능을 갖고 있다. 또한 인위 적으로 노출되는 광선을 흡수하거나 분산시켜 피부를 보호하는 기능을 하게 된다28). 사람의 피부색 결정의 주요 인자인 멜라닌은 유전적 요인으로 결정되지만 자외선과 같은 물리적 요 인, α-MSH(α-melanocyte stimulating hor- mone), adrenocorticotropic hormone, estro- gen, lipotropin, prostagrandin, thyroxine, androgen 같은 호르몬, arachidonic acid와 그 대사산물 같은 생리적 요인, 그외 cholera toxin 등이 표피-멜라닌 단위의 상호작용에 관 여한다. 특히, 멜라닌 색소의 증가는 α-MSH 호르몬 처리 후 48시간 경과 후 나타나며 멜라 닌세포의 증식, 수상돌기의 발달과 tyrosinase 활성도의 증가에 의한다. 또한, 멜라닌 色素沈 着은 말피기細胞(malpighian cell)들에 둘러싸 인 멜라닌 細胞로서 정의되는 epidermal me- lanin unit에서 이루어지며, 이때 生成된 멜라 닌소체의 數와 말피기세포로 移動되는 속도는 호르몬에 의해 일부 조정이 되지만 주로 遺傳 的 因子에 의해서 조정된다. 生體內 멜라닌 合 成에 있어서 가장 특징적인 물질인 α-MSH에 의해서 멜라닌 합성의 신호전달기전이 밝혀지 기 시작하였으며 최근에는 MAP kinase (mito- gen activated protein kinase)의 重要性이 提 示되고 있다29,30). MAP kinase 신호전달계는 세포가 외부의 환경변화에 따른 자극들을 인지 하여 그 정보를 세포질 및 세포핵 내부로 전달 하는 과정에 관여하는 대표적인 신호전달계이 다. 특히, 세포의 成長, 발생, 분화, 사멸 등의 조절기전에 관여한다. 척추동물세포에 존재하 는 MAP kinase군에는 extracellulat signal- regulated kinase (ERK), stress-activated protein kinase (SAPK), P38 MAP kinase 등 이 있다. SAPK는 c-Jun N-terminal 부위를 Fig. 6 Extract of glycyrrhizae suppressed α
-MSH-induced transcriptional activation of AP-1 in B16 melanoma cells. Cells pre-incubated with or without extract of glycyrrhizae (50 μg/ml) and followed by addition of α-MSH (10 nM). Nuclear extract was incubated with a radiolabeled oligonucleotide probe containing AP-1 binding conses sites and AP-1 activation was measured by EMSA.
AP-1 probe G.C.
MSH
-
- - + +
+ - +
Free probe AP-1 probe G.C.
MSH
-
- - + +
+ - +
Free probe AP-1 probe G.C.
MSH
-
- - + +
+ - +
Free probe
인산화 시킬 수 있기 때문에 c-Jun N-terminal kinase (JNK)라고도 불리워지는 단백질인산화 효소로서, 여러 isoform들이 존재한다. SAPK/
JNK는 여러 스트레스성 자극에 의해 활성화된 다. 또한, 멜라닌 합성에 관한 많은 분자생물학 적 지식이 축적되어지면서, 멜라닌 合成시 AP-1과 같은 조기 반응 유전자(early imme- diate gene)와 많은 聯關이 있음이 알려졌다.
그러므로 이러한 인자들의 활성화 여부는 멜라 닌 合成의 硏究에 重要한 단서가 될 수 있을 것 이다.
甘草 抽出物이 멜라난 세포에 미치는 독성을 알아보기 위하여 細胞 生存率을 MTT assay로 조사한 결과 甘草 抽出物에 의한 멜라닌 세포 의 독성은 나타나지 않았으며, 형태학적인 변 화도 관찰되지 않아 실험에 이용한 농도의 甘 草 抽出物은 독성이 없는 것으로 확인되었다.
표피 멜라닌 세포의 수용체를 활성화하는 호르 몬을 통칭하여 melanotropin이라 하며 이 melanotropin 중 α-MSH와 그 합성 유도체가 척추동물 표피의 색소침착을 조절하는 것으로 알려져 있다. α-MSH가 멜라닌 세포에 존재하 고 있는 특이적 세포막 수용체와 결합하여 adenylate cyclase의 작용을 증가시킴으로서 tyrosinase가 활성화된다고 추정되고 있으며 catecholamine, D-α-tocopheryl succinate, retinoic acid, calcium 이온 길항제 등과 같은 여러 다른 호르몬이나 화합물질이 상호작용하 여 이러한 작용을 증진시키거나 억제시킨다고 한다. 甘草 抽出物의 단독처리시 tyrosinase promoter activity가 유의하게 감소하였다(Fig.
2). 저농도(1 μg/ml)의 甘草 抽出物의 처리에 의해서도 tyrosinase promoter activity가 통계 적으로 유의하게 감소하였다. 또한 멜라닌 합 성을 위해서 필요한 rate limiting step으로 잘 알려진 효소인 tyrosinase의 활성의 측정결과 α-MSH에 의한 tyrosinase 활성을 대조군 수 준으로 억제시켰으며(Fig. 3), α-MSH에 의한 멜라닌 합성의 최종산물인 멜라닌의 양의 증가 를 억제시켰다(Fig. 4). 멜라닌 세포에 KA (Kojic acid)와 PDA(Pentadecenoic acid)를 투
여한 Mishima31)의 보고에 의하면 KA를 2.5 μM 농도로 투여시 tyrosinase는 감소되었으 나 세포수의 감소는 보이지 않아 세포독성 (cytotoxicity)은 없었다고 하였으며 PDA를 투 여한 경우에도 비슷한 결과를 관찰하였다고 하 였다. 본 연구에서는 배양된 멜라닌 세포에 甘 草 抽出物를 5 mg/ml 농도로 투여시 세포수와 멜라닌 양의 현저한 감소를 보인 반면 甘草 抽 出物를 50 μg/ml 투여시 세포수의 감소는 거 의 없었으나 멜라닌 양은 현저히 감소한 결과 를 보였는데 이는 甘草 抽出物를 5 mg/ml로 투여시는 정상 멜라닌 세포에 甘草 抽出物이 세포독성을 야기시켰기 때문인 것으로 생각된 다. 본 연구 결과는 甘草 抽出物를 적절한 농도 로 피부에 도포시 색소형성을 억제 할 수 있으 나 甘草 抽出物를 과다한 농도로 도포시에는 세포독성을 초래할 가능성을 제시해 준다.
MAP kinase cascades는 세포의 증식, 분화 및 죽음을 포함한 여러 가지 細胞의 기능에 관 련되어져 있으며, MAP cascades는 cytoplas- min activites 뿐 아니라 gene expression의 조 절에 중요한 역할을 한다. 이들은 MAPK, MAPK activator(MEK, MKK, or MAPK kinases) 그리고 MEK activator(MEK kinase) 의 3가지 kinase로 구성되어져 있다. 특히 MAPK/ERK kinase (MEKK)를 과발현시키면, 멜라닌 細胞의 멜라닌화에 효과가 있었고, 강 력한 멜라닌화 유발물질인 α-MSH가 JNK를 활성화 시킨다는 사실과 멜라닌화의 강력한 Promoter로 알려진 phorbol-12-myristate-13- acetate(PMA)가 JNK1를 活性化 시킨다는 보 고는 이미 잘 알려진 있는 사실이다. 또한 대표 적인 멜라닌화 抑制材인 all-trans-retinoic acid (RA)는 JNK1의 活性化를 抑制시킴이 잘 알려져 있는 사실이다32). 이에 甘草 抽出物이 MAPK에 미치는 영향을 알아보기 위하여 JNK1의 활성의 측정결과 Fig. 5에서 보는 바 와 같이 α-MSH 단독처리시 활성화 되어지는 JNK1의 활성이 甘草 抽出物를 전 처리한 후 α-MSH를 처리시는 현저히 억제되어졌다. 더 욱이, 甘草 抽出物은 세포의 증식, 분화, 변형
과 같은 세포생리 조절에 연관되어 있는 AP-1 의 활성도 현저히 억제하였다.
이상의 결과로 甘草 추출물은 배양된 멜라닌 세포에서의 색소형성을 억제하는 작용이 있음 을 알 수 있었다. 특히 甘草 추출물을 적절한 농도로 인체 피부에 도포시에는 색소형성을 억 제할 수 있으나 과다한 농도로 도포시에는 부 작용을 초래할 가능성이 있으므로 이에 대한 인체 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결 론
α-MSH를 처리하거나 처리하지 않은 배양된 정상 멜라닌 세포에 甘草 추출물을 투여한 후 색소형성 억제 효과를 관찰하여 다음과 같은 결 과를 얻었다. 甘草 추출물은 1 mg/ml 처리 시 에도 자체 세포독성효과를 나타내지 않았으며, 멜라닌 세포에 甘草 추출물를 12시간 처리시 Tyrosinase promoter activity는 1 μg/ml (P<0.05) 이상부터 현저히 억제시켰다. 또한 甘 草 추출물은 α-MSH에 의한 Tyrosinase 활성 을 현저히 억제시켰다. 배양된 정상 멜라닌 세 포에 α-MSH를 처리시 대조군에 비해 유의하 게 증가하였으나 甘草 추출물를 전 처리 실험군 은 α-MSH 단독처리군에 비해 유의하게 감소 하였다. 甘草 추출물의 멜라닌 색소 형성의 억 제 기전을 살펴보기 위한 실험에서 α-MSH에 의한 JNK1의 활성를 억제시켰으며, α-MSH에 의한 AP-1의 활성를 뚜렷하게 억제시켰다. 이 상의 결과로 甘草 추출물은 α-MSH에 의한 멜 라닌 세포의 멜라닌 색소형성을 억제하는 작용 이 있으며 그 기전은 전사활성인자인 AP-1의 활성의 억제를 경유한 JNK1의 활성의 억제라 는 것을 알 수 있었다.
참고문헌
1. 鄭遇悅, 韓方病理學, 全州, 三進社, pp. 5-17, 94-95, 1988.
2. 宋驚永, 中國病因病理學, 北京, 人民衛生出
版社, pp. 62-67, 1987.
3. Burnett, J.B., Seiler, H., Brown, J.C.
Separation and characterization of multiple forms of tyrosinase from mouse melanoma. Cancer Res 27:880-889, 1967.
4. Hearing, V.J., Nicholson, J.M., Montague, P.M., et al. Mammalian tyrosinase:
Structural and functional interrelation- ship of isozyme. Biochimica et Biophy- sica Acta 522:327-339, 1978.
5. Jimbow, M., Kanoh, H., Jimbow, K.
Characterization of biochemical proper- ties of melanosomes for structual and functional differentiation: Analysis of the compositions of lipids and proteins in melanosomes and their subfractions. J.
Invest. Dermatol. 79:97-102, 1982.
6. Prota, G. Recent advances in the chemistry of melanogenesis in mammals.
J. Invest. Dermal. 75:122-126, 1980.
7. Sober, A.J. Fitzpatrick, T.B. Pathophy- siology of melanin pigmentation in man.
Prog Chem Org Natural Products.
31:521-582, 1974.
8. Swan, G.A. Structure, chemistry, and biosynthesis of the melanin. Prog Chem Org Natural Products 31:521-582, 1974.
9. Xia, Z., Dickens, M., Rainge, J., Davis, R.
J., and Greenberg, M. E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science 270(5240) :1326-1331, 1995.
10. Karin, M. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases: J.
Biol. Chem. 270(28):16483-16486, 1995.
11. Kyriakis, J. M., and Avruch, J. Sounding the alarm kinas cascades acti-vated by stress and inflammation: J. Biol. Chem.
271(40):24313-243168. 1996.
12. Powis, G. Anticancer drugs acting agai- nst signaling pathways: Curr. Opin. On-
col 7(6):554-559, 1995.
13. Englaro, W., Bertolotto, C., Busca, R., Brunet, A., Pages, G., Ortonne, J.P., Ballotti, R. Inhibition of the mitogen- activated protein kinase pathway trig- gers B16 melanoma cell differentiation.
J Biol Chem 273(16):9966-9970, 1998.
14. Mietus-Snyder, M., Glass, C.K., Pitas, R.E. Transcriptional activation of scaven- ger receptor expression in human smooth muscle cells requires AP-1/c-Jun and C/EBPbeta: both AP-1 binding and JNK activation are induced by phorbol esters and oxidative stress Arterioscler Thromb.
Vasc. Biol.18(9):1440-1449, 1998.
15. 楊醫業, 中醫學問答(上冊), 北京, 人民衛生 出版社, p 543, 1985.
16. 李時珍, 本草綱目(上冊), 北京, 人民衛生出 版社, pp 691-695, 1982.
17. 王浴生, 重藥藥理與應用, 北京, 人民衛生出 版社, pp 264-277, 1983.
18. 金昌謙, 本草從新, 서울, 杏林出版, pp 6-7, 1989.
19. 許 俊, 東醫寶鑑, 서울, 南山堂, p 720, 1987.
20. Martinez-Esparza, M., Jimenz-Cervan- tes, C., Solano, F., Lozano, J.A., Garcia- Borron, J.C., Mechanisms of melano- genesis inhibition by tumor necrosis factor-alpha in B16/F10 mouse melano- ma cells. Eur. J. Biochem. 255(1):139- 146, 1998.
21. Hosoi, J., Abe, E., Suda, T., Kuroki, T., Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1α,25-dihy- droxy-vitamin D3 and retinoic acid.
Cancer Res. 45:1474-1478, 1985.
22. Jeong, J.Y., Jue, D.M., Chloroquine inhibits processing of tumor necrosis factor in lipopolysaccharide stimulated RAW 264.7 macrophages. J. immuol
158:4901-4907, 1997.
23. 江蘇新醫學院編, 中醫大辭典, 上海, 上海科 學技術出版社, pp 2468-2470, pp 567-573, 1977.
24. 楊小楓, 徐樂天, 뇌공등의 면역억제작용 및 이식면역에서의 응용, 한글판 증서의 결합, 6월호, 서울, pp 78-85, 1993.
25. Noriko, S. Masashi, T. et al, A novel neutral polysaccharide having activity on the reticuloendothelial system from the root of glycyrrhiza uralensis. Chem.
Pharm. Bull 38(11):3069-3071, 1990.
26. Noriko, S., Masachi, T. et al, Characte- rization of a polysaccharide having acti- vity on the Reticuloendothelial system from the stolen of glycyrrhiza glabra var.
glandulifera.
Chem. Pharm. Bull 38(8):2082-2086, 1991.
27. Noriko, S., Masahi, Y. et al, Characte- rization of Tow polysaccharides having activity on the reticuloendothelial sys- tem from the root of glycyrrhiza uralen- sis. Chem. Pharm. Bull 38(6):1667-1671, 1990.
28. 이선동, 백반증(白斑症)의 한방치료, 서울, 圖書出版 鼎談, p 21, 1996.
29. Englaro W, Rezzonico R, Durand-Cle- ment M, Lallemand D, Ortonne JP, Ballotti R. Mitogen-activated protein kinase pathway and AP-1 are activated during cAMP-induced melanogenesis in B-16 melanoma cells. J Biol Chem.
270(41): 24315-24320, 1995.
30. Imokawa G, Yada Y, Kimura M., Signalling mechanisms of endothelin- induced mitogenesis and melanogenesis in human melanocytes. : Biochem J 314(Pt 1):305-312, 1996.
31. Mishima Y. A post melanosomal era:
Control of melanogenesis and melanoma
growth. Pigment Cell Res(suppl.2):3-16, 1992.
32. Lee, H.Y., Sueoka, N., Hong, W.K., Mangelsdorf, D.J., Claret, F.X., Kurie,
J.M., All-trans-retinoic acid inhibits Jun N-terminal kinase by increasing dual- specificity phosphatase activity. Mol Cell Biol 19(3):1973-80, 1999.
